מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

סיכום

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

תקציר

תאי שיער הם תאים מכנו-חושיים המתווכים את חוש השמיעה. תאים אלה אינם מתחדשים לאחר נזק בבני אדם, אך הם מתחדשים באופן טבעי בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה. מערכת הקו הניגב של דגי הזברה היא מודל שימושי לאפיון התחדשות תאי שיער חושיים. הקו לחוץ מורכב של איברים המכילים תא שיער הנקראים neuromasts, אשר מקושרים יחד על ידי מחרוזת של תאים interneuromast (INMCs). INMCs לפעול כתאי הצבי המביאים להובלת neuromasts חדש במהלך הפיתוח. INMCs יכולים לתקן פערים במערכת הקו החוץ-תאלי שנוצר על-ידי מוות של תאים. שיטה מתוארת כאן עבור אבלציה INMC סלקטיבית באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי סורק לייזר confocal ודגים טרנסגניים המבטאים חלבון פלורסנט ירוק INMCs. מיקרוסקופית זמן לשגות משמש לאחר מכן כדי לפקח על התחדשות INMC ולקבוע את קצב סגירת הפער. זה מייצג פרוטוקול נגיש עבור אבלציה תא שאינו דורש ציוד מיוחד, כגון לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה. פרוטוקול אבלציה עשוי לשרת תחומי עניין רחבים יותר, כפי שהוא יכול להיות שימושי עבור אבלציה של סוגי תאים נוספים, שימוש בהסטת כלים שכבר זמינה למשתמשים רבים. טכניקה זו תאפשר עוד יותר את האפיון של התחדשות INMC בתנאים שונים ומרקעים גנטיים שונים, אשר יקדמו את ההבנה של התחדשות תאי האבות החושיים.

מבוא

בליבה של ליקוי שמיעה מתקדם ביותר טמון ההרס של תאי שיער חושיים, אשר מתמרים גירויים שמיעתיים חיצוניים לתוך דחפים עצביים לגילוי על ידי המוח. מוות תאי שיער שבלולי גורם לליקוי שמיעה קבוע, כמו יונקים בוגרים חסר את היכולת לחדש תאים אלה בעקבות נזק. לעומת זאת, בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה יכולים לחדש תאי שיער שאבדו לטראומה אקוסטית או לעלבון אוטוקסי. הקו המכנוזנסי של דגי הזברה הוא מערכת איברים פשוטה וקלות שניתן להשתמש בה כדי ללמוד התחדשות תאי^{שיער 1,2,3}.

הקו לחוץ מורכב מטלאים חושיים קטנים הנקראים neuromasts, המחוברים במהלך הפיתוח על ידי מחרוזת של תאים מוארך המכונה תאים interneuromast (INMCs). בהתחשב ביכולת ההתפשטות שלהם כתאי גזע לכאורה המהוים איברים המכילים תאי שיער חדשים, ההתנהגות של INMCs היא עניין רב^{לקהילה 4,5}. חלק גדול מהמחקר הנוגע ל-INMCs איפיין דיכוי של התפשטותם על ידי תאי שוון סמוכים העוטפים את עצב הקו לרוחב, ככל הנראה באמצעות מעכב של איתות Wnt/β-catenin. ^{שש,שבע,שמונה}. בעוד הרגולציה של התפשטות INMC והבידול לתוך neuromasts חדש תואר היטב, המנגנונים השולטים INMC לגדול מחדש לאחר אבלציה לא הובך. פרוטוקול זה משמש כאמצעי לבלילת INMCs בודדים וניתוח התנהגות ההתחדשות שלהם לאחר מכן.

מגוון שיטות להשמדת תאי שיער, תאים תומכים, ו neuromasts שלם פורסמו, יחד עם מתודולוגיות לניטור התאוששות. אבלציה כימית עובד היטב עבור תאי שיער, אבל מינונים של כימיקלים רעילים כגון CuSO₄ חייב להיות מוגבר באופן משמעותי כדי להסיר סוגים אחרים של תאי קו^{לחוץ 9}. בעוד אלקטרובלציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא אמצעי יעיל ופשוט להשמדת INMCs כדי ללמוד התחדשות, קשה למקד באופן צר, ולכן, עשוי לייצר נזק משני משמעותי. כתוצאה מכך, הדבר יכול להסוות היבטים של התנהגויות ספציפיות ל- INMC^10,11. פרוטוקולי אבלציה לייזר הועסקו, אבל הם דורשים את השימוש בציוד מיוחד לא בהכרח קיים במעבדה הממוצעת או במתקן הדמיה (כלומר, לייזרים UV פעמו^{רבי עוצמה 12).} השיטה המתוארת כאן יכולה להתבצע עם כל מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר לבוש עם לייזר נפוץ 405 nm, משמש בדרך כלל עבור DAPI הדמיה ופלואורופורים כחולים אחרים. יתרון של שיטה זו הוא כי הדמיה confocal יכול להתבצע מיד לפני ואחרי נזק לתא מבלי לעסוק בכל מערכות בקרת לייזר נוספות או העברה למיקרוסקופ אחר מצויד לייזר פעמו.

שיטה דומה תוארה עבור נוירונים מבלבלים בחוט השדרה של דגי הזברה¹³. עם זאת, השיטה הקודמת דורשת מודול FRAP עבור אבלציה של תאים, שאינה דרישה עבור פרוטוקול זה. יתר על כן, בהתחשב במאפיינים הייחודיים של סוגי תאים שונים (כלומר, בהירות של פלואורסקנציה טרנסג'נדרית, עומק בתוך הגוף, וצורת התא), סביר להניח כי יהיה צורך בשינויים משמעותיים בהתאם לסוג התא המשמש. הפרוטוקול המפורט כאן סביר יותר להיות יעיל עבור תאים שטחיים יותר, כפי נתמך על ידי הדגמה של אבלציה תא שיער חושי באותה שיטה. כמו כן מתואר הוא התחדשות תוואי כדי להעריך את שיעורי ההתאוששות INMC לאחר אבלציה, אשר לא היה תכונה של המחקר הנ"ל.

פרוטוקול אבלציה תא מבוסס לייזר מפורט בכאן לוכד את היכולת ההתחדשות של INMCs באמצעות אופטימיזציה של תנאי לייזר, הדמיה לפני ולאחר אבלציה, ומיקרוסקופית זמן לשגות. אלמנטים אלה מתאחדים כדי להציג באופן מקיף את ההתארגנות מחדש של INMC ואת סגירת הפער בשלמותה. בעוד פרוטוקול זה משמש כאן כדי להרוס INMCs, זה עשוי להיות מיושם על עבודה אחרת הדורשת הערכה אמינה ויעילה של אבלציה סלולרית. זוהי גם טכנולוגיה נגישה, שכן ניתן לתנהל על כל מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר 405 אף-מ"ר.

פרוטוקול

כל העבודה בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת פייס לפי פרוטוקול 2018-1.

1. הכנת זחלי דגי זברה

1. להגדיר הזדווגות 3-5 ימים לפני ביצוע הניסוי, כך זחלים יהיו יומיים לאחר הפריה (dpf) כדי 4 dpf בגיל כאשר רכוב על אבלציה לייזר.
   הערה: קו מלכודת משפר Et(krt4:EGFP)sqEt20 (מקוצר כ- ET20), שבו תאים interneuromast מסומנים בבירור עם חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), מאפשר זיהוי תא קל יחסית^{אבלציה 11,14}. לאישור של מפרט אבלציה לייזר וגמישות, דגים ET20 גדלים עם Tg(neuroD:tdTomato)דגים, שבו עצב קו רוחבי מתויג עם חלבון פלורסנט אדום או עם Tg (myo6b:βactin-GFP) כדי לתייג תאי שיער חושיים עם GFP^15,16.
2. לאחר איסוף העובר למחרת, דגירה עוברים ב 28.5 ° C ב E3 בינוני המכיל 0.0001% מתילן כחול עד מוכן להדמה ולהר.

2. הכנת פתרונות אגרוז ותרקיס ג'לי נמוך

1. לבקבוקון Erlenmeyer זכוכית 250 מ"ל, להוסיף 48 מ"ל של 1x E3 בינוני, 2 מ"ל של 15 מ"מ tricaine פתרון מניות, ו 0.5 גרם של agarose נמס נמוך.
2. לחמם במיקרוגל את התמיסה על גבוה עבור 30 s ומערבולת (לובש כפפות הגנה על חום) כדי להמיס את agarose. חזור על מחזורי החימום של 30 s עד agarose מומס לחלוטין.
3. לאחסן את agarose באינקובטור מחומם ל 42 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.

3. ההתסטרמה של זחלי דגי הזברה

1. לצינור חרוב 50 מ"ל, להוסיף 24 מ"ל של 1x E3 בינוני ו 1 מ"ל של פתרון מניות tricaine (15 mM) לריכוז סופי של 600 μM. מערבולת לערבב.
2. טען אחת משש הבארים של לוח תרבות תא שטוח תחתית עם 8 מ"ל של E3 המכיל 600 μM tricaine.
3. השתמש בפיפטת העברה כדי להעביר זחלי דגי זברה לתוך 74 μm רשת רשת תחתית תוסף העברה.
4. העבר את התוסף עם תחתית הרשת לבאר של לוח שש הבאר המכיל את הפתרון E3 + tricaine. אפשרו לזחלים להישאר בבאר למשך 3 דקות לפחות או עד להסתה מלאה. בדיקת הרדמה על-ידי הקשה על ההוספה. זחלים לא צריכים לבהיל ולשחות בתגובה לברז.

4. הקרנה פלורסנטית של זחלי דגי זברה מברמה

1. פיפטה אחת זחלים מנומים לכל באר על 12 שקופיות מצופה הידרופובית היטב להקרנה. ודא כי יש עקמומיות מינימלית של מיניסקוס שנוצר בכל באר של השקופית כדי להפחית עיוות אופטי בעת ההקרנה. ניתן לעשות זאת על ידי הסרת נפח קטן של E3 מכל באר לאחר הנחת הזחלים.
2. תחת מטרה 10x על מיקרוסקופ זקוף (מצויד במנורת קשת כספית, מנורת מתכת-halide, או מקור אור LED וקוביית מסנן מתאימה), מסך עבור זחלים המבטאים eGFP בנוירומסטים ותאים interneuromast של מערכת הקו לרוחב.
   1. בחר זחלים עם ביטוי חזק יותר וכתוצאה מכך eGFP בהיר יותר, אשר ככל הנראה הם homozygous עבור transgene.
      הערה: בקו ET20, eGFP בא לידי ביטוי בטבעת של תאי המעטפת המקיפים כל neuromast, כמו גם את הרצועה הצרה של תאים interneuromast חיבור איברים אלה. ביטוי eGFP חזק יותר (פלואורסקנציה בהירה יותר) תורם לאבלציה יעילה יותר.
   2. כדי לבחון את ספציפיות אבלציה, השתמש בזחלים טרנסגניות כפולות עם הטרנסג'נים ET20 ו- Tg(neuroD:tdTomato). אם ההקרנה עבור ספקיות Tg(neuroD:tdTomato), השתמש בקוביית המסנן RFP כדי לזהות תיקון אדום בהיר רק אחורי לאוזן המייצג את הגנגליון של הקו הצדדי האחורי.
   3. כדי לבלבל תאי שיער בנוירומסטים קו רוחבי, להשתמש Tg (myo6b:βactin-GFP) קו טרנסגני ומ מסך עבור התאמה מקומית GFP במרכז כל neuromast.
3. בחר זחלים עם מרווח סטריאוטיפי של הנוירומאסטים. הבדלים במרווח בין neuromasts עשוי להצביע על תצהיר neuromast חריג במהלך הפיתוח, מציע התנהגות נדידה פגומה או התפשטות תאים בפרימורדיום קו^{רוחבי 17}. פגמים כאלה עשויים להשפיע גם על אופן פעולה נודד או רגנרטיבי של ה- INMCs לאחר אבלציה.
   הערה: פגמים נפוצים במרווח כוללים מרחק גדול במיוחד בין הנוירו-מיסט הקדמי ביותר שהופקד על ידי הפרימורדיום הנודד הראשון (prim1L1) לבין הנוירו-מיסט השני שהופקד על ידי אותו פרימורדיום (prim1L2), הקשור לעתים קרובות לצפיפות של הנוירומסטים האחוריים יותר.

5. זחלי הרכבה לאבלציה לייזר והדמיה

1. פיפטה 3 - 4 זחלים מנומסים לתוך טיפה קטנה של תמיסת E3/tricaine במרכז צלחת כיסוי החלקה תחתון (35 מ"מ צלחת עם 14 מ"מ מספר 1.5 coverslip). הסר תמיסה עודפת כך הזחלים להישאר בטיפה קטנה, רק גדול מספיק כדי להכיל אותם.
2. מעבירים את המנה לשלב של מיקרוסקופ סטריאו משקפת ומתמרנים את הזום ומיקוד כך שכל הזחלים יהיה בשדה התצוגה.
3. הסר את בקבוקון ארלנומייר המכיל את נקודת ההתכה הנמוכה agarose מהאינקובטור המחומם. השתמש בפיפטת העברה כדי להעביר פתרון agarose לשקופית הכיסוי כדי להפיק שכבה דקה. מוציאים את ההגזמה העודפת עד שהנוזל ממלא את הבאר בתחתית המנה, ודאגו לא לשאוב זחלים.
4. מסדרים במהירות את הזחלים בתמיסת ה-agarose באמצעות סכין שיער או לולאת שיער, כך שהם מיושרים זה עם זה ומודרכים עם רוסטאל משמאל.
5. לחץ בעדינות את הזחלים כלפי מטה על הזכוכית עם סכין השיער, כך שהם שוכבים בפרופיל עם הצדדים הימניים שלהם למטה. זחלים מעל 3 dpf נוטים לצוף בשל שלפוחיות השחייה המנופחות שלהם, כך שהם עשויים להיות נלחצים שוב ושוב כלפי מטה על הזכוכית עד agarose מתחיל ג'ל.
6. לאחר כ-60 שניות, ה"אגרוז" יתחיל להתגבש, והזחלים לא יוכלו להתכווות מחדש. אפשרו כ-5 דקות בטמפרטורת החדר עבור ה-agarose על תלוש הכיסוי כדי להתגבש לחלוטין. לאחר שהאגרוז התגבש, השתמש בפיפטת העברה כדי למלא את המנה באמצע הדרך עם E3 המכיל 1x tricaine.

6. איתור מטרות פוטנציאליות והדמיית טרום אבלציה

1. הפעל את החשמל למערכת המיקרוסקופית הקונסוקלית לסריקת לייזר ואתחל באמצעות תוכנת ההדמיה המשולבת. בחר את המטרה 63x תוכנית-Apochromat שמן טבילה (צמצם מספרי 1.40) או דומה. מורחים שמן טבילה ומאבטחים את המנה בשלב מעגלי, כך שהזחלים פונים עם ההיבט הרוזאלי שלהם משמאל.
2. תחת תאורת ניגודיות שדה בהיר או הפרעות דיפרנציאליות, בחר אחד מהזחלים המותקן להדמיה. התאם את המיקוד עם ידית המיקוד כך העור בצד של הדג הקרוב ביותר לסכום הוא בפוקוס, מזוהה על ידי דפוס כמו טביעת אצבע של תאים periderm.
3. ברגע שאתה בפוקוס, עבור להארה אפיפלואורסצנטית בערוץ GFP. אתר את הקו האחורי לחוץ על-ידי ביטוי GFP לאורך myoseptum האופקי. טבעות של תאי פלורסנט מצביעות על תאי המעטפת של הנוירומט, וגדילים מוארך של תאים הם תאים מתמחים.
4. החל עם neuromast primIL1, בדרך כלל ממוקם רק גב לחלמון, להשתמש ג'ויסטיק בקרת הבמה או בקרת תנועה שלב אחר כדי לסרוק באופן חזותי לאורך myoseptum אופקי.
   1. בצע את מחרוזת התאים interneuromast עד שהגיע לאזור בין primIL3 ו primIL4 (L3 ו- L4) neuromasts (איור 1A).
      הערה: אזורים אחרים יכולים גם להיות ממוקדים, אך קטע זה של הגזע והזנב נוטה להיות הקרוב ביותר לזכוכית הכיסוי, ולכן, הניתן ביותר לאבלציה.
   2. אם הדמיה מספר זחלים, הגדר את מיקום השלב הראשון ולאחר מכן בטל את האפשרות מיקום שלב מרובה על-ידי ביטול הבחירה בתיבת הסימון המתאימה.
   3. חזור על שלבים 6.4.1–6.4.2. עבור כל מיקום שלב רצוי (כל זחל).
5. לאחר שזוהו גופים סלולריים באזור L3-L4, עבור למצב הרכישה.
   1. הפעל מסלול הדמיה GFP באמצעות לייזר 488 נארם או 491 נארם.
   2. הוסף ערוץ אור משודר (צינור פוטו-מול-קוליאר אור משודר או T-PMT) לרצועה הלייזר המופעלת של 488 דפים לספירה על-ידי הפעלת תיבת הסימון T-PMT תחת התפריט הנפתח "התקנת הדמיה".
   3. הגדר את כוח הלייזר ל- 6%, גודל חור סיכה ל-1 שווה ערך ליחידה אוחטטית, ורווח דיגיטלי ל- 750 עבור הדמיית זחלי ET20. רווח מדויק וכוח לייזר עשויים להשתנות עבור כל זחל נתון, תלוי כמה קרוב לתלוש הכיסוי הם מותקנים ואת הבהירות של פלואורסצנה. להתאים את הרווח כך גופים תא רוויים כדי ללכוד אחרת תחזיות עמומות ופיליפודיה.
   4. להתאים את הפרמטרים לגודל מסגרת של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים, זום דיגיטלי של 0.7 (145.2 μm x 145.2 μm גודל תמונה). הגדר בממוצע ל- 2 כדי לשפר את איכות התמונה.
6. סמן את התיבה z-stack כדי להעלות את התפריט הנפתח של מיקום z. בזמן הסריקה המהירה, התמקדו עד שהתאים האירומטיים פשוט לא יתרכזו. הגדר את הפרוסה הראשונה, ולאחר מכן להתמקד דרך המדגם עד התאים interneuromast הם שוב מחוץ לפוקוס. תכוונו את הפרוסה האחרונה. ודא כי הוא מקיף z-stack של כ 25 μm. הגדר את מרווח ההדמיה ל- μm אחד.
7. התחל להתנסות כדי ללכוד z-stack pre-ablation (איור 1B). אם נוספו מיקומי שלב, בטל את אפשרות המיצובים כך שרק המיקום הנוכחי יצוין. שמור את הקובץ לאחר נלכד.

7. אבלציה לייזר של גופים סלולריים

1. לחץ על "הצג את כל הכלים". אפשרות זו ממוקמת בראש ממשק הרכישה.
2. לחץ על התפריט הנפתח עבור "הדמיה להגדיר". ב "הגדרת הדמיה ", לחץעל "הוסף רצועה חדשה" (מיוצג כ "+").
3. ב "הגדרת הדמיה ",לחץ על התפריט הנפתח עבור "Dye". בחר DAPI כצבע.
4. לחץ על התפריט הנפתח עבור " ערוצים "ובטלאת הבחירה בכל הרצועות האחרות על-ידי ביטול תיבות הסימון המתאימות. ודא שרק רצועה DAPI נבחרה.
5. ברצועה DAPI, לחץ על 405 עבור " הגדרתלייזר". הגדל את כוח הלייזר ל- 75%. בטל את לחץ על ערוץ DAPI כדי לכבות את הלייזר בעת סריקה לאיתור גופי תאים מועמדים לאיתור אבלציה.
6. כאשר הגוף של תא interneuromast מרוכז בשדה התצוגה, זום במסגרת הסריקה ל 20x-22x. ייתכן שיהיה צורך לכוונן את מיקום המסגרת כדי לשמור על גוף התא במרכז עם החלת גודל התצוגה. הפסק סריקה חיה ברגע שגוף התא ימלא את שדה התצוגה.
   הערה: גוף התא צריך לכבוש את כל שדה התצוגה. ברמת זום זו, GFP יהיה להלבין במהירות. מזער את זמן החשיפה ללייזר על-ידי עבודה מהירה. השתמש בזום תצוגה במקום לבחור אזור מעניין כדי להגדיל את התפלגות כוח הלייזר על פני אזור קטן.
7. בדוק את תיבת תריס לייזר 405 נארם כדי להפעיל את המסלול. כוונן את כוח הלייזר ל- 75%. תגדיר טיימר ל-45 שניות. הפעל סריקה רציפה והפעל את משך הזמן. תפסיק לסרוק מיד ב-45 שניות.

8. הדמיה לאחר אבלציה ומיקרוסקופית זמן לשגות ללמוד התחדשות

1. לחץ על התפריט הנפתח עבור "ערוצים". בערוצים, בטל את הלחץ על הרצועה "DAPI" כדי לבטל את לייזר אבלציה. לחץ על התפריט הנפתח עבור "מצב רכישה".
2. במצב רכישה, לחץ על "זום".
3. הקטן את גודל התצוגה ל- 0.7 באמצעות המחוון או על-ידי הקלדת "0.7."
   1. כדי להבטיח אבלציה מוצלחת של תאים, הגדל את הרווח ל- 900 וסרוק במהירות את שדה התצוגה.
      הערה: אין גלוי GFP בתוך התא או התאים המיועדים. אם עדיין נצפה פלואורסץ, חזור לצעדים 7.1-7.3.
   2. שימוש בהגדרות זהות או דומות לאלה המתוארות עבור הדמיה קדם-אבלציה, לכידה ושמירה של תמונה שלאחר אבלציה (איור 1C). אם התמונה חושפת שרידים של תאי פלורסנט או גופים נוספים של תאים שיש להסיר, חזור על שלבי אבלציה לייזר כדי ליצור פער גלוי במחרוזת של תאים interneuromast.
   3. בדוק את תמונת ערוץ T-PMT כדי לאשר עוד יותר נזק תאי. תאים פגומים יהיה מראה פרטני, ולעתים קרובות הגרעין יתנפח או יהיה לא סדיר בצורת(איור 2).
4. לאחר לכידת תמונה לפני אבלציה, התבססות התאים לפי הצורך, ולכידת תמונה שלאחר אבלציה עבור כל מיקום שלב בודד, להגדיר את המיקרוסקופ זמן לשגות על ידי הפעלת הן מיקום הבמה ואפשרויות זמן עבור לכידת תמונה. הגדר את פרמטרי הזמן ל- 24 שעות או נקודת קצה רצויה אחרת ומרווחי זמן של 15 דקות. התחל להתנסות כדי להשיג תמונות ולשמור את הקובץ שנוצר כאשר הוא הושלם (ביום שלמחרת).
5. אם יש ללמוד או להעלות את הזחלים, להסיר אותם בזהירות מהאגרוז באמצעות משקולות עדינות, ולאחר מכן להעביר ל-E3 medium ללא tricaine להחלמה. אם אין להשתמש בהם עוד יותר, המתת סד בהתאם לפרוטוקול החי שאושר (טבילה מהירה ומתמשכה באמבט קרח היא שיטה נפוצה) ולהיפטר מהם כנדרש על ידי המוסד.

9. ניתוח תמונה

1. פתח קובץ z-stack לאחר אבלציה בתוכנה המועדפת לעיבוד תמונה(טבלת חומרים). פצל את הערוצים כך שכל ערוץ יהיה בחלונית תצוגה נפרדת.
2. בחלון ערוץ GFP, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו ישר בין הקצוות של ה- INMCs הנותרים. ניתן לסייע בכך על-ידי גלילה למעלה למטה דרך z-stack או על-ידי ביצוע הקרנה בעוצמה מרבית לפני ציור הקו.
3. השתמשבכלי" מידה " כדי להשיג את המרחק בין קצוות INMC ב- x- ו- y-planes.
4. גלול בין פרוסות ה- z בערימת ה- z המקורית כדי לקבוע את המרחק בין INMCs במטוס z.
5. חשב את המרחק הכולל בין קצוות INMC באמצעות המשפט פיתגורס⁽² + b² = c²). תת-לחץ הדם הוא המרחק הכולל (או גודל הפער).
6. הזן את מדידת המרחק שנוצרה ביישום גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נתונים.
7. סקור את קבצי מיקרוסקופ זמן לשגות שנאספו בשלב 8.2–8.3 באמצעות תוכנת הדמיה משולבת על המערכת confocal או תוכנה לניתוח תמונה זמין בחופשיות. זהה את נקודת הזמן שבה הפער בין תאי האירומסט התמלא על-ידי הקרנת תאים. זה יכול להיות נעזר בבדיקה של פרוסות z מרובות כדי לאשר את סגירת הפער בכל הממדים.
8. כדי להשיג את המדידה המדויקת ביותר של זמן לסגירת פערים, השתמש בחותמת הזמן של התמונה לאחר אבלציה (גלויה ב- Finder או בסייר הקבצים) כנקודות הזמן האפסיות; מדידת זמן מתחילת ערימת התמונה לשגות זמן עלולה לגרום להמעיט בזמן לסגירה, בהתאם לזמן שחלף תוך התבססות על עמדות שלב נוספות וכו'.
9. להפיק את קצב הסגירה פשוט על ידי חלוקת גודל הפער המקורי (μm) לפי השעות או הדקות הנדרשות לסגירת פער מלאה.

תוצאות

על מנת לנפח INMCs והתחדשות שיא, זחלי דגי זברה המביעים GFP מוקרנים של הקו הטרנסגני ET20 הורצו ב 2- או 3 ימים לאחר הפריה עבור אבלציה כמתואר בשלב 5.4. ניתן להרכיב מספר דגים בו-זמנית כך שניתן יהיה ללכד מספר מעידות זמן בניסוי אחד. האזור של הקו לציבי הממוקם בין primIL3 ו primIL4 neuromasts זוהה, ותמונות טרום אבלציה צולמו כמתואר בשלבים 6.5-6.7 (איור 1א,ב).

שלושה גופים תא היו ממוקדים עבור אבלציה לייזר כדי ליצור פער במחרוזת INMC של כ 40 μm. סריקה לאחר אבלציה עם רווח גבוה והדמיה לאחר מכן אישרה כי לא נותרו גופות תאים באזור המפוברק, והותירה פער בין התחזיות המותארות של ה-INMCs הסמוכים(איור 1C). מוות תא הוכח עוד יותר על ידי בחינת ערוץ T-PMT לאחר אבלציה. תאים פגומים וגוססים סומנו על ידי גרעינים נפוחים וצורה לא סדירה, כמו גם מראהפרטני (איור 2,מתואר). במקרים מסוימים, הדמיית זמן לשגות גם חשפה את הגיוס של תאים אמוואידים גדולים שהיו מקרופאגיםסבירים (איור 2,כוכבית). אזורים כהים המקיפים את ה-INMCs המפוברקים הצביעו על פוטו-בליך בתאי periderm הצפולים. תאים אלה לא נראו פגומים או נהרסו על ידי קרני לייזר בניסויים אלה; במקום זאת, הפלואורסץ שלהם צומצם זמנית. מיקרוסקופית זמן לשגות מגלה כי תאים אלה בדרך כלל להתאושש לאחר אבלציה ולא לשנות צורה או אחרת מופיע פגום (תוצאות שלא פורסם, Volpe ואח ').

כדי לתמוך במפרט של הרס INMC, אבלציות בוצעו ET20 כפול-transgenic וזחלי Tg (neuroD:tdTomato) שבו עצב הקו לחוץ (אשר פועל רק מיקרונים מתחת לתאים interneuromast) מסומן עם חלבון פלורסנט אדום. אבלציות של מספר תאים שיצרו פערים גדולים במחרוזת INMC הייתה השפעה מועטה או לא על עצב הקו לחוץ המבוסס על פלואורסצנציה אדומה (איור 3). גמישות הטכניקה עבור תאים מקומיים שטחית הוכח על ידי הרס סלקטיבי של תאי שיער חושיים בודדים בתוך neuromasts של הקו לרוחב. באמצעות למעשה אותו פרוטוקול מפורט לעיל (סעיפים 7 ו 8), תאי שיער יחיד בזחלי Tg transgenic (myo6b:βactin-GFP) נהרסו ללא נזק לכאורה לתאים סמוכים(איור 4). תאי השיער המפוברקים לא התאוששו פלואורסץ לאחר מיקרוסקופ זמן לשגות, ואת הגרעינים שלהם היו באופן ניכר גרגרי ומותק לאחר חשיפהלייזר (איור 4B). בדומה לאבלטים של INMC, מקרופאגים לכאורה גויסו לעתים קרובות לאתר החשיפה ללייזר (תוצאות שלא תפורסם, Volpe ואח').

לאחר אבלציה לייזר ולכידת תמונה לאחר אבלציה, גודל הפער נמדד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות. כלי המידה הדגים גדלי פער הנעים בין מיקרונים ספורים ל-100 מיקרון בלבד, בהתאם לרוחב של INMCs בודדים ולתאים הרבים שנבחרו לאבלציה(איור 5). מיקרוסקופית Timelapse הועסקה כדי להקליט התנהגויות INMC במהלך התחדשות. ב-50 ניסויים, 15 פערים (30%) נסגרו על ידי התחדשות בתוך תקופה של 24 שעות. ברוב המקרים, INMCs שהצליחו להתאושש עשו זאת בתוך השעות הראשונות של ההדמיה. השחזור הוגדר כנקודות הזמן שבה הקרנות מתאי שכנים באו במגע, אשר התרחשה 16 שעות לאחר אבלציה עבור פער של כ 40 μm(סרט 1). ערימות Z נבדקו בקפידה כדי להבטיח כי מגע תא-תא התרחש בתוך מטוס z יחיד, הימנעות חפצים אפשריים עקב z-הקרנה. ניתוח רגרסיה לוגיסטית גילה כי ההסתברות לסגירת פערים קשורה לגודל הפער (p = 0.0453), כאשר פערים קטנים יותר נוטים יותר להחלים. פער של 55.5 μm הניב הסתברות סגירה של 50% (איור 5).

ב-70% מהמקרים, INMCs לא הצליחו לסגור לחלוטין את הפער שנוצר על ידי אבלציה. עם זאת, גם במקרים אלה הצלחנו לעקוב אחר היווצרות של תחזיות ארוכות מ- INMCs השכנים, אשר דומים בכמה פעמים הרחבת קונוסים צמיחה עצבית(סרט 2). לכן, ניסויים אלה יכולים גם לספק תובנה על ההתנהגויות של INMCs לאחר נזק.

איור 1: אבלציה סלקטיבית של תאים interneuromast על ידי הקרן לייזר. (A)תאים Interneuromast בין neuromasts primIL3 ו primIL4 נבחרו עבור אבלציה. תאים אלה מציגים צורת ציר אופיינית עם הקרנות מוארך חופפים גופים סלולריים סמוכים. (ב)הדמיית טרום אבלציה זיהתה גופים תאיים שיכולים להיות מבלבלים כדי לייצר פער. (ג)הדמיה שלאחר אבלציה מאשרת אבלציה מוצלחת כפי שצוין על ידי היעדר גופים סלולריים באזור הפער. קנה מידה של פסים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: הדמיה לאחר אבלציה מדגימה מוות של תאים בתגובה לחשיפה בלייזר בתאי interneuromast עם תווית GFP. הדמיית פוטו-מוליריה קלה משודרת (T-PMT) מצביעה על נוכחות של תא נמק בעל מראה פרטני (מוקפף) כמו גם גיוס תאים בעלי צורה לא סדירה שסביר להניח שהם מקרופאגים (*). מיזוג ערוצי GFP ו- T-PMT מאשר כי מוות של תאים ופעילות מקרופאג' התרחשה באתר של אבלציה. קנה מידה של פסים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ספציפיות של אבלציה interneuromast. (A)תאי GFP בעלי תווית מוקדמת (ירוק) ועצב קו רוחבי עם תווית TdTomato (אדום) ב- Tg(ET20; זחל. גופות תאים בסמיכות לעצב הקו הלילי היו ממוקדים לאבלציה. (ב)הדמיה שלאחר אבלציה מדגימה אבלציה של גופים סלולריים ממוקדים עם עצב קו רוחטי שלם. קנה מידה של פסים = 10 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: אבלציה של תאי שיער חושיים באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית. (א) הדמיה טרום אבלציה זיהה GFP מסומן תא שיער חושי (*) המיועד אבלציה ב Tg כפול טרנסגניים (ET20; myo6b:βactin-GFP) זברה. הדמיית צינור פוטומולטיפלייר אור משודר (T-PMT) חושפת מורפולוגיה רגילה של תאי שיער, עם חתך רוחב עגול. (ב)הדמיית אבלציה מאשרת אבלציה מוצלחת של תא השיער המיועד. תמונת T-PMT מצביעה על אי-סדירות בצורת תא השיער וגרעיניות מוגברת לאחר חשיפה ללייזר, מה שמצביע על מוות בתאים ולא על פוטו-בליי. קנה מידה של פסים = 10 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: רגרסיה לוגיסטית מדגמנת את ההסתברות לסגירת פער כפונקציה של רוחב רווח (ב- μm). ציון של 0 מייצג סגירת פערים מלאה, בעוד שציון של 1 מייצג סגירת פער לא שלמה. התוצאות מצביעות על כך שההשפעה של רוחב הפער על היכולת של תאים interneuromast לסגור את הפערים המתאימים היא משמעותית סטטיסטית (p = 0.0453, n = 24 סה"כ; n = 12 פערים סגורים, n = 12 פערים סגורים לחלוטין). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט 1: מיקרוסקופית זמן לשגות מדגים סגירת פער (~ 40 μm) לאחר 16 שעות. התמונות צולמו כל 15 דקות, והקרנה בעוצמה מקסימלית של z נעשתה עבור כל נקודות הזמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

סרט 2: מיקרוסקופיה של פער INMC שלא נסגר. התחזיות המותחות וההסתעפות של ה- INMCs הנותרים מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

דיון

הפרוטוקול מתאר שיטה רב-תכליתית לאבלציה של תאי לייזר שניתן לבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר אולטרה סגול כמעט (אורך גל של 405 00 00 00 00 00 00 00 00:00). פרוטוקול זה מטפל במגבלות של שיטות שהועסקו בעבר כגון אלקטרובלציה (אשר גורמת נזק נרחב יותר¹¹⁾ופעמו אבלציה UV-לייזר (אשר דורש ציוד מיוחד נוסף^12). הדמיה קונפוקלית לפני ולאחר אבלציה מספקת משוב מהיר בנוגע להצלחת הניסוי. מיקרוסקופית זמן לאחר מכן מציעה אחסון פשוט להתחדשות בסוג תא קריטי לפיתוח מערכת חושית.

יש חשיבות חיונית למסך מראש עבור דגי זברה טרנסגניים המביעים GFP בחוזקה בנוירומאסט ו- INMCs. זחלים עם פלואורסצנה בהירה ואפילו מרווח של neuromasts נגזר primI הם מועמדים אידיאליים לאבלציה לייזר. אפילו בדגים אלה, מדי פעם יש INMCs עמעום שעשויים בתחילה לברוח זיהוי. תאים אלה יכולים להישאר מאחור לאחר אבלציה לייזר, מניעת היווצרות של פער אמיתי בין INMCs. הרווח הדיגיטלי צריך להיות מותאם כדי לחשוף תאים עמעום אלה במהלך הדמיית טרום אבלציה כך שהם יכולים גם להיות ממוקד עם לייזר 405 nm (שלב 8.2).

באופן דומה, מיקוד לייזר לפעמים לא לגמרי להרוס תא; במקום זאת, זה יהיה להלבין את הפלואורסץ, וכתוצאה מכך כישלון ליצור פער אמיתי. תאים אלה בדרך כלל להגדיל פלואורסצנית במהלך מיקרוסקופית timelapse. קבל התאמה בשלב ההדמיה שלאחר אבלציה יחד עם הדמיית T-PMT (איור 2) מסייעים להבטיח שכל התאים המיועדים הוסרו ביעילות. לעתים קרובות נדרשים שניים או שלושה אבלות תאים בודדות כדי להפיק רווח במחרוזת INMC. מוות של תאים יכול להתגלות על ידי blebbing או מראה פרטניים בתאים המיועדים; למרות, זה עשוי לדרוש תקופת המתנה קצרה לאחר מיקוד לייזר (ובמקרים מסוימים, דמויות אפופטוטיות או נמק לכאורה נצפו זמן קצר לאחר מכן).

מגבלה של הליך זה היא שזה עשוי לדרוש ניסויים ניסיוניים מרובים לפני תנאי לייזר ממוטבים והתחדשות INMC הוא מוצלח. כוח הלייזר וזמן ההתעכבות הכולל של הלייזר עשויים לדרוש התאמה קלה עבור דגימות שונות. נמצא כי יישום לייזר מוגזם יכול לפגוע ביכולת של הקו לדרכך כדי לתקן את עצמו. זה כולל גם 1) חשיפת יתר של תאים בודדים להקרן לייזר, ככל הנראה גרימת נזק נוסף לרקמות שמסביב, כמו גם 2) אבלציה של תאים רבים מדי במחרוזת, המוביל לפער גדול יותר. על המשתמשים להשיג איזון בין תאים מ מקרינים מספיק כדי להבטיח את השמדתם ולא להגזים יתר על על כן בתאים, דבר שיכול להאט או למנוע התחדשות. עם ההגדרות המתאימות, נמצא כי INMCs ניתן להסיר ללא נזק גלוי לעצב הקו האחורי לצדדית, המציין כי נזק משני ממוזער עם פרוטוקול זה בניגוד electroablation¹¹. בשום מקרים לא היו neuromasts חדשים יוצרים בפער שנצפה, ככל הנראה בגלל עצב הקו לחוץ נשאר שלם ותאי גליה הבסיסיים להישאר לעכב את ההתפשטות של INMCs^6,7,8,11.

הוכח כי שיטה זו של אבלציה לייזר confocal עשוי להיות מיושם על סוגי תאים אחרים, כמו גם, במיוחד אלה הממוקמים באופן שטחי בתוך החיה כולל תאי שיער חושיים(איור 4). פרוטוקול דומה עשוי לשמש כדי לבלבל תאי עור כדי לבחון תיקון הפצע או נוירונים עבור מחקרי התחדשות סקסוניים, כפי שתואר קודם^{לכן 13}. הוא צפוי כי טכניקה זו תהפוך תוספת שימושית רפרטואר ניסיוני של מעבדות בעלי מיקרוסקופ confocal אבל אין ציוד מיוחד אחר עבור אבלציה לייזר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 בארות PTFE מודפס שקופיות אלקטרונים	מיקרוסקופיה מדעי	63425-05
15 מ"מ תמיסת מלאי טריקאין	סיגמא	E10521	15 מ"מ טריקאין במים אוסמוזה הפוכה
1X E3 + 600 ומיקרו; M Tricaine			מדולל 15 מ"מ מלאי טריקאין 25X במדיה 1X E3
1X מדיה			מדלל 60X E3 מדיה ל-1X במי אוסמוזה הפוכה (16.7 מ"ל/ליטר)
60 X E3	מדיה כל הרכיבים שנרכשו מ-Sigma-Aldrich		34.4 גרם Nacl, 1.52 גרם Kcl, 5.8 גרם CaCl2.2H2O, 9.8 גרם MgSO4.7H20 ב-1 ליטר מים אוסמוזה הפוכה
Bx60 מיקרוסקופ מורכב עם פלואורסצנציה של מנורת קשת כספית מיקרוסקופ	אולימפוס
LSM 700 מצויד בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-555 או 561 ננומטר	Zeiss Microscopy, LLC		לייזר 5 mW 405 ננומטר שימש לאבלציה; אבלציות והדמיה בוצעו באמצעות אובייקט 63x Plan-Apochromat עם NA של 1.40
FIJI/ImageJ תוכנת עיבוד תמונה	תורמים		להורדה ב https://fiji.sc/
ניתוח מחט שונה לסכין שיער	Fisher Scientific	19010	ריס הודבק על קצה מחט ניתוח עם ידית עץ
תוכנת Microsoft Excel	Microsoft Corp.		גיליונות גוגל הם אלטרנטיבה ללא עלות לכלי זכוכית
תחתונים של מיקרוסופט אקסל 35 מ"מ עם כיסוי מס' 1.5, חלון 20 מ"מ	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	צלחת פטרי 35 מ"מ, חלון זכוכית 20 מ"מ
Immersol 518F שמן טבילה	פישר סיינטיפיק	12-624-66A
ג'ל נמוך אגרוז	סיגמא מדעי החיים	A9414-256
קורנינג נטוול הכנס עם 74 אום פוליאסטר רשת, 24 מ"מ הכנס	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio תוכנה	Rstudio PBC		להורדה ב
https://rstudio.com/ SMX-168-BL סטריאו מיקרוסקופ	מוטיק
העברה פיפטה	פישר מדעי	13-711-7M
ZEN תוכנה	קארל זייס מיקרוסקופיה, LLC