מאמר שיטה

פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

DOI:

10.3791/60888

⸱

3 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות מיקרופרינינג שימשו באופן נרחב בביולוגיה התא כדי ללמוד את ההשפעות של שליטה בצורה וגודל התא על קביעת הגורל התא ברזולוציה תא בודד. העדכנית ביותר של המדינה-של-art בודד טכניקות מיקרוגרפיה כרוכים לדפוס רך מיקרו מגע הדפסה, שהיא טכנולוגיה רבת עוצמה, אבל דורש מיומנויות הנדסה מוסמך ותמיכה מתקן מסוים במיקרו בייצור. מגבלות אלה דורשות טכניקה נגישה יותר. כאן, אנו מתארים שיטת ליתוגרפיה פשוטה וחופשית: שיטה מבוססת-סטנסיל של תא יחיד. אנו מספקים הליכים צעד-אחר-צעד, כולל עיצוב סטנסיל, ייצור פוליאקרילאמיד הידרוג'ל, התאגדות חלבון מבוססת-סטנסיל, ציפוי תאים ותרבות. שיטה פשוטה זו יכולה לשמש לתבנית מערך של רבים כמו 2,000 תאים. אנו מדגימים את הפנינג של הקרדיוציטים שמקורם באחד בתאי גזע המושרה האנושית pluripotent (היפנוטית) עם צורות תא ברורים, מ 1:1 מרובע כדי 7:1 מלבן מבוגר בצורת הקרדיוציט. זה תא בודד מבוסס סטנסיל מהתכנות הוא ללא ליתוגרפיה, טכנית חסון, נוח, זול, והכי חשוב נגיש לאלה עם רקע ביולוגי מוגבל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתו של hiPSCs ואת הפיתוח הבאים של פרוטוקולים עבור הבידול שלהם בבימויו של סוגי תאים שונים הפכו את זה אפשרי ללמוד פיתוח ומחלות ברמה מולקולרית ומטופל ספציפי, במיוחד באמצעות החולה נגזר ipsc קרדיוציטים (ipsc-CMs) לדגם cardiomyopathies1,2. עם זאת, מגבלה מרכזית לחקר התפתחות ופיזיולוגיה באמצעות מערכת iPSC ואחרים במודלים חוץ גופית היא העדר מיקרוסביבה מובנית. באתרו, תאים חשופים האילוצים של מטריצה החילוץ (ECM), כמו גם תאים שכנים. ההרכב הביוכימי המסוים והקשיחות של מיקרוסביבות אלה מכתיבים את התפלגות המרחב של תאים, כמו גם גורמים זמינים לעוסקים הדבקה תא. זה, בתורו, משפיע תאיים מסלולים איתות, ביטוי גנים, ונחישות הגורל התא. לדוגמה, iPSC-CM מיקרותבנית בצורת מבוגר כמו מוט יש יכולת כושר טובה יותר באופן משמעותי, זרימת סידן, ארגון מיטוכונדריאלי, אלקטרופיזיולוגיה, ו-כדורית רוחבי היווצרות3. לפיכך, תכונות המיקרו-סביבה הן בלתי-מהותי בוויסות התפקודים הסלולאריים.

טכניקות המיקרו-מיקרוגרפיה הקודמות הסתמכות בכבדות על פוטוליטוגרפיה (איור 1A). בטכניקה זו, שכבה של פולימר לאור, או photoresist, הוא סובב על מצע שטוח מהפתרון כדי ליצור סרט דק על 1 יקרומטר עבה. הבא, אולטרה סגול (UV) האור מוחל על photoresist באמצעות מסכה המכילה את התבנית הרצויה. חשיפה לאולטרה סגול (UV) אור כימית משנה את הphotoresist על ידי שינוי מסיסות שלה בפתרון המפתחים בהתאמה שלה, העברת התבנית הרצויה מן המסכה על מצע. שיטות רבות למיקרו-מיקרוגרפיה משלבות פוטוליטוגרפיה, כפי שהיא משלבת ננו כדי לשלוט ברמת מיקרומטר על העיצוב של דפוסי התא. עם זאת, ספינינג של photoresist הוא רגיש מאוד זיהומים, כי חלקיקי האבק הקטן ביותר יהיה לשבש את התפשטות הפתרון לתוך סרט דק. הפוטוליתוגרפיה חייב להתבצע במתקנים לא מזוהמים, אשר יקרים לשמור ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לנצל. בנוסף, הכימיקלים המשמשים בפוטוגרפיה הם לעתים קרובות רעילים לתאים והוא יכול לbiomolecules חשוב. לפיכך, פוטוליתוגרפיה מהווה מכשולים משמעותיים לייצור מיקרודפוסים עבור יישומים ביולוגיים נוחים.

ב 1994, Whitesides ועמיתים4 התגברו על כמה אתגרים הקשורים בפוטוגרפיה על ידי החלוצי אוסף של טכניקות שנקרא ליתוגרפיה רכה. ב ליתוגרפיה רך, משטח מובנה שנעשה עם polydiמתיל siloxane (PDMS), חומר שקוף, כמו גומי, משמש להפקת דפוס של חלבונים ECM4. טכניקות ליטוגרפיה רכות נפוצות כוללות הדפסה במיקרומגע והדפס מיקרופלואידיג. בדפוס microcontact, כיום שיטת הליתוגרפיה הרכה הפופולרית ביותר, חותמת PDMS מצופה בחלבונים של ECM מעבירה את החומר על פני השטח באזורים שאליהם נוצר החותם (איור 1B). In מיקרופלואידיג, מיקרומבנים מתוכננים על פני משטח PDMS כגון, כאשר החותמת היא לחצה על מצע, רשת של מיקרוערוצים, שדרכו ניתן להעביר נוזלים לאזורים הרצויים, נוצר (איור 1C)5. ליתוגרפיה רכה מציעה מספר יתרונות על פני פוטוגרפיה. לאחר וופל מאסטר הוא מיקרופוברק, בולים PDMS ניתן בקלות לשכפל ללא תעסוקה נוספת של מתקני חדר נקי. בנוסף, העדר ממיסים אורגניים בתהליך של ליתוגרפיה רכה מאפשר ניצול של חומרים פולימריים כגון פוליסטירן, בדרך כלל בשימוש בתרבות התא. לבסוף, מיקרוגרף שימוש בשיטות ליטוגרפיה רכות אינו מוגבל למשטחים שטוחים. לכן, ליתוגרפיה רכה מגבירה את הנגישות והפונקציונליות של ייצור מיקרותבניות על גבי פוטוליתוגרפיה6. עם זאת, ליתוגרפיה רכה יש חסרונות משמעותיים. לדוגמה, שלב התחריט ההתחלתי, שימוש בפוטוגרפיה, עדיין נדרש למיקרו-הרכיבו את החותמת. בנוסף, מיקרופילנינג באמצעות חותמת PDMS כפוף וריאציות באיכות של העברת חלבון על מצע6. הימנעות מסתירות אלה דורשת אופטימיזציה ועקביות בלחץ המוחל על החותמת של PDMS במהלך העברת החלבון, הדפורמציה אחרת ועיוות של גודל התכונה של תבניות PDMS יכול להתרחש6. יש גם דאגה עיקרית של השימוש שוב ושוב PDMS בשל ספיגת מולקולה קטנה7.

כדי למנוע באמצעות פוטוגרפיה רך ו-PDMS בולים, אנו מתארים מבוססי סטנסיל, ליתוגרפיה בודדת תא השיטה מיקרודפוס הגוברת על רבים של המכשולים הקשורים בפוטוגרפיה וליתוגרפיה רך. בשיטה זו, משמש הידרואקרילאמיד בתור מצע עבור התאגדות חלבון ECM מבוסס סטנסיל, המאפשר ציפוי סלקטיבי של היפנוסק-CMs יחיד. טכניקה זו מתאימה מאוד לחומרים פולימריים המשמשים בתנאי תרבות תאים קלאסיים. יתר על כן, עם ניקוי ותחזוקה נאותים, הסטנסילים הם הניתנים לשימוש חוזר ועמידים בפני השפלה וספיגת החלבון במהלך תהליך המיקרוייצור. לבסוף, תהליך העיבוד הוא מבחינה טכנית יציב, זול, להתאמה אישית, ונגיש לאלה ללא כישורים bioהנדסאים מיוחדים. זו טכניקה מיקרומניפולציה מבוססי סטנסיל כבר מנוצל באופן כללי ב שלנו פרסומים האחרונים מידול מגוונת cardiomyopathies8,9,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הייצור של שלילי דפוס polyimide מבוססי סטנסילים

  1. יצירת תבנית (איור 2 א) בתבנית. dxf באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (לדוגמה, AutoCAD, Solidworks, Onshape, Adobe Illustrator).
    1. צור עיגול (קוטר = 22 מ"מ) כדי להתוות את הגבול של הסטנסיל.
    2. צייר צורה מלאת מוצק או את התבנית הרצויה.
    3. כלול מכתב כיראאל (g., R) כדי לסמן את הצד הקדמי של הסטנסילים.
      הערה: כדוגמה, מערך של ריבועים ומלבנים נוצר לתבנית iPSC-CMs ברמות תא יחיד ותא זוג תאים. קבצי העיצוב זמינים (ראה קבצים משלימים). מגבלת הרזולוציה של המיקרו-ייצור היא ~ 10 μm.
  2. לשלוח את העיצוב לחברה מיקרוייצור לייזר לגזור פוליאימיד הסרט והרכיבו סטנסילים (איור 2b,C).

2. הכנת משפחת סולפו-סאח

הערה: הפרוטוקול משתנה מפישר ואח '.

  1. השתמש עמיד לחות קרטון לדוגמה תיבת אחסון (g., 100 ובכן, 10 x 10 רווחים עבור צינורות צנטריפוגה, מידות: 13.4 ס"מ x 13.4 ס"מ x 5.1 ס"מ). תווית זה "שם/תאריך/sulfo-SANPAH 40 μL/מחדש עם 1,200 μL של PBS".
  2. תווית 50 מיקרוצנטריפוגה צינורות (פוליפרופילן, 1.5 mL) עם ' s ' על המכסה.
  3. לקחת 4 מ ל של anסולפוקסיד, יבש במיוחד דימתיל תיל (dmso) וסטרילי לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן קרום (גודל הנקבוביות = 0.22 μm) לתוך צינור מעוקר 15 מ"ל.
  4. הכן אמבט חנקן נוזלי והתכסה במכסה כדי למזער את האידוי של החנקן הנוזלי.
  5. לפזר 50 מ"ג של sulfo-SANPAH תוך 2 מ ל של DMSO מסוננים.
  6. מערבולת היטב כדי לפזר לחלוטין את sulfo-SANPAH ב DMSO.
  7. הפץ 40 μL של הפתרון sulfo-SANPAH לצינורות 1.5 mL סטרילית.
  8. להעביר את הצינורות לתוך הקופסה.
  9. פלאש-להקפיא את צינורות בחנקן נוזלי עבור 5 דקות.
  10. אחסן את הליאביטים ב-80 ° c.
    הערה: ניתן להשתמש ב-ali, עד 6 חודשים ללא יעילות מופחתת. מלאי הריכוז sulfo-SANPAH הוא 25 מ"ג/mL או 50.77 מ"מ.

3. עיקור כלים

  1. אוטוקלב שני מלקחיים, 24 שמיכות זכוכית (22 x 22 מ"מ, מס ' 1 או No. 1.5), להב תער אחד, ושלושה מגבונים סופג נטול סיבים.
    הערה: כדי להפוך 12 בנייה של הידרוג'ל, יש צורך בכיסויים של 24 שמיכות זכוכית. צריך להיות שני. שמיכות לכל מבנה מומלץ להכין כמה כיסוי רזרבי.
  2. מקום שני חתיכות של סרט פרפין (4 x 4 אינץ ') בתיבת פלסטיק עמידים בפני אתנול (g., a 1,000 μL בתיבת טיפ) ולעקר אותם טריים 70% אתנול לפחות 15 דקות.

4. הכנת תמיסת פוליאקרילאמיד הידרוג'ל

הערה: הפרוטוקול משתנה מ-Lee et al.12.

  1. התמוססות 125 מ ג של עמינח מתיונין (AEM) ב 36.25 מ ל של מים מאוהים בצינור שפופרת פוליפרופילן משנת 50 mL על ידי vortexing.
  2. כדי להכין 50 mL של 10 kPa פוליאקרילאמיד הפתרון הקודמי (8 – 0.15 – 15 מ"מ), מערבבים 10 מ ל של 40% אקרילאמיד פתרון, 3.75 mL של 2% bis-אקרילאמיד פתרון, ו36.25 mL של הפתרון AEM הכין בשלב 4.1 בתוך שפופרת חדש של הפוליפרופילן משנת-mL.
    הערה: הריכוז הסופי של הפתרון המקודח הוא 8% אקרילאמיד, 0.15% bis-אקרילאמיד, ו-15 מ"מ AEM, שנמדד כ-10 הנוקשות של kPa באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. על פי בקשות הרקמה של עניין, הנוקשות של ההידרוג'ל ניתן לשנות על ידי שינוי היחס של 40% אקרילי לפתרון 2% bis-אקרילאמיד. לדוגמה, 8% אקרילאמיד – 0.08% bis-אקרילאמיד מניב 3 kPa הידרולים; 8% אקרילאמיד – 0.48% bis-אקרילאמיד מניב מ38 kPa הידרולים; 8% אקרילאמיד – 0.48% bis-אקרילאמיד מניב פתרונות 60 kPa. מומלץ לאשר את הנוקשות של הידרוג'לים העשויים מהפתרונות הקודמים ביחס משתנה.

5. הכנת פתרון ליוזם התמונה

  1. עבור 1 mL של 5% הפתרון ליוזם התמונה, הראשון לפזר 50 מ"ג של 2-הידרוxy-4-(2-הידרוידטורוקסי) -2-methylpropiophenone אבקה ב 700 μL של 100% אתנול בתוך שפופרת משנת פוליפרופילן עם 1.5 מכסה של mL.
    הערה: 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסיטורוקסי) -2-methylpropiophenone אינו מסיס במים. הקפד לפזר במלואו את האבקה באתנול על ידי vortexing.
  2. לאחר המסת לחלוטין 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסיטורוקסי) -2-methylpropiophenone באתנול על ידי vortexing, להוסיף 300 μL של מלוחים באגירה פוספט (PBS) עבור נפח סופי של 1 מ ל.
    הערה: הריכוז הסופי של 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסרוקסי) -2-methylpropiophenone פתרון הוא 5%. הפתרון הטוב ביותר לצילום מאתחל 5% הוא 4 שבועות ב -4 ° c.

6. הכנת מטריצת המרתף ממברנה פתרון חלבון

הערה: מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים) היא חומר רגיש לטמפרטורה. הקפידו לעבוד על קרח עם טיפים וצינורות מצוננים, כמו גם פתרונות קר-קרח. מלאי חדש של מטריצת קרום המרתף יש להפשיר לאט על הקרח ב -4 ° c בלילה.

  1. הכינו 200 μL של תמיסת מטריקס ממברנה של מטריצת חלבון לכל מבנה הידרוג'ל. עבור 12 בנייה, 2.4 מ ל של המרתף ממברנה הפתרון חלבון מטריצה נדרשים. הכינו 10% פתרון נוסף (לדוגמה, 2.6 mL).
  2. עבור כל אצווה חדשה/הרבה של מטריקס ממברנה פתרון חלבון מטריצה, למטב את יחס הדילול. בפעם הראשונה, לבדוק את יחסי הדילול של 1:10, 1:20, 1:40 כדי למצוא את יחס הדילול התשואות את האיכויות הטובות ביותר לתא המ,.
    הערה: אם פתרון החלבון של מטריצת הממברנה במרתף הוא מוגזם, הוא יצור ג'ל על גבי הסטנסיל, וסביר יותר שהוא יקלף בעת הסרת הסטנסיל. אם פתרון החלבון הוא נוזלי מדי, הוא חודר דרך החורים בתבנית של הסטנסילים, אשר יגרמו לדפוס באיכות ירודה.
  3. לדלל מרתף ממברנה קרום חלבון מטריצה פתרון מלאי בקרח עם הקרח קר מאוד בינוני של הנשר/מזינים תערובת F-12 (DMEM/F12) מדיה או 1x PBS ליחס דילול ממוטב מעל. לדוגמה, לדלל 120 μL של פתרון המניה ב 2.4 mL של DMEM/F12 מדיה (1:20) ולשמור על קרח לשימוש מאוחר יותר.

7. ייצור הידרוג'ל

  1. מניחים מנורת ספסל UV (365 nm, 4 mW/cm2) במכסה בטיחות ביולוגית.
  2. מניחים את הסרטים פרפין מעוקר משלב 3.2 ויבש לחלוטין בתנאים סטרילי. אם הסרטים הפרפין אינם יבשים לחלוטין, השתמשו במערכת שאיפה ואקום כדי להסיר כל נוזל שרידי. במקום שישה שמיכות אוטוקלשים משלב 3.1 על כל סרט פרפין באמצעות מלקחיים אוטוקלבד.
  3. 50 הכינו את הפתרון המקודעי UV-crosslinkable על ידי דילול 5% הפתרון פוטומאתחל (שלב 5.2) עם הפתרון הקודמי polyאקרילי (שלב 4.2) בצינור הצנטריפוגה של פוליפרופילן. עבור 5 מ ל של UV-crossלייייייייייייייייייייאת הפתרון המקודמי, להוסיף 50 μl של 5% מאתחל הפתרון ל 5 מ ל של הפתרון הקודמי אלקטרופורזה.
  4. לסנן את הפתרון הקודמן משלב 7.3 באמצעות יחידת מסנן 50 mL עם גודל הנקבובית 0.22 יקרומטר עבור עיקור.
    הערה: תמיד להכין פתרון מקודמן טרי.
  5. לחלק 200 μL של הפתרון הקודמי polyאקרילי משלב 7.4 על כל 22 x 22 מ"מ מכסה זכוכית להחליק בתוך פרפין צלחת פטרי ולכסות בזהירות עם עוד 22 x 22 מ"מ שמיכות זכוכית על גבי סנדוויץ ' בין (איור 3A).
    הערה: סרט הפרפין משמש כדי להימנע מלשפוך ולהגביל את התמיסה הקודמת בין הכיסויים.
  6. מניחים את הכיסויים המכילים את צלחת פטרי משלב 7.5 מתחת למנורת הספסל UV ו פוטופוליל הידרואקרילאמיד הידרו במשך 5 דקות (איור 3B).
    הערה: אם המשטח אינו לבן, ספיגת הUV של פני השטח מפחיתה את היעילות של הפוטוקרוקישור. הכיסוי של הנייר הלבן על פני השטח הלא לבן חשוב כדי למזער את אובדן עוצמת UV. כדי להגן מפני קרינת UV, לכסות את המנורה עם רדיד אלומיניום ללבוש משקפי הגנה UV.
  7. נתק בזהירות כיסוי אחד מהשני באמצעות להב תער באמצעות מינוף פעולה (איור 3C).
    הערה: ההידרוג'ל נצמד בדרך כלל לכיסויים הראשיים. שימו לב נוספת בעת ניתוק ההידרוג'ל הרך, משום שהוא עשוי להישבר.
  8. ממלאים מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS. העבר את ההידרוג'ל הקומפוזיטורית במאגר המכיל pbs לשטוף את ההידרוג'לים ב-pbs עבור 5 דקות. לאחר השטיפה, מניחים את ההידרוג'ל בחזרה על סרט הפרפין בצלחת פטרי.

8. הקוניוגציה

  1. הכינו דלי קרח ומצננים ערוץ.
    הערה: עבור שישה הידרוג'לים, 1,200 μL של הערוץ הקר יש צורך.
  2. להוציא את sulfo-sanpah סדרת מחלקים (1 בקבוקון = 6 ג ' לים).
    הערה: אם יש צורך, את כמות sulfo-SANPAH השתמשו ניתן לצמצם לאחר האופטימיזציה.
  3. הוסף 1,200 μl של PBS קר לתוך בקבוקון של sulfo-sanpah סדרת מחלקים ו לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
  4. לחלק 200 μL של sulfo-SANPAH על הסרט פרפין בצלחת פטרי וכיסוי עם הידרוג'ל-coverslip מרוכב עם הידרוג'ל יצירת קשר עם sulfo-SANPAHאיור 3D.
    הערה: Sulfo-SANPAH הוא רגיש מאוד למים עקב הידרוליזה. הפשרה טרייה מ-80 ° c ימינה לפני השימוש. אל תעשה שימוש חוזר או הקפא שאריות מחדש.
  5. לחשוף את ההידרוג'ל למנורה UV ב 365 ננומטר, 4 mW/cm2 עבור 5 דקות כדי להפעיל SULFO-sanpah.
    הערה: לאחר החשיפה, sulfo-SANPAH ישתנה מכתום לחום (איור 3E). אם ההידרוג'ל הופך לחום, הוא מצביע על הפעלה מוצלחת של קבוצת הפניפו-סאנפה ושילוב של sulfo-SANPAH על ההידרוג'ל. המשיכו ישירות בצעדים 8.6-8.9 בתוך מקסימום של 10 דקות, מכיוון שהפעילות של sulfo-SANPAH תדחה.
  6. לחדש מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS טרי. לאחר sulfo-SANPAH הפעלה, להעביר את ההידרוג המופעל ובמהירות לשטוף את ההידרוג במאגר PBS להסרת מאוגד sulfo-sanpah.
    הערה: כביסה ארוכה עלולה לגרום ליעילות נמוכה ביותר באמצעות חלבון.
  7. לאחר שטיפה מהירה, הניחו את שמיכות ההידרוג'ל בסרט הפרפין בצלחות פטרי והתבוננו בזהירות את ההידרוג עם מגבונים נקיים.
    הערה: ה-PBS הנותרת על גבי ההידרוג'ל תגרום לדליפה של תמיסת החלבון של מטריצת המרתף דרך הסטנסיל, וייבוש נרחב יוביל לקרע של ההידרוג'ל בעת הסרת הסטנסיל בשל הדבקות גבוהה מדי לסטנסיל.
  8. מניחים את הסטנסיל על גבי ההידרוג ומטליות עם מגבונים נטול סיבים אוטומטיים כדי להבטיח איטום הדוק בין הסטנסיל לבין ההידרוג'ל (איור 3F).
  9. בזהירות לוותר 200 μL של המרתף מדולל קרום חלבון מטריקס הכין משלב 6.3 (איור 3G) על גבי. השאירו את הלילה בחממה (37 ° c).
    הערה: כאשר הקשר סטנסיל-הידרוג'ל הוא הדוק את המרתף קרום החלבון מטריקס הריכוז הפתרון הוא אופטימלי, המרתף ממברנה התמיסה חלבון הפתרון יהיה מהודק ולהישאר על גבי הסטנסיל (איור 3H). זמן דגירה ניתן לצמצם על ידי אופטימיזציה. תיאורטית, זה יכול להצטמצם עד 30 דקות – 2 h.
  10. למחרת, להעביר את ההידרוג'לים לצלחת 6 היטב לטבול אותם במלואו ב-PBS.
    הערה: מומלץ לקלף את הסטנסיל עם שקיעה PBS על שמיכות כדי למנוע קריעה והדבקה של הידרוג'ל לסטנסיל.
  11. הסר בזהירות את הסטנסיל באמצעות מלקחיים אוטוקלמים מבלי לקרוע את ההידרוג'ל. להשהות היטב עם DMEM להחזיר את ההידרוג'לים בדוגמת החממה, ולהשאיר אותם לילה לבדוק כל זיהום.
  12. אם התקשורת נשארת ברורה, ההידרוג'לים מוכנים לשימוש לציפוי תאים. מטב את צפיפות הציפוי התא ואת זמן הדגירה כדי לאפשר הדבקה של תאים עבור יישומים המתאימים.
    הערה: עבור תא בודד של היפנוסק-CMs, זרעים ו-דגירה לילה. מספרי התאים הבאים מומלצים לזריעה: 30,000, 60,000 ו-90,000 תאים/גם. זריעת תאים רבים מדי מוביל ליותר מתא אחד לכל תבנית. מסננת תאים מומלץ למתח את התאים שאינם בודדים לפני זריעת התאים.
  13. למחרת, לראות תא מצורף ומתפשטת, ולשנות את המדיה כדי להיפטר תאים מנותקים.

9. ניקוי הסטנסילים המשמשים

  1. כדי להסיר חלבונים שיורית מטריקס על הסטנסילים המשמשים, להטביע את הסטנסילים בתמיסה אנזים (לוח חומרים) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
    הערה: יש לבחור את האנזים בהתאם לחלבוני המטריצה שבשימוש. לפתרון חלבון מטריצה עשיר בקולגן, השתמש בקוליגנאז. מומלץ גם לultrasonication בפתרון אנזים של 10 עד 15 דקות.
  2. מרוב את התמיסה ומחדש. עם 10% אקונומיקה מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לשטוף 3x עם PBS.
  4. אחסן ב-70% אתנול ב -4 ° צ' עד השימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור של סטנסילים המכילים מערך של ריבועים או מלבנים הפגינו (איור 4A). בעקבות פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג בדוגמת איי חלבון מטריצות (איור 4B ואיור 5a) ותאים (איור 4b). הריכוז הפתרון האופטימלי של חלבון מטריצה תת-אופטימלית (איור 5B). קריטי להשתמש בצד הקדמי של הסטנסיל. אם נעשה שימוש בצד האחורי של הסטנסיל, גודל איי החלבון של המטריצה גדל בשל הכיוון של חיתוך הלייזר (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת המיקרו-מיקרוגרפיה המבוססת על סטנסיל, המאפשרת בחירה יעילה של תאים חסיד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הפנינג של היסק-CMs ביחס אורך-לרוחב שונים על ידי מיקרופתנינג מטריקס קרום הממברנה איי החלבון על הידרואקרילאמיד הידרו עם מבחינה פיזיולוגית או פתולוגית הרלוונטיות רקמות או הסיליקון מבוססי מצעים אלסטומר. שיטה זו היא פשוטה יחסית ונגישה מאוד לכל החוקרים, כולל אלה שיש להם מעט רקע בפוטוליטוגרפיה וטכניקות מיקרוליגרפיה. השיטה המתוארת מציבה אתגרים משמעותיים הקשורים ליצירת חותמות תוך שימוש בליטוגרפיה רכים והעברת חלבונים מת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט דוקטורט מאוניברסיטת סטנפורד מחקר הבריאות המכון (חג המולד) והמכון הלאומי לבריאות (1F32HL142205-01) ל-S. L, משרד NIH של פרס פיוניר של הבמאי (LM012179-03), איגוד הלב האמריקאי הוקמה פרס החוקר (17EIA33410923), המכון לרפואת לב וכלי דם של סטנפורד, קרן הופמן ושרדינגר, ואת החטיבה סטנפורד של תרופות לב וכלי דם, המחלקה לרפואה של ס. מ. W , פרסים מן המכון הלאומי לבריאות (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ו-טבק הקשורים מחקר תוכנית (TRDRP 27IR-0012) ל-J. C. W, איגוד הלב האמריקני (AHA) פרס פוסט דוקטורט (18POST34030106) ל H. Y, ואת המענק Hengstberger ל ט אנו מודים ד ר אנדרו אולסן שירות מיקרוסקופ מדעי המוח על התמיכה של הדמיה קונפוקלית וקד של היפנוגרף-CM. אנו מודים לח על עיצוב הסטנסיל הראשון, ייצור, תא בודד מיקרוגרף של ipsc-CM על שמיכות פוליאקרילמיד הידרוג'ל מצופה, ו הדמיה מיקוד ראשוני של המבנה סרקומר של תא יחיד מיקרותבנית ipsc-CMs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-אמינואתיל מתאקרילט הידרוכלוריד (אבקה)תמיסת סיגמא-אולדריץ'516155
אקרילאמיד 40% (תמיסה)סיגמא-אולדריץ'A-4058-100 מ"ל
ספסל מנורת UV 365 ננומטרUVPUVP 95-0042-07, XX-15L
צלחת תרבית BioFlexFLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, ברלינגטון, NCצלחת 6 בארות עם מצע אלסטומר סיליקון
תמיסת ביס-אקרילאמיד 2% (תמיסה)Sigma-AldrichM1533-25mL
משקפי כיסוי קורנינג מרובעים, מס' 2, W וזמנים; L 22 מ"מ ופעמים; 22 מ"מSigmaCLS285522
Irgacure (2-הידרוקסי-4&פריים;-(2-הידרוקסיאתוקסי)-2-מתילפרופיופנון) (אבקה)Sigma-Aldrich410896
MatrigelCorning356231תמיסת חלבון מטריצת ממברנה בסיסית
מתיל סולפוקסיד, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, מסנן ACROSOrganics Acros Organics326881000
Millex (13 מ"מ) יחידה עם ממברנה DuraporeMilliporeSLGV013SL
Millipore 50 מ"ל Steriflip (0.22 ומיקרו; m)Fisher ScientificSCGP00525
שבלונותפוטומקעיצוב
Sulfo-SANPAHThermoFisher Scientific22589
TrypLE Select 10xThermoFisher ScientificA1217702 אנזים המשמש לניקוי שבלונות
מותאם אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  4. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
  5. Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
  6. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  7. Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
  8. Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  9. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  10. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  11. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  12. Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
  13. Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
  14. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sulfo SANPAHhiPSC

מאמרים קשורים