הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להנדסת חיישנים-מפעילים של חלבון תוך תאי מקודד גנטית. המכשיר מזהה באופן ספציפי חלבוני מטרה באמצעות נוגדנים תוך-תאיים (תוך-גופים) ומגיב על ידי הפעלת פלט שעתוק גנים. מסגרת כללית נבנתה כדי להחליף במהירות את התוך-גופים, ומאפשרת זיהוי מהיר של כל חלבון רצוי, מבלי לשנות את הארכיטקטורה הכללית.
חלבונים יכולים לתפקד כסמנים ביולוגיים של מצבים פתולוגיים, כגון מחלות ניווניות, זיהומים או תסמונות מטבוליות. הנדסת תאים לחוש ולהגיב לסמנים ביולוגיים אלה עשויה לסייע בהבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיות, כמו גם לפתח טיפולים חדשים מבוססי תאים. בעוד שפותחו מספר מערכות המזהות חלבונים חוץ-תאיים, חסרה מסגרת מודולרית שניתן להנדס מחדש בקלות כדי לחוש חלבונים תוך-תאיים שונים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום פלטפורמה גנטית מודולרית החשה חלבונים תוך-תאיים ומפעילה תגובה תאית ספציפית. המכשיר פועל על נוגדנים תוך-תאיים או פפטידים קטנים כדי לחוש בספציפיות גבוהה את החלבון המבוקש, ומפעיל את הפעלת השעתוק של גני הפלט, באמצעות מודול הפעלה מבוסס TEV פרוטאז (TEVp). TEVp הוא פרוטאז ויראלי המבקע באופן סלקטיבי פפטידים קוגנטיים קצרים ונמצא בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה ובביולוגיה סינתטית בשל האורתוגונליות הגבוהה שלו לאתר המחשוף. באופן ספציפי, הנדסנו מכשירים המזהים ומגיבים לסמנים ביולוגיים של חלבונים של זיהומים נגיפיים ומחלות גנטיות, כולל הנטינגטין שעבר מוטציה, NS3 סרין-פרוטאז, חלבוני Tat ו-Nef כדי לזהות זיהומים של מחלת הנטינגטון, נגיף הפטיטיס C (HCV) ונגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV), בהתאמה. חשוב לציין, ניתן להתאים את המערכת באופן ידני לתוצאה התפקודית הרצויה של קלט-פלט, כגון קריאות פלואורסצנטיות לחיישנים ביולוגיים, גירוי הצגת אנטיגן לתגובה חיסונית, או התחלת אפופטוזיס כדי לחסל תאים לא בריאים.
המחקר והמודולציות של תגובות תאיות באמצעות מעגלי גנים מהונדסים הניתנים לשליטה הם מטרות עיקריות בביולוגיה סינתטית 1,2,3 לפיתוח כלים פרוספקטיביים עם יישומים ביולוגיים או רפואיים רלוונטיים בסרטן4, זיהומים5, מחלות מטבוליות6 ואימונולוגיה7.
תכנות מחדש של פונקציות תאים בתגובה לאותות ספציפיים דורש תכנון של ממשקים חכמים המקשרים חישה של שינויים דינמיים חוץ-תאיים או תוך-תאיים (קלט) לעיבוד במורד הזרם, ומפעילים פלט ספציפי למטרות אבחון....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. עקרונות תכנון לבנייה ובדיקה של מכשיר חיישן-מפעיל
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ארכיטקטורה לזיהוי חלבון תוך-תאי מודולרי
כפי שמוצג באיור 1, המכשיר מורכב מ: 1) תוך-גוף 1 המחובר לסמן הפלואורסצנטי הקשור לממברנה (mKate) ולאתר המחשוף TEVp (TCS), ואחריו מפעיל שעתוק GAL4VP16 (TF); 2) תוך-גוף 2 התמזג לפרוטאז TEV (TEVp), חופשי בציטוזול; 3) מקדם סינתטי המגיב GAL4VP16, מניע את הביטוי של גן מדווח. המודולריות מובטחת על ידי גופים תוך-גופיים הניתנים לשינוי באופן plug-and-play כדי למקד כל חלבון רצוי. כמו כן, ניתן לבחור את הפלט בהתאם ליישום הרצוי. היבט קריטי על מנת לי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
עד לאחרונה, חקירת תאים על בסיס סביבה תוך-תאית בוצעה במערכות שפותחו דה נובו למטרות ספציפיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר דוגמה לגישה העדכנית ביותר, הנדסת תאים לחישה והפעלה של חלבונים במכשיר אחד, שניתן להתאים במהירות לסמנים ביולוגיים רצויים חדשים.
מערכת חלוצית זו חשה חלבונים תוך תאיים ומספקת פלט ספציפי לאיתור או נטרול המחלה. היתרון של סוג זה של מעגלים גנטיים הוא המודולריות המסופקת על ידי גופים תוך-גופים והאפשרות להשתמש ב"חלקים" חישה אחרים כדי למקד את החלבון כפי שמוצג .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון האיטלקי לטכנולוגיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 647 עכבר אנטי אנושי HLA-A, B, C שיבוט נוגדנים W6/32 | Biolegend | 311414 | נוגדנים |
| נספח V | LifeTechnologies | A35122 | סמן אפופטוזיס |
| Attractene | Qiagen | 301005 | מגיב טרנספקציה |
| BD Falcon צינורות תחתונים עגולים BD | Biosciences | 352053 | צינורות FACS |
| דוקסיציקלין | Clonetech | - | תרבית תאים: תרופות |
| מדיום הנשר השונה של Dulbecco | Cellgro | 10-013-CM | תרבית תאים: |
| מערכת הדמיית תאים בינונית Evos | חיים | EVOS M5000 | ; שיבוטים מולקולריים זיהומיים |
| FACSDiva8 תוכנה | BD Biosciences | 659523 | FACS |
| תוכנה מהירה SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4385612 | qPCR תגובה |
| FBS (סרום בובין עוברי) | אטלנטה BIO | S11050 | תרבית תאים: |
| Medium Gateway | System Life | Technologies-Plasmid | |
| Construction Golden Gate מערכת | פנימית-בניית פלסמיד | ||
| HEK 293FT | Invitrogen | R70007 | תרבית תאים: |
| מערכת שיבוט עירוי | Clonetech | 638920 | בניית פלסמיד |
| JetPRIME מגיב | Polyplus טרנספקציה | 114-15 | מגיב Transcfection |
| תאי Jurkat ATCC | TIB-152 | תרבית תאים: תאים | |
| L-גלוטמין | סיגמא-אולדריץ' | G7513-100ML | תרבית תאים: |
| ליפופקטמין LTX בינוני עם ריאגנט פלוס | מגיב תרמו פישר 15338030 | מגיב טרנספקציה | |
| LSR Fortessa זרימה ציטומטר (405, 488 ו-561 לייזרים nm) | BD Biosciences | 649225 | זרימה ציטומטר |
| מיקרו-אמפר מהיר אופטי 96 בארות תגובה צלחת (0.1 mL) | ThermoFisher Scientific | 4346907 | תגובת qPCR |
| Neon Transfection | System Life Technologies | MPK10025 | מגיב טרנספקציה |
| חומצות אמינו לא חיוניות | HyClone | SH3023801 | תרבית תאים: Medium |
| Opti-MEM I הפחתת סרום בינוני | טכנולוגיות חיים | 31985070 | טרנספקציה מדיום |
| פניצילין/סטרפטומיצין | תרבית תאים Sigma-Aldrich | P4458-100ML | : |
| ערכת שעתוק הפוך בינונית QuantiTect | Qiagen | 205313 | Rev Transcriptase |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | ערכת מיצוי RNA |
| RPMI-1640 | ATCC | ATCC 30 2001 | תרבית תאים: Medium |
| Shield | Clonetech | 632189 | תרבית תאים: תרופות |
| SpheroTech RCP-30-5-A חרוזים | Spherotech | RCP-30- 5A-2 | פיצוי הגדר |
| StepOnePlus 7500 מכונה | מהירה מיושמת Biosystems | 4351106 | תגובת qPCR |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב