ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

תקציר

רשתות ננו-צינוריות ליפידים (LNT) מייצגות מערכת מודלים חוץ גופית לחקר הובלה מולקולרית וביופיסיקה של שומנים עם רלוונטיות לצינוריות השומנים הנמצאות בכל מקום בתאים אאוקריוטים. עם זאת, LNTs in vivo הם מבנים מאוד לא שיווי משקל הדורשים אנרגיה כימית ומנועים מולקולריים כדי להרכיב, לתחזק ולארגן מחדש. יתר על כן, ההרכב של LNTs in vivo הוא מורכב, ומורכב ממספר מיני שומנים שונים. שיטות אופייניות להבלטת LNTs הן עתירות זמן ועבודה, והן דורשות פינצטה אופטית, מיקרובים ומיקרופיפטים כדי למשוך בכוח ננו-צינוריות מבועיות ליפידים ענקיות. מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת תנועתיות הגלישה (GMA), שבה רשתות LNT בקנה מידה גדול נוצרות במהירות מבועיות ענק חד-שכבתיות (GUVs) באמצעות תנועתיות מיקרוטובולים המופעלות על ידי קינזין. באמצעות שיטה זו, רשתות LNT נוצרות ממגוון רחב של פורמולציות שומנים המחקות את המורכבות של LNTs ביולוגיים, מה שהופך אותן לשימושיות יותר ויותר למחקרים חוץ גופיים של ביופיסיקה של שומנים ותחבורה הקשורה לממברנה. בנוסף, שיטה זו מסוגלת לייצר באופן אמין רשתות LNT בזמן קצר (<30 דקות) באמצעות ציוד מעבדה נפוץ. מאפייני רשת LNT כגון אורך, רוחב ומחיצות שומנים ניתנים גם לכוונון על ידי שינוי הרכב השומנים של ה- GUVs המשמשים לייצור הרשתות.

מבוא

ייצור רשתות ננו-צינוריות שומנים (LNT) מעורר עניין גובר בבדיקה חוץ גופית של מבנים שומניים ללא שיווי משקל ^1,2,3. תאים משתמשים בצינוריות ליפידים להובלה מפוזרת של חלבונים⁴ וחומצות גרעין⁵, כמו גם תקשורת בין תאים לתא ^6,7. הרשתית האנדופלסמית ומנגנון גולג'י מעניינים במיוחד, שכן אברונים אלה הקשורים לממברנה הם המיקומים העיקריים לסינתזת שומנים וחלבונים, כמו גם להובלה של ביומולקולות אינטגרליות אלה בתוך הציטופלסמה של תא ^8,9. הממברנות של אברונים אלה מורכבות ממיני שומנים מרובים כולל ספינגולפידים, כולסטרול ופוספוליפידים¹⁰ שבסופו של דבר עוזרים להגדיר את הפונקציונליות שלהם. לפיכך, כדי לשכפל ולחקור בצורה הדוקה יותר את האברונים הללו, יש לייצר LNTs במבחנה משלפוחית עם נוסחאות שומנים מורכבות יותר ויותר¹¹.

בועיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות באופן נרחב לחקר התנהגות קרום השומנים מכיוון שניתן לסנתז אותן באופן אמין עם פורמולציות מורכבות הכוללות כולסטרול, פוספטידילכולין (PC), פוספטידיל-ילתנולמין (PE), פוספטידיל-סרין (PS) ופוספטידילינוזיטול (PI)^12,13. מתוארת כאן שיטה לייצור LNTs מ- GUVs עם נוסחאות ליפידים משתנות באמצעות בדיקת תנועתיות גלישה (GMA), שבה LNTs מובלטים על סמך העבודה המבוצעת על ידי מנועי קינזין וחוטים מיקרוטובולים הפועלים על גבי GUVs. במערכת זו, חלבונים מוטוריים של קינסין נספגים אל פני השטח מניעים מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה, וממירים אנרגיה כימית מהידרוליזה של ATP לעבודה שימושית (במיוחד, שחול של LNTs משלפוחיות ביוטינילציה)¹¹. רשת LNT המתקבלת מספקת פלטפורמת מודל לחקר ההשפעות של ההבדלים בשלבי השומנים על שינויים במורפולוגיה של LNT.

בקצרה, חלבונים מוטוריים של קינזין מוכנסים לתא זרימה בתמיסה המכילה קזאין, המאפשרת את ספיגת המנועים על פני הזכוכית של התא. לאחר מכן, מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה בתמיסה המכילה ATP זורמים דרך התא ומותר להם להיקשר למנועי הקינזין ולהתחיל בתנועתיות. לאחר מכן מכניסים תמיסת סטרפטווידין לתוך התא ומאפשרים לה להיקשר באופן לא קוולנטי למיקרוטובולים. לבסוף, GUVs המכילים שומנים ביולוגיים מוכנסים לחדר ונקשרים למיקרוטובולים המצופה סטרפטווידין, ולאחר מכן מוציאים LNTs ליצירת רשתות בקנה מידה גדול במהלך 15-30 דקות. שיטה זו מייצרת רשתות LNT גדולות ומסועפות באמצעות ציוד מעבדה וריאגנטים סטנדרטיים בעלות נמוכה¹¹.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות מיקרוטובול מלאי

אזהרה: תמיד יש לענוד משקפי בטיחות, כפפות ומעיל מעבדה לאורך כל הפרוטוקול.

1. הכן 5x BRB80 buffer: הוסף 24.19 גרם של PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-חומצה אתאנסולפונית]) ו-0.38 גרם של EGTA (אתילן גליקול-ביס[אתר β-אמינואתיל]-N,N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית) לבקבוק זכוכית בנפח 1 ליטר. הוסף 1 מ"ל של 1 M MgCl₂ והתאם את ה- pH ל- 6.9 עם KOH. הוסיפו מים שעברו דה-יוניזציה כדי להביא את התמיסה לנפח סופי של 500 מ"ל.
2. הכן 100 mM מלאי של פתרון GTP: לשקול 52 מ"ג של GTP ולהשעות 1 מ"ל של מים מזוקקים. חלקו תמיסת 100 mM ל-20 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. הכן פתרון GPEM: לערבב 200 μL של 5x BRB80, 10 μL של 100 mM GTP פתרון, 100 μL של 100% גליצרול, ו 600 μL של מים deionized. חלקו את תמיסת ה-GPEM ב-100 μL ב-100 מעלות צלזיוס ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. הכן תמיסת מיקרוטובול על ידי שחזור בקבוקונים של טובולין ליופילי זמין מסחרית (בקבוקון אחד כל אחד של ביוטינילציה, מסומן פלואורסצנטית וללא תווית) בתמיסת GPEM קרה (4 °C) לריכוז מלאי של 5 מ"ג / מ"ל.
5. בצע פילמור של מיקרוטובולים על ידי ערבוב של 4 μL של טובולין ביוטינילי, 4 μL של טובולין המסומן בפלואורסצנטיות, ו-24 μL של טובולין ללא תווית (כולם בריכוזים של 5 מ"ג/מ"ל) כדי ליצור יחס של 1:1:6 בנפח סופי של 32 מ"ל. שמור אותו על קרח. מחלקים את תערובת טובולין ל-2 μL aliquots ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
   הערה: פילמור יעיל דורש שריכוז הטובולין יהיה שווה לריכוז הקריטי (5 מ"ג/מ"ל)^{14 או מעליו}. כאן, הבחירה של יחס טובולין מותאמת לריכוז מספיק של טובולין ביוטינילציה כדי לקשור ביעילות סטרפטווידין ו- GUVs, כמו גם ריכוז מספיק של טובולין פלואורסצנטי לאפיון מיקרוסקופי.

2. הכנת שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs)

1. הכנת סרט אגרוז
   הערה: פרוטוקול זה מותאם מ- Greene et ^al.15.
   1. הכינו תמיסה של 1% w/v על ידי ערבוב של 1 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בבקבוקון Erlenmeyer של 250 מ"ל. השתמשו במיקרוגל סטנדרטי כדי לחמם את תמיסת האגרוס למשך 1-2 דקות.
      הערה: הפתרון יהפוך שקוף ברגע שהאגרוז יתמוסס לחלוטין. אפשרו לתמיסה להתקרר ל-65-75 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
   2. השתמש בקצה פיפטה חתוך של 1,000 μL כדי לתמיסת פיפטה 300-400 μL של אגרוז על מכסה זכוכית בגודל 25 מ"מ x 25 מ"מ. תוך כדי החזקת קצה הכיסוי באצבעות עם כפפות, השתמש בקצה פיפטה נוסף של 1,000 μL כדי לפזר את האגרוס המומס באופן שווה על פני הכיסוי.
      הערה: שמירה על האגרוז בטמפרטורה של 65-75 מעלות צלזיוס תאפשר התפשטות יעילה על משטח הכיסוי.
   3. מייבשים את הכיסויים המצופים באגרוז באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות, ואז האגרוז יהפוך לשקוף. אחסנו את הכיסויים על ידי הצבת המשטח המצופה באגרוז הפונה כלפי מעלה על משטח נקי כגון נייר ללא מוך או סרט מבוסס שעווה בטמפרטורת החדר (RT).
2. נוסחת ליפידים
   1. שלפו ליפידים המומסים בכלורופורם ממקפיא של -20 מעלות צלזיוס והניחו אותם במכסה אדים כימי עד שהם מגיעים ל-RT.
   2. חשב את נפח מלאי השומנים של כל רכיב שומנים הדרוש לפורמולה באמצעות הנוסחה הבאה:
      
      כאשר: _שומנים V הוא נפח השומנים לשימוש, mol % הוא האחוז הטוחן של מרכיב השומנים, n הוא המספר הכולל של שומות של שומנים המשמשים בפורמולה, ו- M הוא ריכוז השומנים ביחידות טוחנות.
      הערה: לדוגמה, אם משתמשים בפורמולציה המכילה 45 מול% 1,2-דיוליאויל-sn-גליצרו-3-פוספוצולין (DOPC) עם ריכוז תמיסת מלאי של 12.72 mM, ו-1 מיקרומול של סך השומנים בפורמולציה, נפח מלאי DOPC המשמש בפורמולציה יהיה:
      
   3. מערבבים את השומנים יחד ביחס המחושב בבקבוקון זכוכית במכסה האדים הכימי.
   4. פיפטה 30 μL של תמיסת ליפידים על הכיסויים המצופה באגרוז על צלחת חמה מחוממת מראש הממוקמת מעל נקודת ההיתוך של מרכיב השומנים הרוויים של הפורמולה (למשל, צלחת חמה של 50 מעלות צלזיוס עבור ליפיד עם T_m של 40 מעלות צלזיוס).
   5. מפזרים את התמיסה על פני סרט האגרוס בתנועה מעגלית באמצעות הקצה הארוך של מחט של 18 גרם עד שהכלורופורם התאדה ונוצרה שכבה אחידה של שומנים. החזיקו את קצה הכיסוי באצבעות עם כפפות תוך כדי ביצוע שלב זה.
      הערה: יש להקפיד שלא לפגוע בשכבת האגרוס עם המחט.
   6. מניחים את הכיסוי בשכבת אגרוז וסרט שומנים בצלחת פטרי מכוסה בנייר אלומיניום, צד הסרט פונה כלפי מעלה, ומניחים את צלחת הפטרי במייבש ואקום למשך 2 שעות לפחות כדי להסיר ממס שיורי.
3. בינתיים, להכין 560 mM תמיסת סוכרוז על ידי ערבוב 1.92 גרם של סוכרוז עם 10 מ"ל של מים deionized.
   הערה: הריכוז של תמיסת הסוכרוז תלוי באוסמולריות של ה- GUVs של החיץ המדוללים פנימה. בדרך כלל, האוסמולריות של תמיסת הסוכרוז צריכה להיות גדולה בלא יותר מ-10% מהמאגר שבו מדולל ה-GUVs, במיוחד מאגר התנועתיות (ראו שלב 3.11).
4. היווצרות GUV
   1. הדביקו את תא ההדבקה על הכיסוי המצופה בסרט השומנים על ידי לחיצה עדינה של תא הדבקה על מכסה השומנים המצופה בשומנים כאשר סרט השומנים פונה כלפי מעלה, מה שמבטיח יצירת אטימה הדוקה.
   2. הוסף 400 μL של תמיסת סוכרוז 560 mM (שהוכן בשלב 2.3) לתא.
   3. מניחים את הכיסויים בתא הלחות וסוגרים את המכסה.
   4. מניחים את תא הלחות על פלטה חמה שחוממה מראש מעל נקודת ההיתוך של מרכיב השומנים הרוויים של הפורמולה.
   5. אפשרו לשלפוחית להיווצר במשך ≥1 שעות לפני ההתאוששות.
      הערה: ניתן לבדוק את היווצרות השלפוחית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם עדשת אוויר אובייקטיבית פי 40.

3. הכנת מניות בדיקת תנועתיות וריאגנטים

1. הכנת מלאי קזאין
   1. מוסיפים 3 גרם של קזאין יבש לצינור צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל, ואז מוסיפים 30 מ"ל של 1x BRB80 ומסובבים עד שהתמיסה הופכת לצמיגות. צנטריפוגה הצינור ב 15,000 x g במשך 30 דקות.
   2. מעבירים את הסופרנטנט לתוך שפופרת צנטריפוגה חרוטית נוספת של 50 מ"ל ומשליכים את הכדור. סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 1 מיקרומטר, ואסף את התמיסה בבקבוקון חרוטי של 50 מ"ל. סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר, ואסף את התמיסה בבקבוקון חרוטי של 50 מ"ל.
   3. קבע את ריכוז החלבון על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis וקוורץ קובט.
   4. חשב את ריכוז הקזאין במ"ג/מ"ל באמצעות הנוסחה הבאה:
      
   5. דיללו את התמיסה ל-20 מ"ג/מ"ל ב-1x BRB80, חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. הכינו תמיסת מלאי של גלוקוז אוקסידאז (2 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב של 2 מ"ג של גלוקוז אוקסידאז עם 1 מ"ל של 1x BRB80. חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. מכינים תמיסת ציר קטלאז (0.8 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב של 0.8 מ"ג קטלאז עם 1 מ"ל של 1x BRB80. חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. הכן 2 M תמיסת גלוקוז על ידי השעיה של 0.3 גרם של D-גלוקוז ב 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
5. הכן 100 mM DTT מלאי על ידי השעיית 0.015 גרם של DTT ב 1 מ"ל של מים deionized. חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
6. הכן מלאי של 100 mM Mg-ATP על ידי השעיית 0.055 גרם של דיסודיום ATP בתמיסת 1 מ"ל של 100 mM MgCl₂. חלקו ל-100 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
7. הכן פתרון 100 mM Mg-AMP-PNP על ידי השעיה של 0.055 גרם של AMP-PNP בתמיסת 1 מ"ל של 100 mM MgCl₂, ולאחר מכן חלק ל- 100 μL aliquots ואחסן ב - 20 ° C.
8. הכן תמיסת 100 mM Trolox על ידי הוספת 25.03 מ"ג של Trolox ל-1 מ"ל של מתנול ואחסן בטמפרטורה של -20 °C (76 °F).
9. הכינו תמיסת סטרפטווידין של 10 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ג סטרפטווידין ל-100 מיקרול'ל של BRB80, ואז חלקו ל-2 אליקוטים של μL ואחסנו בטמפרטורה של -80ۛ מעלות צלזיוס.
10. הכן BRB90CAT על ידי ערבוב של 200 μL של 5x BRB80, 20 μL של תמיסת קזאין, 10 μL של תמיסת MgATP, 10 μL של Trolox, 5 μL של תמיסת paclitaxel, ו 765 μL של מים DI. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. הכן את תמיסת התנועתיות על ידי ערבוב של 192 μL של BRB80CAT, 2 μL של תמיסת D-גלוקוז, 2 μL של תמיסת גלוקוז אוקסידאז, 2 μL של תמיסת DTT ו- 2 μL של תמיסת קטלאז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
12. הכן תמיסת קינסין של 1 μM על-ידי דילול תמיסת הקינזין ב- BRB80CAT (לדוגמה, 2 μL של תמיסת קינסין של 50 mM ב- 98 μL של BRB80CAT) ושמור ב- 4 °C .
13. הכינו תמיסת מיקרוטובול של 10 מיקרוגרם/מ"ל על ידי דילול 10 μL של מיקרוטובולים מיוצבים ב-90 μL של טמפרטורת החדר BRB80CAT. יש לאחסן ב-RT.
14. הכינו תמיסת סטרפטווידין של 10 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת תמיסת סטרפטווידין של 10 מ"ג/מ"ל ב-99.9 מיקרול' של תמיסת תנועתיות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
15. הכן פתרון GUV של 12x על-ידי דילול 5 μL של מלאי GUV לפתרון תנועתיות של 55 μL. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
16. פילמור של טובולין למיקרוטובולים
    1. לאסוף 2 μL aliquot מוכן מראש של tubulin מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס (מוכן בשלב 1.5) ולהניח לתוך אמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות.
    2. הכן תמיסת 2 mM paclitaxel על ידי הוספת 1.71 מ"ג של פקליטקסל ב 1 מ"ל של DMSO נטול מים, לחלק ל 10 μL aliquots, ולאחסן ב -20 °C (76 °F).
    3. הכן טרי BRB80T על ידי ערבוב 99.5 μL של 1x BRB80 עם 0.5 μL של 2 mM paclitaxel.  חם 100 μL של BRB80T עד 37 °C באמבט המים.
    4. לאחר 30 דקות, מוסיפים את ה-100 μL של BRB80T לטובולין אליקווט כדי לייצב את המיקרוטובולים. יש לאחסן ב-RT.

4. בדיקת תנועתיות גלישה (GMA)

1. הכינו תא זרימה על ידי הצמדת שתי רצועות של סרט דו-צדדי המופרדות ב-5 מ"מ על מגלשת זכוכית. חזרו על תהליך זה עד ששלוש שכבות של סרט הדבקה מרכיבות כל רצועה.
2. מניחים כיסוי על גבי הקלטת, ואז לוחצים בעדינות על ממשק הכיסוי/סרט הדבקה עם פינצטה או עט כדי להבטיח הידבקות מספקת.
   הערה: רוחב הערוץ צריך להיות 5 מ"מ על 25 מ"מ אורך על 300 מ"מ גובה.
3. פיפטה 30 μL של תמיסת קינסין 1 מ"מ (הוכן בשלב 3.12) לתוך תא הזרימה ולתת לו לדגום במשך 5 דקות.
   הערה: הקזאין יוצר דו-שכבתי על פני השטח של מגלשת הכיסוי/זכוכית ומאפשר חיבור של זנב הקינזין לפני השטח.
4. פיפטה 30 μL של תמיסת מיקרוטובול 10 מיקרוגרם/מ"ל (שהוכנה בשלב 3.13) לתוך תא הזרימה, באמצעות מגבון מעבדה שנלחץ בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי תמיסות. אינקובציה למשך 5 דקות
5. שטפו את תא הזרימה 1x-3x עם תמיסת תנועתיות פי 1 ב-RT (שהוכנה בשלב 3.11).
   הערה: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות מטרת אוויר פי 40 עשויה לשמש בנקודה זו כדי לאשר חיבור מיקרוטובולים ותנועתיות. מיקרוטובולים מופיעים כחוטים פלואורסצנטיים (באורך של עשרות מיקרונים) הנעים (גולשים) על פני השטח במהירות של כ-0.5 מיקרומטר לשנייה (איור 1).
6. פיפטה 30 μL של תמיסת סטרפטווידין של 10 מיקרוגרם/מ"ל (שהוכנה בשלב 3.14) לתוך תא הזרימה באמצעות ניגוב מעבדה שנלחץ בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. דגירה למשך 10 דקות
7. זרימה 30 μL של תמיסת GUV 12x (שהוכנה בשלב 3.15) לתוך הזרימה באמצעות מגבון מעבדה שנלחץ בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. דגירה למשך 30 דקות.
8. הוסף 2 μL של תמיסת AMP-PNP של 100 mM (שהוכן בשלב 3.7) כדי לעצור את התנועתיות, ולאחר מכן אטום את התא בחומר איטום.

5. אפיון רשת LNT

1. העבר את תא הזרימה למיקרוסקופ הפוך להדמיה.
2. בחר את ערכת המסנן המתאימה בהתבסס על אורכי הגל של השומנים הפלואורסצנטיים או טובולין שבהם נעשה שימוש. לדוגמה, בעת שימוש בשומנים בעלי תווית אדומה של טקסס, השתמש במסנן עירור של 560 ננומטר/25 ננומטר ובמסנן פליטה של 607 ננומטר/36 ננומטר.
3. השתמש במטרה של שמן פי 100 כדי להתמקד בפני השטח של הכיסוי.
4. דמיינו את רשתות ה-LNT באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
   הערה: LNTs הם מבנים ליניאריים היוצאים מהבועיות הגדולות יותר. LNTs קטנים בהרבה מ-GUVs ובעלי אותות פלואורסצנטיים חלשים יותר. לפיכך, יש להתאים את החשיפה והניגודיות בהתאם ל- LNTs של התמונה. התאמות אלה מובילות גם לחשיפת יתר של ה- GUVs, ולכן, מומלץ לאפיין את הלמלריות והפרדת הפאזות ב- GUVs באופן עצמאי.
5. מקד את המיקרוסקופ ברשת של עניין וצלם תמונה סטנדרטית או מרוצפת.
6. התאם את זמן החשיפה ואת מסנני הצפיפות הנייטרליים כדי לצלם את ה-LNTs ולמזער את החשיפה הרוויה של ה-GUVs. רכוש תמונות הן בערוצים אדומים והן בערוצים ירוקים.
   הערה: כאן, הערוץ האדום מאפשר הדמיה של השומנים טקסס-אדומים, בעוד שהתעלה הירוקה מאפשרת הדמיה של המיקרוטובולים (למשל, שומנים ירוקים של אורגון וצבעי HiLyte488).
7. צור תמונה מורכבת על-ידי כיסוי של הערוצים האדומים והירוקים (איור 1).
8. אפיון רשתות LNT על ידי מדידת אורך LNT
   1. פתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות כגון ImageJ.
   2. כייל את קנה המידה של המיקרוסקופ באמצעות תכונת קנה המידה שנקבע, מלא את הפיקסלים למקדם ההמרה של מ"מ ולחץ על אישור.
      הערה: מקדם ההמרה תלוי במיקרוסקופ, בעדשה האובייקטיבית ובמצלמה, וניתן להשיג אותו באמצעות שקופית כיול מיקרוסקופית. הוא מתבטא בדרך כלל בפיקסלים/מ"מ.
   3. השתמש בכלי קו Multipoint כדי למדוד את אורך הננו-צינוריות החל מ- GUV האב. החזק Ctrl +M כדי למדוד את האורך.
   4. המשך למדוד את אורכי הצינורות הבודדים בהתאם לשלבים לעיל. כלי עיבוד התמונה ישמור כל מדידה חדשה בחלון התוצאות.
   5. החזק Ctrl + D לאחר ציור כל קו כדי לעקוב אחר הצינורות שנמדדו.
9. מדידת עובי LNT (איור 2)
   1. פתח את התמונה ב- ImageJ ובחר את התכונה 'סף' תחת הכרטיסיה תמונה .
   2. לחץ על החל כדי להחיל את הסף.
   3. ציירו מלבן באורך ידוע מעל הצינור הרצוי (לפיקסלים שחורים יש ערך של 0, ולפיקסלים אדומים יש ערך של 255).
   4. מדוד את הצפיפות המשולבת של השטח.
   5. חלקו את הצפיפות באורך (בפיקסלים) של ה-LNT כדי לקבל את העובי (בפיקסלים).
      הערה: ניתן להשוות את מדידות העובי בין תמונות רק כאשר הגדרות ההדמיה והסף מוגדרים באופן זהה.
10. קביעת חלוקת השומנים בצמתים של LNTs (איור 3)
    1. פתח את התמונה ב- ImageJ.
    2. השתמש בכלי קו כדי לצייר קו מעל הצומת הרצוי.
    3. מדוד את עוצמת הצומת הן בערוצים הירוקים של אורגון והן בערוצים האדומים של טקסס.
    4. העבר את הקו ל-LNT ומדוד את עוצמת ה-LNT הן בערוצים הירוקים של אורגון והן בערוצים האדומים של טקסס.

תוצאות

רשתות LNT (איור 4) יוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר, המשתמש בעבודה המבוצעת על ידי הובלת קינסין של מיקרוטובולים כדי להוציא LNTs מ-GUVs. בקצרה, GUVs הוכנו באמצעות התייבשות ג'ל אגרוז באמצעות תמיסת סוכרוז, ומיקרוטובולים פוזלו בתמיסת GPEM והתייצבו ב- BRB80T. לאחר מכן, מנועי קינסין הוכנסו לתא זרימה היוצרים שכבה פעילה של מנועים על פני השטח של הכיסוי. לאחר מכן הוכנסו מיקרוטובולים והווספה תמיסת סטרפטווידין, מה שאיפשר קשירת קשר בין השומנים הביוטינילטיביים לבין ה-GUVs (שהוכנסו לאחר מכן).

דיון

רשתות LNT הן כלי שימושי למחקרים במבחנה לתכונות הממברנה ולהובלת ביומולקולות כגון חלבוני טרנס-ממברנה. יתר על כן, שימוש בפורמולות ליפידים מורכבות לייצור רשתות LNT מאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. מחקרי ייצור אחרים השתמשו ב-1) ניסוחי ליפידים פשוטים ושלפוחיות מולטי-למלר או 2) טכניקות תנועתיות מסורבלות יותר לייצור רשתות מ-GUVs המורכבים מנוסחמות שומנים מורכבות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת ייצור יעיל של רשתות LNT בקנה מידה גדול מפורמולציות שומנים ו- GUVs מורכבים ושימוש בריאגנטים וציוד זולים. ככזו, מתודולוגיה זו מציעה את...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100x/1.4 צמצם מספרי טבילה שמן מטרה	אולימפוס	1-U2B836	אולימפוס UPlanSApo 100x/1.40 שמן אובייקט אינסוף מתוקן, RMS חוט מרחק עבודה 0.12 מ"מ
3.0 ND מסנן	אולימפוס		צפיפות ניטרלית מסנן
AMP-PNP	סיגמא-אולדריץ'	A2647	(β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 סט מסננים	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	סט מסנני BrightLine Pinkel, מותאם ל-DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 ואחרים כמו פלואורופורים, מוארים במקורות אור מבוססי LED
קזאין	סיגמא-אולדריץ'	22090	קזאין הידרוליזט למיקרוביולוגיה
קטלאז	סיגמא-אולדריץ'	C9322	קטלאז מכבד בקר
כלורופורם	סיגמא-אולדריץ'	288306	כלורופורם נטול מים מכיל 0.5-1.0% אתנול כמייצב
כולסטרול	Avanti	700000P	כולסטרול (צמר בקר, >98%) (אבקה)
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7021	D-(+)-אבקת גלוקוז, BioReagent, מתאים לתרבית תאים, מתאים לתרבית תאי חרקים, מתאים לתרבית תאי צמחים, ≥ 99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (בכלורופורם)
DOPE-ביוטין	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (מלח נתרן)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (אבקה)
DPPE-ביוטין	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (מלח נתרן)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Dithiothreitol Solution 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, חומצה אגטזית, אתילן-ביס(אוקיאתילנניטרילו)חומצה טטראצטית, גליקול אתר דיאמין, חומצה טטראצטית,
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא-אולדריץ'	G6125	גלוקוז אוקסידאז מ-Aspergillus niger סוג II, ≥ 10,000 יחידות/גרם מוצק (ללא תוספת חמצן)
גליצרול	פישר	G33	גליצרול (מאושר ACS), פישר כימיקל
GTP	סיגמא-אולדריץ'	G8877	גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט נתרן מלח הידרט
IX-81 מיקרוסקופ אולימפוס	אולימפוס	N/A	IX81 מיקרוסקופ הפוך מבית אולימפוס
KOH	סיגמא-אולדריץ'	1050121000	אשלגן הידרוקסיד
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	M1028	1.00 M תמיסת מגנזיום כלוריד
אורקה פלאש 4.0 מצלמה דיגיטלית	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 מצלמת CMOS דיגיטלית
אורגון ירוק-DHPE	Invitrogen	O12650	אורגון ירוק 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher		P3456	פקליטקסל (שווה ערך לטקסול) - לשימוש במחקר בלבד
PIPES	חומצה סיגמא-אולדריץ	P6757	1,4-פיפרזיןדיאטנאנסולפונית, פיפרזין-1,4-ביס(חומצה 2-אתנסולפונית), פיפרזין-N,N&פריים;-ביס(חומצה 2-אתנסולפונית)
טקסס אדום-DHPE	Invitrogen	T1395MP	טקסס אדום 1,2-דיהקסדקנויל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולמין, מלח טריאתילאמוניום
טרולוקס	סיגמא-אולדריץ'	238813	(±)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסילית
טובולין, שלד ציטוטיני ביוטין		T333P	חלבון טובולין (ביוטין) מוח חזירי
טובולין, Hy-Lite 488	שלד ציטו	TL488M	חלבון טובולין (פלואורסצנטי HiLyte 488) מוח חזירי
טובולין, ללא תווית	שלד ציטו	T240	חלבון טובולין מוח חזירי