הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60873

⸱

19 במאי 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הבדיקה האופסונו-דבקות היא שיטה חלופית למבצע ההרג האופוסונו-פאגוציטי כדי להעריך את הפונקציות האופסיוניות של נוגדנים בפיתוח חיסונים.

תקציר

מבחני דבקות האופסונו הוא בדיקה פונקציונלית המונים את ההחזקה של פתוגנים חיידקיים לפגוציטים מקצועיים. מכיוון שדבקות היא דרישה לפגוציטוזיס והרג, ההאשמה היא שיטה חלופית למבצעי הרג אופסונו-פגוציטיים. היתרון של בדיקת דבקות באופסונו הוא האפשרות להשתמש בפתוגנים מומתים ובקווי תאים של יונקים, המאפשרים סטנדרטיזציה על פני ניסויים מרובים. השימוש בפתוגן מושבת ב assay גם מקל על העבודה עם סוכנים זיהומיות ברמה biosafety 3 ופתוגנים ארסיים אחרים. בעבודתנו, נעשה שימוש ב-opsono-adherence assay כדי להעריך את היכולת התפקודית של נוגדנים, החל מ-sera של בעלי חיים מחוסנים עם חיסון מבוסס קפסולה אנתרקס, כדי לגרום לדבקות באצילוס אנתרקיס קבוע לקו תא מקרופאג עכבר, RAW 264.7. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית שימשה ללכידת תמונות של bacilli דבק מקרופאגים. דבקות מוגברת הייתה בקורלציה עם נוכחות של נוגדנים נגד כמוסות בסרום. יונקים לא אנושיים שהפגינו ריכוזי נוגדנים גבוהים נגד קפסולה בסרום היו מוגנים מפני אתגר אנתרקס. לפיכך, ניתן להשתמש בפקודת האופסונו-דבקות כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בסרה, להעריך את יעילותם של מועמדים לחיסון וטיפולים אחרים, ולשמש כמתאם אפשרי של חסינות.

מבוא

הכרה, דבקות, הפנמה והשפלה של פתוגן הם חלק בלתי נפרד phagocytosis1, מסלול בולט בתגובה החיסונית המולדת המארחת שתוארה לראשונה על ידי איליה מצ'ניקוף בשנת 18832,3. לויקוציטים Phagocytic, כמו גם תאים אחרים של המערכת החיסונית, הם מפלים מאוד בבחירת המטרות שלהם; הם מסוגלים להבחין בין "זיהומיות לא עצמי" ו "עצמי לא זיהומיות" באמצעות דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן על ידי הרפרטואר שלהם של קולטני זיהוי דפוס (PRRs)4,5. זיהוי מארח של פתוגן עלול להתרחש גם עם כריכה של opsonins המארח, כגון משלימים ונוגדנים6. תהליך זה, הנקרא opsonization, מצופה את הפתוגן עם מולקולות אלה, שיפור הפנמה על מחייב קולטנים opsonic (למשל, משלימים קולטני Fc) על תאים phagocytic6. עבור פתוגן לדבוק phagocyte, כריכה קולקטיבית של קולטנים מרובים עם ליגנדים קוגנט שלהם יש צורך. רק אז יכול ההדק דבקות ולקיים מדורגים איתות בתוך התא המארח ליזום הפנמה6.

בשל החשיבות של phagocytosis בסיווג של פתוגנים ומניעת זיהום, פתוגנים חוץ תאיים פיתחו דרכים רבות לחתור תחת תהליך זה כדי להאריך את הישרדותם. אסטרטגיה אחת בעלת חשיבות היא ייצור כמוסה פולימרית אניונית (למשל, פוליסכריד או חומצת פוליאמינו) שהיא אנטי-פגוציטית מתוקף המטען שלה, היא אימונוגנית גרועה, ומגינה על מולקולות על מעטפת החיידקים מ PRRs6,7. פתוגנים כגון Cryptococcus neoformans ו דלקת ריאות סטרפטוקוקוס יש כמוסות המורכבות פולימרים סכריד, ואילו אפידרמידים סטפילוקוקוס וכמה מינים Bacillus לייצר חומצה פולי-ɣ גלוטמית (PGGA)7,8. עם זאת, פתוגנים אחרים מייצרים כמוסות הדומות לעצמי הלא מדבק. לדוגמה, pyogenes סטרפטוקוקוס זן פתוגניים של B. cereus יש כמוסה חומצה היאלורונית כי הוא לא רק אנטי phagocytic אבל אשר גם לא יכול להיות מוכר זר על ידי המערכת החיסונית9,10.

הטיה של כמוסה לחלבוני נשא ממירה אותם מאנטיגנים עניים ובלתי תלויים T לאנטיגנים תלויי T אימונוגניים ביותר שיכולים לגרום לתיבת נוגדנים גבוהה נגד כמוסות בסרום11,12. אסטרטגיה זו משמשת לחיסונים מורשים נגד S. דלקת ריאות, שפעת ההמופילוס, ו Neisseria מנינגיטידים11. הפעילויות האופסיוניות של נוגדנים נגד קפסולה הוערכו בדרך כלל על ידי מבחני הרג opsono-phagocytic (OPKA)13,14,15,16. מבחנים אלה בודקים אם נוגדנים תפקודיים יכולים לגרום לפגוציטוזיס ולהרוג14. עם זאת, השימוש OPKA עם פתוגנים זיהומיות, כגון רובד 1 ביולוגי בחר סוכנים ורעלים (BSAT), כולל B. anthracis17, הוא מסוכן ומציג סיכוני אבטחה; מבחנים אלה מחייבים טיפול נרחב בסוכן נבחר. טיפול בסוכן נבחר יכול להיעשות רק במעבדות מוגבלות ברמת 3 (BSL-3); העבודה באזורים אלה דורשת נהלי הפעלה ממושכים בשל אמצעי הבטיחות והאבטחה הרבים שיש לנקוט. מעבדות BSL-3 גם בדרך כלל אינן מצוידות בציוד מיוחד המשמש לעבודת OPKA, כגון מיקרוסקופים וציטומטרים. לכן, פיתחנו מבחנים חלופיים המבוססים על שימוש בחיידקים מומתים18,19. אנו מתייחסים לזה כאל מבחני דבקות באופסונו (OAA) שאינו תלוי בהפנמה והרג כתפוקות מבחנים; במקום זאת, הדבקות של פתוגנים מומתים opsonized משמש כאינדקס של phagocytosis. מבחינה מכנית, OAA הוא תחליף מתאים כי הדבקות מתרחשת פריורי והוא שזורה באופן אינטימי עם הפנמה והרג תאי. מנקודת מבט של biosafety, OAA הוא המועדף כי זה דורש טיפול מינימלי של סוכן זיהומיות, הוא ניסיוני של משך זמן קצר יותר מאשר OPKA, והוא יכול להתבצע במעבדות BSL-2 לאחר מלאי של פתוגן מושבת הופק והועבר.

אנו מדגימים את הניצול של OAA כדי לבחון את הפונקציה האופסיונית של נוגדנים נגד קפסולה שנמצאו בשרה של פרימטים לא אנושיים (NHPs) שחוסנו עם מצומד קפסולה [כלומר PGGA מ- B. anthracis הקשורים לתסביך חלבון הקרום החיצוני (OMPC) של מנינגיטידים Neisseria]20. bacilli opsonized סרום היו דגירה עם קו תא מקרופאג עכבר חסידים, RAW 264.7. לאחר הקיבעון, המונוליילר של התא ובצילי החסיד צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבקות החיידקית גדלה כאשר bacilli היו דגירה עם סרום מ NHPs מחוסנים עם הקפסולה להצעיר לעומת סרום שליטה20. דבקות בקורלציה עם הישרדות אתגר האנתרקס20,21. לכן, השימוש ב- OAA אפיין את הפונקציה של נוגדנים נגד קפסולה והקלה מאוד על בדיקות של מועמד החיסון שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בהתאם לחוק צער בעלי חיים, מדיניות שירות בריאות הציבור, וחוקים ותקנות פדרליים אחרים הנוגעים לבעלי חיים וניסויים בבעלי חיים, המחקר המתואר כאן נערך תחת פרוטוקול מוסדי שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש. המתקן שבו נערך מחקר זה מוכר על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, בינלאומי ודבק בעקרונות המפורטים במדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה, המועצה הלאומית למחקר, 201124.

1. תרבות ותחזוקה של קו התאים, RAW 264.7

הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בטכניקות אספטיות.

  1. מחממים סרום שור עוברי (FBS) באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית את המשלים.
    הערה: זמן ההשבתה של 30 דקות מתחיל כאשר FBS מגיע 56 °C (69 °F). כדי לפקח על הטמפרטורה, לחמם נפח דומה של מים ב באותו אמבט מים. ברגע שהמים מגיעים 56 מעלות צלזיוס, להתחיל את הספירה לאחור 30 דקות עבור FBS. לחלופין, FBS שהומתק מחום זמין גם הוא מסחרית.
  2. הכן בינוני לתאי RAW 264.7 על-ידי שילוב של 90% DMEM עם גלוקוז גבוה ו- FBS (v/v) עם 10% חום מומת. מוסיפים את ל-גלוטמין לריכוז סופי של 6 מ"מ.
    הערה: DMEM עם גלוקוז גבוה מנוסח עם 4 מ"מ ל-גלוטמין. שכשהם L-גלוטמין ל 6 mM מקדם צמיחת תאים עקבית. 100 U / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ניתן להוסיף כדי למנוע זיהום. קו תא מורין נפוץ נוסף, J774A.1, עשוי לשמש גם הוא והוא גדל בתנאים דומים.
  3. להפשיר בקבוקון קפוא של תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהסיר מהאמבטיה ברגע שהוא נמס. מוסיפים את התוכן באופן אפטי ל-5 מ"ל מדיום שלם בצינור חרוט. הפוך צינור חרוט פעמיים להסתובב ב 300 x g במשך 5 דקות לתאי גלולה.
  4. לשאוף מדיום באמצעות צינור פסטר סטרילי מחובר ואקום כדי להסיר סוכן הקפאה. גלולה תא resuspend ב 5 מ"ל של מדיום טרי.
  5. העברת השעיה לתרבות רקמות שטופלה בבקבוקון או בצלחת. מוסיפים מספיק מדיום כדי לכסות לחלוטין את החלק התחתון של הבקבוק ומסתחררים כדי להפיץ תאים באופן שווה. ציין מספר מעבר המתחיל ב- "1".
  6. דגירה תאים ב 37 °C (67 °F) בנוכחות 5% CO2 ולחות עד 95% עד 100% confluency הוא הגיע. בדוק תאים מדי יום תחת המיקרוסקופ החל מהיום השני של הדגירה. אל תאפשר לתאים להגיע >100% confluency כמו זה יגרום לתאים להרים ולמות.
    הערה: הזמן הדרוש כדי להגיע מפגש תלוי כמה תאים חיים היו מצופים ואת אזור הצמיחה של הבקבוק. לכן, זה נבון לבדוק את התאים מדי יום.
  7. תאי תת-תרבות על ידי גירוד ודילול מלאי התאים במדיום טרי ומאפשרים לפחות יומיים של צמיחה בין שריטות. הגדל את מספר המעבר ב- 1 עם כל תת-תרבות.
    הערה: גירוד מיידי חולף ומיידי למחרת יגרום לאובדן מהיר יותר של דבקות כללית בתאים לאורך זמן. RAW 264.7 תאים יש להשתמש רק עד קטע כ 15.
  8. כדי לפשוט RAW 264.7 תאים עבור Assay OAA, להחליף עם מדיום טרי ולהשתמש מגרד תאים בעדינות לגרד תאים את הבקבוק. פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את גושי התאים לספירת תאים קלה יותר.
    הערה: השיטה המסורתית לתתת-תתי-תתי-ת-ת-קרקעי RAW 264.7 היא על-ידי גירוד. מניסיוננו, השימוש טריפסין גורם RAW 264.7 תאים לאבד דבקות לאורך זמן מהר יותר מאשר עם גירוד.
  9. כדי לספור תאים, לדלל כמויות שוות של תאים פתרון כחול trypan. טען 10 μL על המוציטרומטר. שים לב וספור את מספר התאים החיים שאינם כוללים את הצבע באמצעות מיקרוסקופ מורכב הפוך עם עדשה אובייקטיבית 10x.
  10. צלחת 1.4 x 104 תאים קיימא לבאר ב 96 גם 0.15 מיקרומטר עבה זכוכית שטוחה צלחת תחתונה (צלחת #1). אפשר לתאים לגדול במשך 3 ימים. החלף את המדיום שהוצא יום אחד לפני ביצוע OAA.
    הערה: לאחר 3 ימים של דגירה, מספר התאים צריך להיות כ 5 x 104/well.

2. תרבות ותכשירים חיידקיים

הערה: מיני החיידקים המשמשים בפרוטוקול זה הוא זן ארסי עטוף, B. אנתרקיס איימס. כל המניפולציות עם מין זה דורשות בטיחות ביולוגית וסיווגים ביטחוניים מתאימים ויש לבצען בארון בטיחות ביולוגי מסוג 2 או Class III הממוקם במעבדת BSL-3. בצע נהלי הפעלה מוסדיים לעבודה BSL-3 ולשימוש בציוד מגן אישי בעת טיפול בחיידקים.

  1. הכן את מרק עירוי לב המוח (BHI) על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ב 1 L מים autoclaving ב 121 °C (70 °F) במשך 15 דקות. יש לאחסן מרק בטמפרטורת הסביבה.
  2. הכן 8% פתרון סודיום ביקרבונט במים לעקר באמצעות מזרק מסנן 0.20 מיקרומטר. יש לאחסן את הפתרון ב-4°C ולהשתמש בו תוך יום אחד.
  3. מערבבים 8 גר' מרק מים מזינים, 3 גר' תמצית שמרים ו-15 גרם אגר ב-1 ליטר מים להכנת צלחות אגר NBY. אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. יוצקים לתוך צלחות פטרי ולאפשר להתמצק. יש לאחסן צלחות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: צלחות אגר NBY עשוי להתבצע עם או בלי סודיום ביקרבונט. התוספת של סודיום ביקרבונט לצלחות מרק ואגר גורם לצמיחה של מושבות ריר המורכב bacilli encapsulated. הריכוז הסופי של סודיום ביקרבונט הן במדיה נוזלית והן במדיה מוצקה הוא 0.8%.
  4. הכן מרק תרבות עבור B. anthracis על ידי ערבוב 50% מרק BHI autoclaved, 40% FBS ו 10% פתרון סודיום ביקרבונט (v / v).
    הערה: מרק זה מנוסח כדי לייצר שרשראות קצרות של bacilli עטוף.
  5. הכינו צלחת מאסטר של B. anthracis על ידי פסים אותו לבידוד על צלחת אגר NBY ממלאי נבג יום אחד לפני culturing במרק. דגירה ב 37 °C (69 °F).
  6. לחסן 30 מ"ל של מרק תרבות בבקבוק מאוורר 250 מ"ל עם מספר מושבות של B. anthracis.
    הערה: יש צורך ביחס ספציפי של נפח לפני השטח של המרק, כפי שצוין כאן, כדי לייצר bacilli עטוף באופן מקסימלי.
  7. לנער את תרבות המרק ב 125 סל"ד, 37 °C (60 °F) עם 20% CO2 ולחות עבור 18-24 שעות.
    הערה: גידול B. אנתרקיס בטמפרטורות העולות על 37 מעלות צלזיוס עלול לעכב את ייצור הקפסולות.
  8. השתמש בכתמים שליליים עם דיו הודו כדי להבטיח אנקפסולציה מספקת וכי bacilli נמצאים בשרשראות קצרות (1-5 bacilli / שרשרת) לפני הקיבעון (ראה סעיף 3).
  9. כדי לקבוע יחידות יוצרות מושבה (CFU), לדלל באופן סדרתי 100 μL של תרבות 1:10 בתמיסת מלח אגירה פוספט (PBS) ודילול תרבות צלחת על צלחות אגר דם כבשים. דגירה עבור 12-18 שעות ב 37 °C (69 °F). לספור CFUs ולקבוע את מספר החיידקים לכל מ"ל של תרבות.
    הערה: הספירה יכולה להתבצע גם באמצעות המוציטרומטר מתחת למיקרוסקופ לאחר שהחיידקים תוקנו. עם זאת, זה לא מומלץ כי bacilli קשה לראות תחת הגדלה נמוכה.
  10. הוסף 16% paraformaldehyde (PF) לכל נפח של תרבות חיידקים בריכוז סופי של 4% PF כדי לתקן את bacilli. לאט לאט להתסיס על שייקר בטמפרטורת הסביבה במשך 7 ימים.
    הערה: שבעה ימים של דגירה ב 4% PF מבוסס על הליך ההפעלה הסטנדרטי המוסדי USAMRIID לתיקון bacilli צמחי.
  11. כדי להסיר את הקיבעון ולבדוק עקרות, לשטוף שלוש פעמים 4 מ"ל (10% נפח) של השעיית חיידקים קבועה בצינור חרוט 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב ≥3000 x g במשך 45 דקות ושימוש 30 מ"ל / לשטוף עם PBS. אחסן את הדגימה הנותרת ב- 4% PF ב- 4 °C (69 °F).
    הערה: לאחר pelleting, גלולה חיידקי הוא רך בשל נוכחות של כמוסה. יש להקפיד לא להפריע לכדור במהלך הכביסה. יש צורך להסיר את כל התיקון, כך שזה לא מפריע לבדיקת הכדאיות. במידת הצורך, להגדיל את מספר שטיפות.
  12. לבדיקת כדאיות, יש לחסן 40 מ"ל של מדיום צמיחה חיידקי (למשל מרק BHI) עם 4 מ"ל של השעיה שטופה (≤ 10% מנפח המרק) ולהדגיר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. בדוק צפיפות אופטית ב 600 ננומטר לפני ואחרי 7 ימים כדי למדוד עכירות.
  13. לאחר 7 ימים של דגירה בתרבות המרק, צלחת ≥ 100 μL של מרק על צלחת אגר דגירה עוד 7 ימים. אם לא נראה גידול בעכירות וללא צמיחה בצלחות, התרבות המקורית נחשבת סטרילית ועשויה להיות מועברת למעבדת BSL-2.
    הערה: תוכנית סוכן הבחירההפדרלית 22 מנדטים כי מומת B. anthracis ניתן להעביר רק ממעבדות BSL-3 לאחר הפגנת סטריליות מלאה של המדגם. בדיקות הכדאיות עבור מומת B. anthracis מורכב culturing 10% של המדגם במרק במשך 7 ימים ואחריו culturing על מדיום מוצק עוד 7 ימים22,23. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות לקבלת אישור העברה לאחר שנקבעה עקרות.

3. כתמים שליליים ומיקרוסקופיה קלה להתבונן בשרשראות אנקפסולציה ובצילי

  1. מערבבים 5 μL השעיה חיידקית עם 2 μL של דיו הודו על שקופית מיקרוסקופ. מניחים 1 או 1.5 מיקרומטר עבה כיסוי זכוכית על גבי המתלה מבלי ליצור בועות.
    הערה: ניתן להשתמש בלק כדי לאטום את זכוכית הכיסוי על המגלשה.
  2. שים לב להשעיה החיידקית באמצעות עדשה אובייקטיבית של שמן 40x עד 100x במיקרוסקופ קל. ודא כי bacilli הם עטופים על ידי התבוננות באזור של אישור (הקפסולה אינה כוללת דיו הודו) המקיף כל חיידק וכי שרשראות bacilli קצרים.

4. תיוג FITC של חיידקים

  1. להמיס פלואורסצנטין isothiocyanate (FITC) ב דימתיל סולפוקסיד בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל.
  2. למדוד את הנפח של מלאי חיידקים מושבתים.
  3. לשטוף את המניה 3x ב PBS כדי להסיר קיבוע.
  4. הוסף פתרון FITC בריכוז סופי של 75 מיקרוגרם / מ"ל. לאט להתסיס תערובת במשך 18-24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. שלוש פעמים לשטוף את החיידקים על ידי pelleting ב ≥3000 x g, 45 דקות באמצעות 30 מ"ל PBS / לשטוף כדי להסיר FITC עודף. ודא כי גלולה רך לא מופרע במהלך הכביסה. התחדש bacilli ב PBS באותו נפח התחלה.
  6. Aliquot ולאחסן bacilli ב microtubes ב -20 מעלות צלזיוס עד השימוש. אין להקפיא/להפשיר bacilli מספר פעמים כמו bacilli עלול לאבד כמוסה.

5. אופסוניזציה חיידקית

  1. חום להשבית נפח קטן של sera הבדיקה (מ NHPs) ב 56 °C (69 °F) במשך 30 דקות בבלוק חום.
  2. להפשיר ולשטוף חיידקים עם תווית FITC עם PBS 2x על ידי pelleting ב 15000 x g במשך 3-5 דקות. ההשבה מחדש ב- PBS באותו אמצעי אחסון להתחלה.
  3. בצלחת תחתונה עגולה היטב 96 (צלחת #2), לדלל באופן סדרתי מבחן sera בתא בינוני. בעוד 96 צלחת תחתונה עגולה היטב (צלחת #3), להוסיף 10 μL של סרה מבחן מדולל לתוך כל באר.
    הערה: בכל צלחת, PBS ו sera קוף נורמלי נכללו במקום sera בדיקה מדולל כמו פקדים שליליים. בחרנו גם בסרום בדיקה אחד כפקד חיובי כדי ליצור עקומה סטנדרטית כדי לנרמל את כל הבדיקות שנעשו בימים שונים. סרום בדיקת הבקרה החיובית נבחר באופן שרירותי מכיוון שהוא היה בשפע.
  4. כדי צלחת #3, להוסיף 10 μL טרי מחדש ארנב תינוק משלים.
    הערה: לאחר מחדש, להשליך ארנב התינוק הנותר משלים; אל תפשירו ותפשירו.
  5. כדי צלחת #3, להוסיף את הנפח המתאים של BACILLI שכותרתו FITC עבור ריבוי של זיהום של 1:20. לדוגמה, הוסף את אמצעי האחסון המכיל 5 x 104 x 20 bacilli עבור 5 x 104 תאים. למעלה כל באר בצלחת #3 עם נפח המתאים של תא בינוני לסכום כולל של 105 μL.
    הערה: צלחת #1, המכיל תאים, מקבל 100 μL של חיידקים opsonized עם הנותרים 5 μL כנפח החלל. בדקנו כל דילול של סרה הבדיקה בכפילות.
  6. צלחת דגירה #3 ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות בנוכחות 5% CO2 עם לחות כדי opsonize bacilli.

6. מבחני הדבקות ותיוג פלואורסצנטי של תאי יונקים

  1. יש לשמור על כל ריאגנטים ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. מניחים צלחת #1, המכיל תאים חסידיים, על בלוק חום 37 °C (70 °F).
  3. השתמש פילטר רב ערוצי כדי להסיר מדיום בילה מבארות במהירות להחליף עם 100 μL של חיידקים opsonized מצלחת #3. ודא שלא נוצרו בועות בבארות במהלך pipetting. צלחת הדגירה #1 ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 ולחות במשך 30 דקות עבור דבקות.
  4. לשטוף כל טוב 5x עם 150 μL PBS על גבי בלוק חום 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר bacilli מחובר.
    הערה: יש להקפיד לוודא שהתאים אינם מפוזרים בטעות במהלך הכביסה.
  5. לדלל 16% PF עם PBS 1:4 כדי להפוך 4% PF. לתקן תאים עם 4% PF עבור 1 שעה על ידי הוספת 150 μL לכל באר. לשטוף תאים 2x עם PBS.
  6. יש לערבב 2 μL HCS (הקרנה בתוכן גבוה) כתם תא כתום ב-PBS של 10 מ"ל. הוסף 150 μL של פתרון כתמים זה לתאים קבועים דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
  7. לשטוף בארות 2x עם PBS.
  8. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד למיקרוסקופיה.

7. מיקרוסקופיה

הערה: באופן כללי, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה יאפשר הדמיה עבור ה- OAA. אם מערכת אוטומטית אינה זמינה, תמונות פלואורסצנטיות של bacilli חסידים ניתן לצלם באופן ידני21. במחקר זה20, bacilli חסידי מונוליירים התא צולמו באמצעות Zeiss 700 לייזר סריקת מיקרוסקופיה מערכת עם ציוד מיוחד; המערכת שלנו הייתה מורכבת Zeiss Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך מצויד בשלב אוטומטי, מודול פוקוס מובהק, 40 x NA 0.6 המטרה, מצלמת Axio Cam HRc ותוכנת זן 2012 (מהדורה כחולה). התמונות שנרכשו הן תמונות רחבות שדה, לא תמונות קונפוקל. הפרוטוקול הבא מיועד כהגדרת מיקרוסקופ בסיסית החלה על מגוון מערכות מיקרוסקופיות אוטומטיות.

  1. צלחת הדגירה #1 בטמפרטורת הסביבה במשך 30 דקות. הפעל את המיקרוסקופ ואת הציוד הקשור.
    הערה: התאקלמות בטמפרטורת הסביבה מונעת היווצרות עיבוי על לוח הזכוכית במהלך ההדמיה. בנוסף, הוא מונע נטרול עקב שינוי בטמפרטורה.
  2. הנח לוח על הבמה והתמקד בתאים באמצעות ניגודיות שדה בהיר או פאזה.
  3. בחר 96 גם לעצב כמו הגדרת הלוח. בחר הגדרות ערוץ.
    הערה: שיא עירור ואורך הגל פליטה של FITC הם 495/519 ננומטר; כתם התא הכתום HCS הם 556 ו 572 ננומטר. פלואורופורים אחרים עשויים לשמש בהתאם למסננים הזמינים במיקרוסקופ.
  4. בחר הגדרה למצב אריח. ציין את מספר התמונות שיש לרכוש.
    הערה: פונקציית הריצוף מאפשרת לכידה של מיקומים מרובים בבאר מדגם וניתן להגדיר אותה לרכישת תמונה באריחים או בתבנית אקראית. אנחנו תמונה 10 אזורים אקראיים לכל באר.
  5. שנה את מצב הרכישה ל"שחור-לבן" או "מונוכרום" ואיתור ≥ 2x2.
    הערה: הגדרת האיתור מ- 1x1 ל- 2x2 או 4x4 תגדיל את מהירות המיקרוסקופיה אך גם תגרום לרזולוציה נמוכה יותר של התמונה. עבור OAA, זה מספיק כדי להשתמש בהגדרות אלה כמו ההסתערות מספרת הן את מקרופאגים ואת החיידקים חסידים.
  6. הפעל מודול פוקוס אוטומטי או מיקוד. ציין באיזו תדירות יש לבצע פונקציית התמקדות אוטומטית. הפעל את פונקציית מחסנית Z, אם היא זמינה. ציין את מספר ערימות Z שילכדו את עובי המונולייה של התא ואת bacilli חסידים.
    הערה: מספר ערימות Z שנבחרו יגדיל את זמן המיקרוסקופיה אך יבטיח שתמונה עם המוקד הנכון תילקח בכל מחסנית Z.
  7. ייעד תיקיית קבצים לשמירת תמונות. הפעל את תוכנית הדימות האוטומטית.

8. איסוף וניתוח נתונים

  1. לספור את מספר התאים bacilli ויונקים חסידים לכל תמונה. לספור כל שרשרת של bacilli כחיידק אחד.
  2. התווה את bacilli / תאים של סרום בדיקת בקרה חיובית טיטר (למשל, 1:10 דילול הוא 10 יחידות titer) כדי ליצור עקומה סטנדרטית בתוכנית סטטיסטיקה מתאימה.
  3. נתח את סרום בדיקת הבקרה החיובית באמצעות התאמת עקומת רגרסיה לא ליניארית. לאחר מכן לנתח את הדגימות הנותרות באמצעות העקומה הסטנדרטית של סרום בדיקת הבקרה החיובית כדי לקבוע titers המתאים.
    הערה: זה בדרך כלל המדויק ביותר לבחור את דילול מדגם ליד אמצע העקומה הסטנדרטית בעת קביעת titers.
  4. חשב את הממוצע הגיאומטרי של הדגימות מכל קבוצת חיסונים. חשב את ערכי ה- P של titers שהומרו על-ידי רישום לפי ניתוח ANOVA של הפרש פחות משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סעיף זה מציג מיקרוגרפים מייצגים שנאספו במהלך ניסוי OAA יחד עם תוצאות המראות כי OAA יכול לשמש כדי לבחון את הפונקציה הביולוגית של נוגדנים. כאן, הבדיקה שימשה בהצלחה כדי להעריך את היעילות של מועמד חיסון אנתרקס. זה קריטי כדי לאמת את מצב של אנקפסולציה על bacilli כמו מעט עד ללא אנקפסולציה גורם להם לדבוק בתאים מארחים, לייצר רקע גבוה. איור 1 הוא תמונה של B. anthracis Ames מוכתם בדיו הודו כדי לבחון אנקפסולציה. OAA דורש תאורה של שדות תצוגה סמוכים מרובים ואם נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חיסונים מבוססי כמוסות הוכחו כיעילים נגד פתוגנים חיידקיים רבים, ורבים מורשים לשימוש בבני אדם25,26,27. חיסונים אלה פועלים על ידי יצירת נוגדנים המכוונים לקפסולה ורבים ממחקרים אלה משתמשים ב- OPKA כדי להראות את הפונקציות האופוסונו-פגוציטיות של הנוגדנים13,14,16,28,29. בשל ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין עמותה מסחרית או אחרת שעלולה להוות ניגוד עניינים.

תודות

ג'יי צ'ואה, ד. צ'בוט וא. פרידלנדר עיצבו את ההליכים המתוארים בכתב היד. ג'יי צ'ואה ות', פוטמון-טיילור, ביצעו את הניסויים. ד. צ'בוט ביצע ניתוח נתונים. ג'יי צ'ו כתב את כתב היד.

המחברים מודים לקייל ג'יי פיטס על סיוע טכני מצוין.

העבודה נתמכה על ידי הסוכנות להפחתת איומים ביטחוניים CBM. VAXBT.03.10.RD.015, תוכנית מספר 921175.

דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחברים ואינן בהכרח מאושרות על ידי צבא ארה"ב. תוכנו של פרסום זה אינו משקף בהכרח את השקפותיו או מדיניותו של משרד ההגנה, ואינו מזכיר שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים המרמזים על תמיכה של ממשלת ארה"ב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.20 ומיקרו; מסנן מזרק m (25 מ"מ, תאית מחודשת)קורנינג, קורנינג, ניו יורק431222
מזרק 10 מ"ל (קצה Luer-Lok)BD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי302995
15µ 96 צלחות שחורות באר (צלחת #1 להדמיה)In Vitro Scientific, Sunnyvale, CAP96-1-N
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Science, Hatfield, PA15710
75 ס"מ מרובע בקבוק מטופל בתרבית רקמותקורנינג, קורנינג, ניו יורק430641
אגר (אבקה)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
Baby Rabbit ComplementCedarlane Labs, Burlington, NCCL3441
תמצית שמרי בקטוBD, ניצוצות, MD288620
BBL עירוי לב מוח (BHI)BD, ניצוצות, MD211059
אגר דם (TSA עם דם כבשים) צלחותRemel, Lenexa, KSR01198
מגרד תאיםSarstedt, Newton, NC83.183
Costar 96 באר צלחות תרבית תאים (צלחות #2 ו-3 לדילול)קורנינג, קורנינג, ניו יורק3596
כיסוי זכוכיתמיקרוסקופיה אלקטרונית מדע, האטפילד, PA72200-10
Difco NutrientBroth BD, Sparks, MD234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוהGibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA11965-092מכיל 4500 מ"ג/ליטר גלוקוז, 4 מ"מ L-גלוטמין, פנול אדום
EVOS FL מערכת הדמיית תאים אוטומטיים (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAMAFD1000
סרוםבקר עובריHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSH30071.03לא מוקרן גמא, לא מומת בחום
Fluorescein isothiocyanateInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAF143
HCS Cell Mask Invitrogen Orange Cell StainThermo Fisher Scientific, Waltham, MAH32713
hemocytometer (משופר נויבאואר)Hausser Scientific, Horsham, PA3900
תמיסת דיובהודו BD, Sparks, MD261194
L- גלוטמין (200 מ"מ)Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA25030081מדיום תוסף עם תוספת של 2 מ"מ L-גלוטמין
Nikon Eclipse TE2000-U (מיקרוסקופ תרכובת הפוכה)Nikon Instruments, Melville, NYTE2000
PBS ללא סידן או מגנזיוםלונזה, ווקרסוויל, מרילנד17-516F
, 100xHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSV30010
צלחות פטרי (100 x 15 מ"מ)Falcon, Corning, Durham, NC351029לצלחות אגר
RAW 264.7 קו תאי מקרופאגים (Tib47)ATCC, Manassas, VAATCC TIB-71
שקופיותVWR, Radnor, PA16004-422
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOS5761
תמיסה כחולה טריפן (0.4%)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOT8154
Zeiss 700 מיקרוסקופ סריקת לייזר (מיקרוסקופ קונפוקלי)קרל זייס מיקרואימציה, ת'ורנווד, ניו יורק4109001865956000
, תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין

מקורות

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RAW 264 7FITCEncapsulation
Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.