Method Article

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/60990

⸱

July 15th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)1. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הדרכות ידידותיות למשתמש זמינות באתר האינטרנט של אייסי http://icy.bioimageanalysis.org.

1. הורד אייסי ואת פרוטוקול מנתח מבנה משנה

  1. הורד אייסי מהאתר קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/download) ולהוריד את מבנה המשנה פרוטוקול מנתח : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    הערה: אם אתה משתמש בערכת הפעלה של 64 סיביות, הקפד להשתמש בגירסת 64 הסיביות של Java. גרסה זו מאפשרת להגדיל את הזיכרון המוקצה קרח (העדפות | כללי | זיכרון מרבי).

2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניתוחים שתוארו בוצעו על מחשב נייד רגיל (64 סיביות, ארבע ליבות מעבד ב 2.80 GHz עם 16 GB זיכרון גישה אקראית (RAM)) עבודה עם גירסת 64-bit של Java. זיכרון גישה אקראית הוא פרמטר חשוב שיש לשקול, בהתאם לכמות ולרזולוציה של תמונות לצורך ניתוח. באמצעות גירסת 32-bit של Java מגבילה את הזיכרון כ 1300 MB, אשר יכול להיות בלתי מתאים לניתוח נתונים גדולים, בעוד גרסת 64-bit מאפשר הגדלת הזיכרון המוקצה קרח. איור 3 מדווח על הזמן הדרוש לפילוח עבור סוגים שונים של תמונות ורזולוציות שונות. הוא מאשר כי ברזולוציה ג.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג'י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פונקציונליות3. קרח הוא כלי עצמאי המציג ממשק משתמש גרפי ברור (GUI), ובעיקר שלה "הפרוטוקולים" הנקודה ולחץ ממשק דרכו ניתן זרימות עבודה יכול להיות מעוצב בקלות או מניפולציות4. הפונקציונל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G.H. היתה נתמכת על-ידי מלגת מוסמכים מבית המיניצ ' א-לה-שרצ'ה וטכנולוגיות עזר. L.H. היה נתמך על ידי מלגת בוגר מכון דה Cancérologie דה לוריין (כיל), בעוד שקט היה נתמך על ידי מענק ציבורי תנוהלנה על ידי סוכנות המחקר הלאומי הצרפתית (ANR) כחלק השני "הבדיקה של התוכנית" להילחם-HF (התייחסות: ANR-15-RHU4570004). עבודה זו ממומנת על ידי CNRS ואוניברסיטת דה לוריין (UMR 7365).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% תמיסת פורמלדהיד (w/v) ללא מתנולThermo Fisher Scientific28908לתיקון התאים
Alexa Fluor 488 של עז נגד ארנבThermo Fisher ScientificA-11008נוגדן משני פלואורסצנטי
Alexa Fluor 555 של עז נגד עכברThermo Fisher ScientificA-21425נוגדן משני פלואורסצנטי
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermo Fisher ScientificA34055נוגדן משני פלואורסצנטי
תקן אלבומין בסרום בקר (BSA)euromedex04-100-812-E
DMEMSigma-AldrichD5796-500mlמדיום תרבית תאים
Duolink באתרו מדיום הרכבה עם מדיום הרכבה DAPISigma-AldrichDUO82040-5ML
אנושי: תאי HeLa S3IGBMC, שטרסבורג, צרפתקו תאים המשמש לביצוע הניסויים
תמיסת מי חמצן 30% (H2O2)Sigma-AldrichH1009-100mlהמשמש כחומר לחץ
Lipofectamine 2000 ReagentThermo Fisher Scientific11668-019מגיב טרנספקציה
עכבר חד שבטי אנטי-coilinabcamab11822נוגדן ספציפי ל-coilin
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon Optiphot-2מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיניקון
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניתרמו פישר31985062מדעי מדיום טרנספקציה
PBS pH 7.4 (10x)gibco70011-036לשטיפת התאים
ארנב פוליקלונלי אנטי-53BP1תרמו פישר סיינטיפיקPA1-1656553BP1 נוגדן ספציפי
ארנב פוליקלונלי אנטי-EDC4Sigma-AldrichSAB4200114נוגדן ספציפי ל-EDC4
Triton X-100Roth6683כדי לחלחל לתאים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Substructure AnalyzerFluorescence MicroscopyImage SegmentationBioimage AnalysisCell Body DetectionSignal QuantificationIcy PlatformImageJ IntegrationNuclear TranslocationCajal Bodies

Related Articles