שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן
במאמר זה
סיכום
תקציר
עמיד בפני סמים-שחפת (DR-TB) הוא איום בריאות הציבור הולך וגדל, והערכה של רמות תרופות טיפוליות אולי הטבות קליניות חשוב. רמות התרופה פלזמה הם הערכה התקן הזהב הנוכחי, אבל דורשים כריתת-פלבוטומיה ושרשרת קרה, וללכוד רק לאחרונה הדבקות. השיטה שלנו משתמשת שיער, מטריצה כי הוא נאסף בקלות רפלקטיבית של הדבקות לטווח ארוך, כדי לבדוק 11 נגד שחפת תרופות. העבודה הקודמת של הקבוצה שלנו מראה כי רמות התרופה תרופתי בשיער קשורים לתוצאות HIV. השיטה שלנו לתרופות DR-TB משתמשת 2 מ"ג של שיער (3 ס מ האבותיים לשורש), אשר מרוסק ומופק ב מתנול. דגימות מנותח עם שיטת LC-MS/MS יחידה, כימות 11 תרופות ב 16 דקות לרוץ. המגבלות הנמוכות יותר של כימות (יוסה) עבור 11 התרופות נעות בין 0.01 ng/mg ל-1 ng/mg. נוכחות התרופה מאושרת על ידי השוואת היחס בין שני מעברים בעלי ספקטרומטר מסה. דגימות הן כימות באמצעות יחס האזור של התרופה הדאובטים, 15N-, או 13C התווית איזוטופולוג התרופה. השתמשנו עקומת כיול החל מ-0.001-100 ng/mg. יישום השיטה למדגם נוחות של דגימות שיער שנאספו מחולים DR-TB על טיפול ישירות נצפתה (DOT) המצוין רמות הסמים בשיער בתוך טווח דינמי ליניארי של תשעה התרופות 11 (isoniazid,, מlevofloxacin, מmoxifloxacin, קלופצין. בדקווינין, פרטואיד (מחלקה) החולה לא היה על prothionamide, ואת רמות נמדד עבור ethionamide היו קרובים ל-יוסה שלה (עם עבודה נוספת במקום לבחון את ההתאמה של המטאווליט של ethionamide לניטור החשיפה). לסיכום, אנו מתארים את ההתפתחות של פאנל רב תכליתי עבור תרופות DR-TB בשיער כטכניקה עבור ניטור התרופה הטיפולית במהלך טיפול עמיד בפני תרופות נגד שחפת.
מבוא
במאה העשרים ואחת, עמיד בפני תרופות tb (ד ר-TB) הוא אסון מתפתח עבור תוכניות שליטה הלאומי חלש כבר שחפת, עם המקרים אישר הכפלת בעבר 5 שנים בלבד, חשבונאות כמעט שליש ממקרי המוות הקשורים להתנגדות מיקרוביאלית גלובלית1,2. הטיפול המוצלח של DR-TB נדרש בדרך הנדרשת יותר ויותר רעיל קו השני משטרי מאשר טיפול עבור התרופה רגיש TB. יתר על כן, חולים עם DR-TB לעתים קרובות יש אתגרים משמעותיים מראש קיימים לדבקות, אשר תרמו הופעתה של התנגדות בתחילה3.
בניגוד לזיהום HIV שבו נטען ויראלי ניתן להשתמש כדי לפקח על הטיפול, נקודות קצה פונדקאית של תגובת הטיפול בשחפת מתעכב ולא אמין על רמה הפרט<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המטופלים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב לפני איסוף דגימת שיער. הצלחנו לקבל אישור מוסדי מועצת המנהלים מאוניברסיטת קייפטאון ואוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.
1. דגימת שיער
- קבל הסכמה מושכלת בכתב.
- השימוש מספריים נקיים לחתוך כ 20-30 קווצות שיער הקרקפת מהאזור העורף קרוב לקרקפת ככל האפשר.
- הציבו את הקלטת סביב הצד המרוחק. של השיער כדי להצביע על כיווניות מקפלים דגימת שיער לתוך כיכר רדיד אלומיניום ולאחסן בטמפרטורת החדר. סמן את הקצה המרוחק של השיער כדי למנוע זיהום אפשרי מטיפול נוסף של הקצה האבובי.
- בנוסף דגימות החולה, לאסוף "שיער ריק": דגימת שיער הקרקפת ממישהו שלא לקח תרופות נגד שחפת. לאסוף כמות גדולה (> 30 mg שיער ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור של כרומוטוגרמה עם רמות מאושרות של כל 11 התרופות DR-TB מוצג באיור 1. זמן השמירה עבור כל אנליטה יכול להשתנות בעת שימוש בכלים ובעמודות שונים, כך שזמן השמירה המדויק ייקבע בנפרד.
מחולץ יון כרומטוגרמות (EICs) עבור תרופה אחת מסוימת (isoniazid, INH) באחד הכפויי (דגימת שיער ריקה עם סטנדרטים DR-TB התייחסות התרופות) מוצגים באיור 2. מעברים בין כימות ומזהים משמשים לאישור איכותי של התרופה, כאשר היחס בין שטח הכמת לבין אזור המזהה נשאר קבוע על פנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מדווחים כאן פרוטוקול עבור השיטה שפיתחנו ואומת עבור כימות 11 נגד שחפת תרופות מנוצל בטיפול של DR-TB דגימות שיער קטנות באמצעות LC-MS/MS. אין שיטה אחרת עבור כימות אלה 11 תרופות בשיער פותחה בעבר, מאומת ופורסם. השיטה שלנו יכולה לכמת תת-ננו רמות של תרופות רק 20-30 קווצות שיער של כ 3 סנטימטרים (cm) אורך (~ 2 מ"ג) ו כבר אומת22. המשקל הנמוך של השיער שנותחו משמעו שהחולים המעורבים במחקר יכולים להשתתף בדיסקרטיות ולחזור לבדיקה חוזרת ללא חשש מחשיפת קרקפת קירחת. בעבר פרסמנו נתונים על הקשר בין רמות התרופות של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות RO1 AI123024 (Co-פיס: ג'ון מטסואפה ומוניקה גנדי).
תודות
המחברים רוצים להודות לפרופסור Keertan Dheda, ד ר עלי Esmail, ו מאריטג'יאה פרטוריוס באוניברסיטת קייפ טאון המכון לריאות שהקל על אוסף דגימות שיער למחקר. המחברים מכירים בהכרת העבודה את התרומות של המשתתפים במחקר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בקבוקי הזרקה של 2 מ"ל | אג'ילנט טכנולוגיות | 5182-0716 | |
| מבחני הזרקה בנפח 250 אלו"ר | אג'ילנט טכנולוגיות | 5181-8872 | |
| קרע חרוזים 24 | OMNI אינטרנשיונל | 19001 | |
| צינורות קרע חרוזים (ערכת חרוזים בנפח 2 מ"ל, קרמיקה 2.8 מ"מ, מיקרוצינורות בגודל 2 מ"ל) | OMNI אינטרנשיונל | 19628 | |
| בדאקווילין | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | B119550 | |
| בדקווילין-d6 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | B119552 | |
| קלופזימין | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | C324300 | |
| קלופזימין-d7 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | C324302 | |
| צינורות גידול זכוכית סיד חד-פעמיים | VWR | 60825-425 | |
| אתמבוטול | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | E889800 | |
| את'מבוטול-d4 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | E889802 | |
| אתיונאמיד | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | E890420 | |
| אתיונאמיד-d5 | קלירסינת' | CS-O-06597 | |
| חומצה פורמית | סיגמא-אלדריץ' | F0507-100mL | |
| בקבוקי זכוכית | קורנינג | 1395-1L | |
| הוט שייקר | בלקו גלאס בע"מ | 7746-32110 | |
| HPLC | אג'ילנט טכנולוגיות | אינסוף 1260 | |
| אצטוניטריל בדרגת HPLC | הוניוול | 015-4 | |
| מתנול בדרגת HPLC | הוניוול | 230-1L | |
| מים בדרגת HPLC | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| איזוניאזיד | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | I821450 | |
| איזוניאזיד-d4 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | I821452 | |
| עמודת LC, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 מ"מ | פנומנקס | 00D-4371-B0 | |
| מחסנית מגן LC | פנומנקס | AJ0-8788 | |
| מחזיק תחמושת מגן LC | פנומנקס | AJ0-9000 | |
| תוכנת כימות LC-MS/MS | Sciex | רב-כמותי 2.1 | |
| לבופלוקסאצין | סיגמא-אלדריץ' | 1362103-200MG | |
| לבופלוקסאצין-d8 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | L360002 | |
| לינזוליד | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | L466500 | |
| לינזוליד-d3 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | L466502 | |
| צינורות מיקרו צנטריפוגה | E& K Scientific | 695554 | |
| מוקסיפלוקסאצין | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | M745000 | |
| מוקסיפלוקסצין-13C, d3 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | טריפל קוואד 5500 | |
| OPC 14714 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | O667600 | |
| פרטומניד (PA-824) | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | P122500 | |
| פרותיונמיד | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | P839100 | |
| פרותיונאמיד-d5 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | P839102 | |
| פיראזינמיד | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | P840600 | |
| פיראזינמיד-15N, d3 | טורונטו ריסרץ' כימיקלים | P840602 | |
| פקקי מחיצה לבקבוקי הזרקה | אג'ילנט טכנולוגיות | 5185-5862 | |
| אידוי Turbovap LV | ביוטאג' | 103198/11 |
מקורות
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Pre....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
