מאמר שיטה

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

DOI:

10.3791/60912

⸱

9 בפברואר 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במערכת העצבים המרכזית, oligodendrocytes הפוך ידועים בתפקידם ב אקסון מיאלונציה, האיצה את התפשטות הפוטנציאל של הפעולה באמצעות הולכה מוכרת. יתר על כן, מספר גדל והולך של דיווחים מראים כי oligodendrocytes הפוך אינטראקציה עם נוירונים מעבר מיאלואידית, בעיקר באמצעות הפרשה של גורמים מסיסים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר טיהור של תאים oligodendroglial היוחסין מתרבויות התאים גליה גם מכיל האסטרוציטים ותאי microglial. השיטה מסתמכת על לילה רועד ב 37 ° c, אשר מאפשר התנתקות סלקטיבית של תאים oligodendroglial ותאי microglial, ואת חיסול של מיקרוגלייה על ידי הדבקה דיפרנציאלית. לאחר מכן נתאר את התרבות של oligodendrocytes הפוך וייצור מדיום ממוזג (OCM). כמו כן, אנו מספקים את קינטיקה של טיפול OCM או oligodendrocytes הפוך נוסף על נוירונים מטוהרים היפוקמאל בניסויים שיתוף תרבות, לימוד אינטראקציות אוליגודנדרוציטים-נוירונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocytes הפוך (OLs) הם תאים גליאל של מערכת העצבים המרכזית (CN) היוצרים גלישת מיאלין סביב axons. OLs מקורם אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (OPCs) אשר מתרבים בתוך האזורים החדרית של ה-CN העובריים ולאחר מכן להעביר ולהבדיל ל-OLs בוגרת לחלוטין (כלומר, מיאלין ויוצרים תאים)1. OPCs הם שופע במהלך התפתחות מוקדמת, אבל גם להתמיד במוח המבוגר שבו הם מייצגים את האוכלוסייה הגדולה מתרבים תאים2. אחד משני מספר אקסונים בחלקים שאינם להתרגש (כלומר, internodes), ואת הקצה של כל לולאה מיאלין מתחבר אקסונים להרכיב את מתחם פרבודאל אשר חיוני עבור תכונות בידוד של מיאלין1,3. בין הפרפרדות ישנם פערים קטנים ללא מיאלואידית המכונים הצמתים של רנייה. צמתים אלה עשירים בערוצי נתרן מגודרת מתח (ניווט), המאפשר התחדשות והתפשטות מהירה של פוטנציאל הפעולה באמצעות הולכה המלח4. זה אינטראקציה הדוקה גם מאפשר לתמיכה באנרגיה סיבי באמצעות ספיגה עצבית של לקטט מ-OLs5,6.

ההבשלה של תאים oligodendroglial השושלת ואת תהליך מיאלונציה מוסדר בחוזקה על ידי האינטראקציות שלהם עם נוירונים7. אכן, OLs ו-OPCs, בשם גם NG2 תאים, לבטא מערך של קולטנים עצביים, והוא יכול לקבל קלט מפני הנוירונים והדיכוי הדיכוי, המאפשר להם לחוש פעילות עצבית שיכולה לעורר את התפשטות שלהם ו/או בידול לתאים מיאלואידית2. בתורו, opcs/OLs להפריש מיקרושלפוחיות וחלבונים לתוך החלל מתוך מסחטות אשר בלבד או סינגיסיסטי מתווך neuromodulative ופונקציות נוירוגינים8,9,10,11,12. עם זאת, מנגנונים מולקולריים שליטה על מצבים מרובים של אינטראקציות בין תאי השושלת oligodendroglial ונוירונים עדיין להיות מפוענח לחלוטין.

כמו-כן, במספר מצבים פתולוגיים, מושפעות בעיקר, ובכך מטרידים את האינטראקציה שלהם עם נוירונים. למשל, טרשת נפוצה (MS), תפקוד נוירולוגי נגרמת על ידי deמיקוד מוקד ב-cn, משני לאובדן OLs שיכול להוביל לנזק סיבי הצטברות נכות קשורה. מחדש יכול להתרחש, אם כי לא מספיק ברוב המקרים13. התקדמות בעשור האחרון, בשל התפתחות של טיפולים חיסוני, יש להפחית את שיעור הנסיגה אבל לקדם את השרידים מיאלונציה כדי לצאת הצורך בלתי מתקיים. ככזה, הבנה טובה יותר של התפקידים, פונקציות והשפעות הוא עניין מיוחד לפיתוח של טיפולים חדשים לספקטרום רחב של תנאי ה-CN.

כאן, אנו מתארים את שיטות הטיהור והתרבות של הולים. הדבר מאפשר בדיקה מדויקת של מנגנונים פנימיים המסדירים את התפתחותם ואת הביולוגיה. בנוסף, מאוד מועשר בתרבויות מסוג OLs מאפשרים ייצור של בינוני ממוזג (OCM), אשר ניתן להוסיף לתרבויות נוירונים מטוהרים כדי לקבל תובנה לתוך ההשפעה של גורמים מופרשים על פיזיולוגיה נוירואליות וקישוריות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד ליישם במערכת תרבות שיתוף מחוץ לגוף החברה שבו מטוהרים oligodendrocytes הפוך ונוירונים משולבים יחד, המאפשר לטפל במנגנון הוויסות (re) מיאלונציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול והשימוש בחולדות בניסוי זה תואמים למדיניות ולהנחיות המוסדיים (UPMC, INSERM, והוראת מועצת הקהילה האירופית 86/609/EEC). הפרוטוקול הבא מבוסס על המלטה הסטנדרטית של 12 גורים.

1. הכנת מבחנות (~ 5 דקות)

הערה: בצע את השלבים הבאים ביום שלפני הניתוח בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. מעיל 150 ס"מ2 מבחנות (T150) עם כובע מסנן (1 בקבוקון עבור 2 גורים) באמצעות 5 מ ל פוליאתילן (פיי, 100 Mg/L, ראה פרוטוקול בקובץ משלים 1).
  2. לאחסן את מבחנות ב 4 ° c בלילה.
  3. לשטוף צלוחיות מצופה 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי ביום של ניתוח.

2. הכנת מדיה (~ 10 דקות)

הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. להכין 500 mL של בינוני התרבות, המורכב של מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו פניצילין-סטרפטומיצין (100 IU/mL).
  2. להכין 20.6 ml של העיכול האנזים בינוני בצינור 50 ml, המורכב 20 מ ל של dmem, 200 μl של dnase (50 μg/ml), 200 μl של פפאין (30 U/ml) ו-200 μl של l-cysteine (0.24 mg/ml).
  3. סינון-לחטא את המדיה באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
  4. השאר את המדיה במכסה הזרימה הלבינארי בטמפרטורת החדר (RT) עד לחיתוך.

3. הכנה לחיתוך (~ 10 דקות)

הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS; 1x). סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
  2. להכין 50 mL של הקרח קר 1x PBS הפתרון שיושלם עם 750 μL של 45% גלוקוז. סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
  3. ממלאים צלחת פטרי 100 מ"מ עם PBS 1 x עבור כלי ניקוי ו 3 60 מ"מ מנות פטרי עם הקרח קר PBS-גלוקוז לקצירת רקמות. שימי את צלחות הפטרי. על הקרח עד לניתוח

4. חיתוך והרכבה

הערה: הניתוח מבוצע מפני כלבלבים של גברים ונשים ביום אחרי הלידה (P) 2.

  1. על מנת לספק סביבה סטרילית, ודא לנקות את הספסל עם 100% אתנול. לחטא את כל כלי הניתוח עם 100% אתנול.
  2. בעדינות לרסס את הצוואר של הגור עם 70% אתנול.
  3. השתמש במספריים כירורגיים גדולים כדי לערוף את ראשו של בעל החיים ולהניח את הראש בצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ, המכילה קרח קר-מסוכר-PBS.
  4. השתמש מלקחיים מעוקל כדי לשמור על ראש החיה בגובה העיניים. השתמש במספריים כירורגי קטן כדי ליצור חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות המוח באמצע הקו.
  5. השתמש מלקחיים כדי לקלף בעדינות את שני חלקי הגולגולת מאמצע הקו.
  6. השתמשו בכפית כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחלל הראש. הכניסו את המוח לצלחת פטרי ב60 מילימטר המכילה את הקרח הקר-גלוקוז על הקרח.
  7. הצגת תחת steromicroscope, השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את המוח העורקי, את המוח ואת נורות הריח מהמיאונות מוחין.
  8. השתמש מלקחיים עדינים כדי להפריד בין שתי אונות המוח. השתמש בלקחיים עדינים. כדי לקלף את הקרום שימו את מערבולות המוח. בצלחת 60 מ"מ בקרח
    הערה: הקרח הקר PBS הוא קריטי להסרת הקרומי הקרום הנכון.

5. הדיסוציאציה מרקמת

הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. השתמש באזמל חד כדי לקצוץ. את מסדר המוח להעביר את הרקמה הטחון לתוך צינור 50 mL המכיל מדיום העיכול האנזים.
  2. דגירה של 30 דקות בתוך מחולל לחות בחממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  3. השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להסיר בעדינות את המדיום עיכול האנזים תוך כדי לוודא כי רקמת קליפת העור נשאר בתחתית הצינור 50 mL.
  4. השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להוסיף 1 מ ל של dmem-10% fcs ובעדינות קצוצות את הרקמה.
  5. השתמש מסנן 70 יקרומטר ובוכנה של מזרק 1 mL כדי לסנן את רקמת הקליפת העור לתוך צינור 50 mL.
    הערה: ניתן לשטוף שרידי רקמות על קיר הצינור הפנימי מספר פעמים עם DMEM-10% FCS.
  6. מלאו את צינור 50 mL עם DMEM-10% FCS. צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant והשהה מחדש את הגלולה תא עם 2 מ ל-10% fcs.
  7. בעדינות הטריטורטה עם כp1000 מיקרופיפטה ולאחר מכן עם מיקרופיפטה p200. דלל את ההשעיה של התא בנפח המתאים של DMEM-10% FCS.
    הערה: שני מוחות = 1 T150 = 5 מ ל של DMEM-10% FCS.
  8. צלחת 5 מ ל של השעיה התא על T150 בצפיפות של 1 x 105 תאים/ס"מ2. הוסף 20 מ ל של DMEM חם-10% FCS לכל T150. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  9. לחדש את המחצית של מדיום התרבות לאחר 6 ימים ב-"מתורבת" (DIV) עם DMEM חם 10% FCS.

6. הכנה לטלטול

  1. לבצע הכנה לרעוד ביום לפני לרעוד בתוך מכסה זרם למינארי בתנאים סטרילי.
  2. לחדש מחצית מדיום התרבות על-ידי הוספת מדיום חדש לתרבות חם לתוך הבקבוקון ואת הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2.

7. טלטול

  1. מעיל 3 100 מ"מ מנות פטרי עם פיי. אחסן אותם ב -4 ° c בלילה.
  2. לכסות את כובע מבחנות עם סרט פרפין ולשים את צלוחיות לתוך שקית ניילון. לנער מבחנות המכילות תאים גליה לילה ב 250 rpm ב 37 ° c.
    הערה: הטלטול הראשון מבוצע ב-8 DIV ואחד יכול לבצע עד שלושה מלכים שונים (ראה איור 1 לתזמון).

8. OL תאים השושלת קצירת ותרבות

הערה: יש לבצע צעדים אלה בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. ביום שלאחר הטלטול, הכינו את המדיום בונשטיין-סאטו (BS) לפי שולחן 1.
  2. שוטפים מנות פטרי מצופות 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי.
  3. מבחנות הקציר ' supernatant המכיל בעיקר OL השושלת תאים אבל גם כמה תאים microglial ולוחית אותו על שאינם מצופים 100 mm מנות פטרי.
    הערה: שלב זה מאפשר הסרה של תאים microglial דרך הדבקה מהירה דיפרנציאלית על משטח המנה.
  4. מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.
  5. למלא כל T150 בקבוקון עם 25 מ ל של מדיום התרבות חם טרי מוכן מודטה בחממה מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2 עד הרעד השני.
  6. העבירו את הסופרנטאנט מצלחות פטרי לתוך מנות פטרי חדשות שאינן מצופות 100 מ"מ כדי לאפשר הדבקה של תאי microglial שיורית.
  7. מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.
  8. הסר את הסופרנטאנט, המכיל תאי שושלת היוחסין של OL שאינו חסיד, והעבר אותו לצינורות 50 mL (סופרנטאנט מ -2 מנות פטרי לצינור 50 mL). התעלם מצלחות פטרי מצופה microglia.
  9. צנטריפוגה את הסופרנטאנט במשך 5 דקות ב 423 x g. הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה עם 1 mL של BS בינונית. הבריכה כל כדורי בצינור 50 mL משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 mL עם BS בינונית.
  10. קביעת צפיפות התא לספירת תאים תחת מיקרוסקופ.
    הערה: יש להשיג צפיפות תא בין 3 x 105/ml ו-5 x 105/ml.
  11. הוסף 20 מ ל BS אם צפיפות התא גבוהה יותר או שווה ל-4 x 105/mL כדי לקבל נפח סופי של 30 מ"ל, או להוסיף רק 10 מ ל BS אם צפיפות התא היא פחות מ 4 x 105/ml כדי לקבל נפח סופי של 20 mL.
  12. צלחת שניים או שלושה מצופה מראש 100 מ"מ מנות פטרי עם 10 מ ל של השעיית תאים. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  13. לנקות את ההריסות מן הצלחות פטרי על ידי רענון כל BS בינונית 2 h מאוחר יותר.
    הערה: בדוק את התרבות תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי ניקוי כדי לוודא צפיפות התא ויעילות של הסרת פסולת.
  14. דגירה עבור 2 ימים ב BS בינונית בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
    הערה: בחנו את התרבות שמתחת למיקרוסקופ. המפגש אמור להיות 70% עד 80%.

9. ייצור OCM

הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.

  1. הכיני NB-B27low בינונית לפי שולחן 2.
  2. חידוש בינוני התרבות עם 10 מ ל מדיום חם NB-B27low. דגירה עבור 2 ימים בתוך מחולל החממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  3. לקצור את OCM, כלומר, supernatant המכיל גורמים מופרש OL. סינון-לחטא ocm באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
    הערה: אחסן OCM ב -4 ° c עבור מקסימום 2 חודשים.

10. תוספת OCM

הערה: יש לבצע את הצעדים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. OCM ניתן להוסיף מטוהרים היפוקמאל תרבויות עצב מוכן על פי הפרוטוקול הבא14, ומושגת על ידי הוספת, 24 שעות לאחר בידוד, סוכני anti-mitotic ומקבל 5-fluorאודלדין (5 μm) עבור 36 h.

  1. ב 3 DIV, להסיר את כל בינוני תרבות העצב המכיל anti-mitotic סוכנים ולהוסיף 500 μL של חדש חם OCM.
  2. לחדש חצי בינוני כל 3 ימים עם חם תוצרת NB-B27.
    הערה: ניתן לשמור על תרבויות כאלה עד 21 DIV.

11. הוספת מטהר לתרבות הנוירונים

הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. ניתן להוסיף כלים לתרביות מטוהרים היפוקמאל באותו אופן כפי שמתואר לעיל.

  1. הכינו מדיום לשיתוף התרבות לפי שולחן 3.
  2. לאחזר את התרבות OL ב 70% כדי 80% זרימה. לשטוף עם 2 מ"ל של חם 1x PBS.
  3. כדי לנתק את התאים, הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין לצלחת פטרי 100 מ"מ.
  4. מודטה עבור 5 דקות בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  5. הוסף 2 מ ל של DMEM-10% FCS כדי לחסום את התגובה האנזימטית. לקצור את הסופרנטנט המכיל תאים השושלת OL.
  6. צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant ולהשעות את הגלולה התא במדיום התרבות המשותף חם כדי לקבל ריכוז של 1.25 x10 תאים/ mL.
  7. הוסף OL לתרבות הנוירונים מטוהרים היפוקמאל על ידי הסרת 200 μL של בינוני תרבות העצב והוספת 200 μL של התא ההשעיה לכל טוב (2.5 x 104 תאים/גם) של צלחת 24.
  8. לרענן חצי מדיום שיתוף התרבות כל 2-3 ימים.
    הערה: ניתן לשמור על תרבויות שיתוף עד 24 DIV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, תאים השושלת OL מטוהרים מתרבויות גליה על ידי ניעור האסטרוציטים ו microglia. טוהר הבדיקה פנוטימית של תרבויות OL יכול להיות מוערך על ידי הכתמים עם סמנים גליה15. ניתוח הביטוי של סמנים שונים עולה כי תרבויות OL היו בעיקר pre-OLs עם 90% ± 4% של O4+ תאים, 85% ± 7% NG2+ תאים, ו 4.7% ± 2.1% של plp+ תאים, בעוד 7.2% ± 2.5% של תאים היו gfapו אסטרוציטים (ממוצע ± ש גויטיין, n = 3; איור 2). בנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לקבל מועשר ביותר oligodendroglial היוחסין תרבויות תאים מתרבויות גליה מעורבים, מותאם מתוך שיטה שפורסמה בעבר16, ואת הייצור הבא של מדיום ממוזג. טכניקה זו רועדת לא יקר, ניתן לחזור שלוש פעמים והוא אופטימלי להשיג כמות גבוהה של מטוהרים מטוהר, כמו תאים התרבותי בבונשטיין-סאטו (BS) בינוני המכיל PDGFα מתרבים. התאים glial מוכנים באמצעות מוחין של חולדות Wistar ב P2, נקודת זמן שבה רוב המכריע של התאים הoligodendroglial השושלת הם pre-oligodendrocytes הפוך להביע NG2 ו O4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מתחרים או אינטרסים סותרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לרמי רוננזנו על עצתו הנבונה בעריכת כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי ICM, INSERM, מענק הקרן ARSEP כדי NSF, ו-Bouvet-Labruyère מחיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תוסף 5-fluorodeoxyuridineSigmaF0503
B27ThermoFisher17504044
D-(+)-תמיסת גלוקוזSigmaG8769
DNase (Deoxyribonuclease I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
אתנול 100% Sigma32221-M
אתנול 70%VWR Chemicals83801.360
סרום עגל עובריThermoFisher10082147
L-ציסטאיןסיגמאC7352
NeuroBasalThermoFisher21103049
פפאיןוורת'ינגטוןLS003126
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher15140122
תמיסת מלח חומצה פוספט ללא סידן ומגנזיוםThermoFisherA1285601
פוליאתילנימין (PEI)SigmaP3143
Tetraborate decahydrateSigmaB9876
TrypsinSigmaSigma
UridineSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin HumanSigmaT1147
BSA (אלבומין סרום בקר)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher15140122
פרוגסטרוןסיגמאP8783
פוטרסין דיהידרוכלורידסיגמאP5780
נתרן סלניטסיגמאS5261
T3 (מלח נתרן 3,3',5-טריודו-L-תירונין)סיגמאT6397
T4 ( L-תירוקסין)סיגמאT1775
<חזק>קו-תרבית מדיה
אפו-טרנספרין אנושיתסיגמאT1147
B27 תוסףThermoFisher17504044
ביוטיןסיגמאB4639
BSA (אלבומין סרום בקר)סיגמאA4161
סרולופלסמיןסיגמא239799
ThermoFisher31966021
הידרוקורטיזוןסיגמאH4001
אינסוליןסיגמאI5500
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמאA8199
NeuroBasalThermoFisher21103049
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher15140122
פרוגסטרוןסיגמאP8783
פוטרסיןסיגמאP5780
רקומביננטי אנושי CNTFסיגמא450-13
נתרן סלניטסיגמאS5261
T3 (מלח נתרן 3,3',5-טריודו-L-תירונין)סיגמאT6397
ויטמין B12SigmaV6629
<חזק>כלים
0.22 ומיקרו; m פילטרSartorius514-7010
1 מ"ל מזרקTerumo1611127
100 מ"מ צלחת פטריDutscher193100
צינור 15 מ"לקורנינג מדעי החיים734-1867
צינור 50 מ"לקורנינג מדעי החיים734-1869
צלחת פטרי 60 מ"מDutscher067003
70 & מיקרו; m filterMiltenyi Biotec130-095-823
מיקרוסקופ משקפתאולימפוסSZX7
מלקחיים מעוקליםכלי מדע עדינים11152-10
מלקחיים עדיניםכלי מדע עדינים91150-20
מספריים כירורגיים גדוליםכלי מדע עדינים14008-14
אזמלסוואן-מורטון233-5528
ShakerInfors HT
מספריים כירורגיים קטניםFine Science Tools91460-11
כף כירורגית קטנהבר נאור בע"מBN2706
T150 ס"מ2 בקבוק עם מכסה פילטרDutscher190151
Animal
P2 Wistar עכברושJanvierRjHAn:WI
תזונה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
  2. Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
  3. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  4. Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
  5. Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
  6. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
  7. Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  8. Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
  9. Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).
  10. Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
  11. Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).
  12. Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222(2015).
  13. Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
  14. Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
  15. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
  16. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  17. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  19. Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
  20. Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
  21. Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
  22. Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
  23. Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573(2019).
  24. Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
  25. Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
  26. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  27. Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bottenstein SatoO4NG2

מאמרים קשורים