הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60952

⸱

20 במאי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Clinical Medicine Center of Tissue Engineering and Nerve Injury Repair, Nantong University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה כדי לטהר את התאים הסרטניים ואת תאי Schwann מפני חושים ועצבים מוטוריים בתוך מבחנה.

תקציר

התאים העיקריים במערכת העצבים ההיקפית הם התאים של Schwann (ה scs) והפיברותקיעות. שני תאים אלה בבירור לבטא את הפנוטיפים חושי ומוטוריים מעורבים דפוסים שונים של ביטוי גנים neurotrophic factor ותהליכים ביולוגיים אחרים, המשפיעים על התחדשות העצב. המחקר הנוכחי הקים פרוטוקול כדי לקבל מאוד מטוהרים חושי החולדה ה scs מנוע ופיברותקיעות במהירות רבה יותר. השורש הגחוני (העצב המוטורי) והשורש הגבי (העצב החושי) של עכברי התרבות הבין-מלאכותית (שבעה ימים) היו מוטטים והתאים היו מתורבתים במשך 4-5 ימים, ואחריו בידוד של מנועי החישה והה scs על-ידי שילוב העיכול הדיפרנציאלי ושיטות הדבקות הדיפרנציאליות התוצאות של מנתח האימונוציטוכימיה והזרימה cyה scs try הראו כי הטוהר של החושים וה מוטוריים ופיברותקיעות היו > 90%. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל מספר רב של החושים מוטוריים פיברותקיעות/ה scs במהירות רבה יותר, לתרום לחקר של התחדשות החושים ומוטורית.

מבוא

במערכת העצבים ההיקפית, סיבי העצב מורכב בעיקר axons, התאים Schwann (ה scs), ופיברופיצוצים, וכן מכיל מספר קטן של מקרופאגים, תאי מיקרוכלי-דם אנדותל, ותאים חיסוניים1. ה scs לעטוף את האקסונים ביחס 1:1 ומוקפים בשכבת רקמת חיבור הנקראת endoneתוריון. לאחר מכן, האקטונים מאוחדים יחד כדי ליצור קבוצות שנקראות פססיקלס, וכל פסלול עטוף בשכבת רקמת חיבור המכונה הנקבים. בסופו של דבר, סיבי העצב עטוף בשכבת רקמת חיבור, אשר נקראת בתור הקולטן. ב-endoneurium כל אוכלוסיית התאים מורכבת מ-48% ה scs, וחלק ניכר מהתאים הנותרים כרוך בפיברותקיעות2. יתר על כן, הפיברובדורים הם מרכיבים חשובים של כל תאי העצב, כולל הפריאנארייון, הנקבים, והאניוניון3. מחקרים רבים ציינו כי ה scs ו פיברותקיעות לשחק תפקיד מכריע בתהליך התחדשות לאחר פציעות4עצביםהיקפית 4,5,6. לאחר רוחבי של עצב היקפי, הperineurial פיברופיצוצים להסדיר מיון התא באמצעות המסלול האפור-B/EphB2 איתות בין ה scs ופיברותקיעות, עוד המנחה את לצמיחה מחודשת סיבי באמצעות פצעים5. עצבי היקפי להפריש החלבון tenascin-C חלבונים ולשפר את הגירה של ה scs במהלך התחדשות העצב באמצעות β1-אינטגרציה איתות מסלול7. עם זאת, הה scs והפיברוטים המשמשים במחקרים שלעיל נגזרו מעצב הירך, הכולל הן חושים ועצבים מוטוריים.

במערכת העצבים ההיקפית, העצבים הסנסוריים (עצבי הגוף) מבצעים איתות חושי מן הקולטנים למערכת העצבים המרכזית (CN), בעוד העצבים המוטוריים (efferent עצבים) מבצעים אותות מתוך ה-CN אל השרירים. מחקרים קודמים הראו כי ה scs express מוטורית ופנוטיפים מוטוריים וחושים ומפרישות neurotrophic גורמים כדי לתמוך התחדשות היקפית עצביים8,9. על פי מחקר שנערך לאחרונה, פיברופיצוצים גם לבטא פנוטיפים מוטוריים וחושים שונים ולהשפיע על הגירה של ה scs10. כך, החקירה של הבדלים בין המנוע העצבי החושי פיברותקיעות/ה scs מאפשר לנו ללמוד את המנגנונים המורכבים הבסיסיים הבסיסית של התחדשות העצב ההיקפית הסגולי.

כיום, ישנן דרכים רבות כדי לטהר ה scs ופיברופיצוצים, כולל היישום של antimitotic סוכנים, נוגדן-תיווך cytolysis11,12, הimmunopanning סדרתי13 ו-למינציה ב-טקטי תשתית14. עם זאת, כל השיטות הנ ל להסיר את הפיברוכדורים ולשמר רק את ה scs. ה scs מאוד מטוהרים ופיברותקיעות ניתן להשיג על ידי הזרמת cy, לנסות מיון טכנולוגיה15, אבל זה זמן רב ויקר טכניקה. מכאן, במחקר זה, העיכול הדיפרנציאלי פשוטה ושיטת הדבקות הדיפרנציאליות לטיהור ובידוד החושים והעצבים המוטוריים והה scs פותחה על מנת להשיג מספר רב של פיברותקיעות וה scs במהירות רבה יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נעשה בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת נאנטונג. כל ההליכים כולל הנבדקים בעלי חיים אושרו מבחינה אתית על ידי ועדת המינהל של בעלי חיים ניסיוניים, מחוז ג'יאנגסו, סין.

1. בידוד ותרבות של מנוע ומעצבי עצבים חושי וה scs

  1. שימוש בן שבעה ימים בג-דאולי (SD) חולדות (n = 4) שסופקו על ידי מרכז החיות הניסיוני של אוניברסיטת נאנטונג של סין. מניחים את החולדות במיכל המכיל 5% isofלאנה עבור 2-3 דקות, לאפשר לבעלי חיים לנשום לאט ואין להם פעילות עצמאית, ולאחר מכן חיטוי באמצעות 75% אתנול לפני עריפת ראש.
  2. להשתמש במספריים לחתוך את העור האחורי עבור כ 3 ס מ ולהסיר את עמוד השדרה. פתח את תעלת החוליות בזהירות כדי לחשוף את חוט השדרה.
  3. לשמור על חוט השדרה ב 60 mm צלחת פטרי עם 2-3 mL של הקרח קר D-הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).
  4. בהתבסס על המבנה האנטומי, בלו את השורש הגחוני (העצב המוטורי) ולאחר מכן את השורש העצמי (העצב החושי) תחת מיקרוסקופ מבתר. לאחר מכן, למקם אותם בתוך הקרח קר D-הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).
  5. לאחר הסרת HBSS, פורסים את העצבים לחתיכות 3-5 מ"מ עם מספריים ולעכל עם 1 מ ל של 0.25% (w/v) טריפסין ב 37 ° צ' עבור 18-20 דקות. לאחר מכן, תוספת עם 3-4 mL של DMEM המכיל 10% סרום של שור עוברי (FBS) כדי לעצור את העיכול.
  6. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות כ 10 פעמים ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות. לאחר מכן, למחוק את supernatant ולהשעות את הזרז ב 2-3 mL של DMEM בתוספת של 10% FBS.
  7. לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן רשת שינוי 400, ולאחר מכן לחסן את התאים ב 60 מ"מ צלחת פטרי ותרבות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2. לאחר 4-5 ימים של culturing, לבודד את המעבר 0 (p0) פיברותקיעות ו ה scs לאחר שהגיעו 90% המפגש.
  8. בידוד ותרבות של ה scs (איור 1)
    1. שטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1x PBS. הוסף 1 מ ל של 0.25% (w/v) טריפסין (37 ° צ') לכל 60 מ"מ צלחת פטרי כדי לעכל את התאים עבור 8-10 s בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 3 מ ל DMEM בתוספת עם 10% FBS להפסיק את העיכול.
    2. לפוצץ בעדינות את התערובת כדי לנתק את ה scs עם פיפטה. לאחר מכן לאסוף ו צנטריפוגה את ה scs ב 800 x g עבור 5 דקות.
    3. להיפטר supernatant ולהשעות את הזרז ב 3 מ ל של DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 μM forskolin ו 10 ng/mL HRG, ולאחר מכן לאחר מכן לאחר התאים בתוך מצופה 60 mm צלחת פטרי. לאחר culturing ב 37 ° c עבור 30-45 דקות, הפיברותקיעות (כמה מספר של פיברותקיעות מתעכלים עם ה scs) לצרף לחלק התחתון של המנה.
    4. העבר את הסופרנטאנט (כולל ה scs) למנה נוספת פולי-L-ליזין (PLL) ולתרבות בינונית ב-37 ° c במשך יומיים.
  9. בידוד ותרבות של פיברותקיעות (איור 1)
    1. לאחר הסרת הה scs (כפי שמוצג בשלב 1.8), רוחצים את הגידולים הנותרים במנות עם PBS 1 x ולאחר מכן מוסיפים 1 מ ל 0.25% (w/v) טריפסין כדי לעכל את הפיברומות עבור 2 דקות ב-37 ° c.
    2. הוסף את Dמאמ בתוספת של 10% FBS כדי לסיים את העיכול. לפוצץ את הפיברופיצוצים באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לאסוף ו צנטריפוגה אותם ב 800 x g עבור 5 דקות.
    3. להיפטר supernatant, להשעות את הזרז עם 2 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, ולאחר מכן לחסן את התאים בצלחת פטרי 60 מ"מ מצופה. הפיברופיצוצים לאחר culturing עבור 30-45 דקות ב 37 ° c להצמיד לתחתית המנה. מחק את הסופרנטנט (כולל כמה מספרים של ה scs). לאחר מכן להוסיף 3 מ ל של DMEM בתוספת של 10% FBS לתוך הצלחת והתרבות הפיברומותקיעות ב 37 ° c עבור 2 ימים.
  10. מעבר את התאים p1 עד שהם הגיעו 90% המפגש. לאחר מכן טהרו אותם מעיכול משלים ומדבקות דיפרנציאליות כמתואר בסעיפים 1.8 ו-1.9.
  11. לעכל את הפיברותקיעות p2 ו ה scs לאחר culturing עבור 2 ימים, ולאחר מכן לאסוף את התאים, ספירה והאיחסן ב 1 x 105 מספרים/גם על מגלשות pll-מצופה (ICC).

2. ICC לזיהוי טוהר התא

  1. תרבות התאים 24 שעות ב 37 ° c ולבצע מכתים ICC לאחר העיכול הדיפרנציאלי והדבקות הדיפרנציאליות של המנוע והה scs.
  2. לשטוף את המנוע ואת הפיברותקיעות חושים ו ה scs עם 1x PBS ולתקן אותם ב-200 μL/טוב של 4% פאראפורמלדהיד (pH 7.4) עבור 18 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לחסום את המדגם ה scs עם מאגר חוסם (0.1% טריטון X-100 ב 0.01 M PBS המכיל 5% הסרום עז) ולחסום את המדגם לדוגמה עם מאגר חוסם (0.01 M PBS המכיל 5% סרום עז) עבור 45 דקות ב 37 ° c לאחר שטיפת אותם עם PBS שלוש שלושה.
  4. הסר את מאגר חסימת, ו דגירה עם הנוגדנים העיקריים הבאים: העכבר חד שבטיים anti-CD90 נוגדן (סמן מסוים עבור הפיברותקיעות) (1:1000) לטיפול ב ובעכבר נגד S100 נוגדן (סמן ספציפי עבור ה scs) (1:400) עבור ה scs ב 4 ° c לילה.
  5. להשליך את הנוגדנים העיקריים, לשטוף עם PBS שלוש, ו דגירה עם נוגדנים משניים הבאים: אלקסה Fluor 594 עז נגד עכבר IgG (1:400) עבור פיברופיצוצים ו 488-עז מצומדת נגד עכבר IgG (1:400) עבור ה scs בטמפרטורת החדר עבור 1.5 h.
  6. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS, ואת הכתם את גרעיני עם 5 μg/mL Hoechst 33342 לצבוע עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המדגם עם 1x PBS שלוש ולטעון אותם באמצעות מדיום ההרכבה (20 μL/שקופית) על שקופית הזכוכית.
  7. קח את תצלומי התא על ידי מיקרוסקופ מוקד סריקת לייזר בשלושה שדות אקראיים עבור כל באר. הערך את המספר הכולל של תאים גרעינים ו-CD90-חיוביים, תאים S100-חיוביים ולאחר מכן חשב את אחוז התאים CD90-חיוביים ותאים S100-חיוביים, בהתאמה. לבצע את הצביעת בטרילקאט.

3. הזרמת ציטונסה (FCA) לזיהוי של טוהר התא

  1. הערכת הטוהר של הה scs המוטוריים והחושים, כפי שתואר בעבר על ידי FCA16. בקצרה, לעכל את מנוע p2 ופיברומופיצוצים חישה ו ה scs עם 0.25% (w/v) טריפסין, להשעות מחדש את כדורי התא, דגירה אותם במדיום קיבעון בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
  2. מודיית את התאים עם בינונית חדירות ובדיקה באמצעות העכבר מונובטיים anti-CD90 נוגדן (0.1 μg/106 תאים, 200 μl) עבור הטיפול והנוגדן נגד S100 העכבר (1:400, 200 μl) עבור ה scs בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות, בהתאמה.
  3. מעכלה את התאים עם 488 עז מצומדת נגד העכבר IgG עבור 30 דקות. השתמש בקליבר FACS כדי לבצע את הזרימה cy, ולנתח את הנתונים באמצעות התוכנה Cell Quest.
  4. מארג התאים רק עם 488-עז מצומדת נגד העכבר IgG (קבוצת פיברופיצוצים) ועכבר IgG1 קפא [מוברג-21] (FITC)-בקרת Isotype (קבוצת ה scs), המשמשת כשליטה שלילית.

4. אנליזה סטטיסטית

  1. הציגו את כל הנתונים כאמצעי ± SEM. הערכת הבדלים סטטיסטיים בנתונים על-ידי בדיקה לא משויכתבאמצעות השימוש ב-גראפד פריזמה 6.0. הגדר משמעות סטטיסטית ב- p< 0.05. . בצעו את כל הפעולות בטריפליטה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התבוננות מיקרוסקופית קלה
הה scs והפיברופיצוצים הם שתי אוכלוסיות התאים העיקריות המתקבלות בתרבות התא העיקרי מרקמות העצבים. לאחר החיסון במשך 1 שעות, רוב התאים הדבקו בתחתית המנה, והמבנה התאי השתנה מעגול לאליפסה. לאחר culturing עבור 24 שעות, ה scs הציג מורפולוגיה דו-קוטבית או tripolar האורך של אלה נע בין 100 אל 200 μm. לאחר 48 h, צבירה והתפשטות של תאים אירעו, שבו תאים רבים היו צבורים בקצה לקצה, כתף אל כתף, מערבולת או סידור הגדר כמו. הגידולים האחרים הגדולים יותר מה scs הציגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שתי אוכלוסיות התאים המרכזיות של עצבי היקפי כללו ה scs ופיברופיצוצים. הפיברותקיעות בעיקר תרבותית ו ה scs יכול במדויק לסייע במידול הפיזיולוגיה של הפיברותקיעות ו ה scs במהלך פיתוח עצבי היקפי והתחדשות. המחקר הראה כי P7 בתאי עצב מבוססי עכברוש הכיל כ 85% של S100-חיוביים ה scs, 13% של OX7-חיוביים הפיברופיצוצים ורק 1.5% של OX42-חיובי מקרופאגים13. למרות שמספר הפיברוכדורים הוא פחות מ-ה scs, שיעור ההתפשטות הראשוני של הפיברותקיעות מהיר יותר מזו של ה scs. לכן, Ara-C הוא סוכן antimitotic הנפוץ ביותר עבור הסרת פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (גרנט No. 2017YFA0104703), הקרן הלאומית הטבעית של סין (גרנט No. 31500927).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 594 עיזים נגד עכבר IgG(H+L)Life TechnologiesA11005דילול: 1:400
CoraLite488-מצומד Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)ProteintechSA00013-1דילול: 1:400
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeica MicrosystemsTCS SP5
Cell Quest softwareBecton Dickinson Biosciences
תמיסת המלח המאוזנת של D-HankGibco14170112
DMEMCorning10-013-CV
מיקרוסקופ ניתוחאולימפוסSZ2-ILST
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco10099-141C
ForskolinSigmaF6886-10MG
Fluoroshield הרכבה בינוניתAbcamab104135
מדיום קיבוע / מדיום פרמביליזציהMulti Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LtdGAS005
זרימה ציטומטריהBecton Dickinson BiosciencesFACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - בקרת איזוטיפAbcamab106163דילול: 1:400
נוגדן חד שבטי נגד CD90 עכבר Abcamab225דילול: 1:1000 עבור ICC, 0.1 ומיקרו; g עבור תאי 106 עבור
נוגדן Flow Cyt Mouse anti-S100Abcamab212816דילול: 1:400
פוליליזין (PLL)SigmaP4832
רקומביננטי אנושי NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF תחום חלבוןR& D Systems396-HB-050
0.25% (w/v) trypsinGibco25200-072

מקורות

  1. Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
  2. Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
  3. Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
  4. Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
  5. Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
  6. Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
  7. Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
  8. Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
  9. Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
  10. He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).
  11. Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
  12. Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
  13. Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
  14. Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
  15. Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
  16. He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
  17. Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בידוד פיברובלסטיםטיהור תאי שוואןעיכול דיפרנציאליהיצמדות דיפרנציאליתאנליזה באמצעות פלוו-ציטומטריהצביעה אימונוציטוכימיתמיקרוסקופיה קונפוקליתרגנרציה של עצביםעצבים תחושתיים
טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.