בניסוי זה, עכבר מוזרק בווריד הזנב שלו עם רודמין B isothiocyanate-dextran שיכול להכתים כלי דם. לאחר שהכבד נחשף ומתוקן, ניתן לבחור חלק מסוים של הכבד כדי להתבונן ברקמה העמוקה בגוף החי באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תצפית מיקרוסקופית מולטיפוטון של כלי רקמת כבד עכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
התבוננות בדינמיקה התוך-וסקולרית של רקמת הכבד של העכבר מאפשרת לנו לבצע תצפיות מעמיקות נוספות ומחקרים על מחלות הקשורות לרקמות של כבד העכבר. עכבר מוזרק עם צבע שיכול להכתים כלי דם. כדי להתבונן בכבד העכבר ב vivo, הוא חשוף ומתוקן במסגרת. תמונות דו מימדיות ותלת מימדיות של כלי הדם ברקמת הכבד מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון. תמונות של הרקמות באתרים שנבחרו נרכשות ברציפות כדי לבחון שינויים ארוכי טווח; השינויים הדינמיים של כלי הדם ברקמות הכבד נצפו גם. מיקרוסקופיה מולטי פוטון היא שיטה להתבוננות בתפקוד התא והתא בחלקי רקמות עמוקים או באיברים. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש רגישות מיקרו מבנה רקמות ומאפשר הדמיה של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה vivo, מתן היכולת ללכוד את המידע הביוכימי של הארגון. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמש כדי לבחון חלק מהכבד אבל תיקון הכבד כדי להפוך את התמונה יציבה יותר הוא בעייתי. בניסוי זה, יניקה ואקום מיוחד משמש כדי לתקן את הכבד ולקבל תמונה יציבה יותר של הכבד מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים של חומרים ספציפיים בכבד על ידי סימון חומרים כאלה עם צבעים.
מבוא
כלי דם יכולים לספק חומרים מזינים עבור רקמות איברים שונות של גוף האדם, ולהחליף חומרים. במקביל, ציטוקינים רבים, הורמונים, תרופות ותאים מתפקדים גם באמצעות הובלת כלי דם למקומות ספציפיים. התבוננות בשינויים בכלי הדם ברקמת הכבד יכולה לסייע בהבנת התפלגות זרימת הדם ברקמת הכבד והובלת חומרים, ולסייע בניתוח של מחלות מסוימות הקשורות לכלי הדם1,2.
ישנן דרכים רבות להתבונן בכלי הדם של הכבד בעכברים. ביניהם, מיקרוסקופיה אופטית יש מגבלות רבות בהתבוננות רקמת כלי דם אטומים3. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יכול לשמש כדי לדמיין את כלי הדם של כבדים חיים עם רזולוציה גבוהה פולשנית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים היו בהתאם למדיניות בית החולים סין Nanfang עבור הית ורווחה (יישום לא: NFYY-2019-73).
1. הכנת עכבר
- תהרם את העכבר.
- מכינים נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) במזרק.
- תפוס את העכבר (זכר בן 8 שבועות C57BL/6) עם יד שמאל, כך הבטן שלה פונה כלפי מעלה וראשו נמוך יותר הזנב שלה. לחטא את עור הבטן עם 75% אלכוהול.
- מחזיק את המזרק ביד ימין, לנקב את הקו הלבן בבטן עם המחט מעט בצד ימין של העור על ידי 3-5 מ"מ. ודא כי מחט המזרק ואת העור נמצאים בזווית של 45 °, להזריק את pentobarbital לאט לתוך חלל הבטן. לאחר הגילוח, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
את התפלגות כלי הדם בכבד ניתן לראות באיור 1, המתקבל באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. כלי הדם מחולק לריבוי ענפים הנובעים מתא מטען ומופצים לחלל שמסביב. ההיקף החיצוני של כלי הדם הוא אדום, החלל הפנימי חשוך, ויש הרבה דברים בפנים. ככל שהתמונה ברורה יותר, כך היא קרובה יותר למישור התצפית. יש גם כמה כתמים אדומים מסביב, כנראה בגלל הצבע חודר את הרקמה שמסביב כדי להכתים חומרים אחרים. בסרטון 1, ישנם דברים לא אדומים שיכולים להיות תאים נעים בכלי הדם האדומים. בסוף הסרטון, חלק מהדברים האלה חשו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התבוננות ברקמה חיה ספציפית היא אמצעי יעיל להבנת השינויים, לוקליזציה, ואת ההשפעות הביולוגיות של החומר בתוך הרקמה17. בניסוי זה, הצעדים החשובים הם תיקון הכבד עם גוף הדמיית איברים, אשר יכול לפתור את הבעיה של חפצי תנועה עקב נשימה ופעימות לב, ושימוש במיקרוסקופ מולטי פוטון לתצפית. בשיטה זו, הרקמות הפנימיות של הכבד in vivo נצפו באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון, וכלי הדם מסומנים בפלורסנט כדי לבחון בבירור את מיקומם ואת המבנה התלת מימדי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון אפקטים ספציפיים על ידי תיוג פלואורסצנטי חומר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772133, 81902444), הקרן למדעי הטבע גואנגדונג (2020A1515010269, 2020A1515011367), פרויקט מדעי הבריאות והטכנולוגיה של אזרח גואנגג'ואו (201803010034, 201903010072) ופרויקט החדשנות הרפואית הצבאית (17CXZ008).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל x 2 | הונאן פינאן מכשור רפואי טכנולוגיה | YA0551 | |
| 5 W כרית חימום | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% אתנול מוחלט | גואנגדונג גואנגחואה Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| כדור צמר גפן סופג | תברואה בריאה ממלכת | ||
| עכבר מכשיר כירורגי | RWD מדעי | החייםSP0001-G | כולל מספריים ופינצטה |
| מיקרוסקופיה מולטיפוטון | אולימפוס | FV1200MPE | |
| מתקן הדמיית איברים | BiolinkOptics Technology | BL336 | כולל יניקה, צינור, משאבת לחץ שלילי ותושבת |
| רודמין B isothiocyanate– מכונת גילוח Dextran | Sigma | R9379 | |
| Lei | Wa-RE-3201 | ||
| נתרן פנטוברביטל | סיגמא | P3761-25G |
מקורות
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
