Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish
במאמר זה
סיכום
תקציר
החולה הנגזרים מודלים מבע הם קריטיים בהגדרת איך סרטן שונים להגיב לטיפול בסמים ב vivo system. מודלים של עכברים הם תקן בתחום, אבל דג זברה התפתחה כמודל אלטרנטיבי עם מספר יתרונות, כולל את היכולת של תפוקה גבוהה והקרנת סמים בעלות נמוכה. Zebrafish גם לאפשר בהקרנה vivo סמים עם מספרים שכפול גדול שהיו בעבר רק השגה עם מערכות חוץ גופית. היכולת לבצע במהירות מסכי סמים בקנה מידה גדול עשויים לפתוח את האפשרות לרפואה אישית עם תרגום מהיר של תוצאות חזרה למרפאה. Zebrafish מודלים מבע יכול לשמש גם מסך במהירות עבור מוטציות שימושי מבוסס על תגובת הגידול לטיפולים ייעודיים או כדי לזהות תרכובות אנטי סרטניים חדש מספריות גדולות. המגבלה העיקרית הנוכחית בתחום מהווה כמות ואוטומציה של התהליך כך שניתן יהיה לבצע מסכי סמים בקנה מידה גדול יותר ולהיות פחות בעלי עבודה. פיתחנו זרימת עבודה עבור דגימות המטופל הראשי xהשתלה לתוך הזחלים דג זברה וביצוע מסכי סמים בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה. שיטה זו מאפשרת סטנדרטיזציה וכימות של אזור גידול מנופה ותגובה לטיפול בסמים על פני מספר גדול של הזחלים דג זברה. בסך הכל, שיטה זו היא יתרון על ההקרנה המסורתית התרופה בתרבות התא כפי שהוא מאפשר צמיחה של תאים סרטניים בסביבה vivo במהלך טיפול בסמים, והוא מעשי יותר וחסכוני יותר עכברים בקנה מידה גדול במסכים vivo סמים.
מבוא
Xenografting שתלה של סרטן החולה הראשי או סרטן האדם קווי תאים לתוך אורגניזמים מודל היא טכניקה נפוצה בשימוש כדי ללמוד התקדמות הגידול והתנהגות vivo, התגובה הגידול לטיפול בסמים, ואינטראקציה תא סרטן עם מיקרוסביבה, בין היתר. באופן מסורתי, תאים מושתלים בתוך עכברים שנפגעו ממערכת החיסון, וזה נשאר התקן בשדה. עם זאת, מערכת זו מודל יש מגבלות מספר, כגון עלות גבוהה, נמוך לשכפל מספרים, קשיים באופן מדויק העומס הגידול בvivo, ואת הזמן המורחב שלוקח גידולים כדי לעבור בדיקות וסמים כדי להסתיים. בשנים האחרונות, דג זברה התפתחה כמו מודל חלופי מבע, עם הראשון שדווחו ב 2005, עם חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית מלנומה האדם קו תאים מושתלים1לתוך blastula-שלבהעוברים 1,2. לאחרונה, 2 יום לאחר הפריה (dpf) דג זברה הזחלים שימשו כנמענים מבע כדי לאפשר שליטה של מיקום אנטומיים של הזרקה ולשימוש ברזולוציה גבוהה vivo הדמיה של אינטראקציה הגידול עם מיקרוסביבה המקיפה3,4.
Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמודל השתל מבע ראשית, ניתן לאכסן דגי מבוגרים ולגדל במהירות בכמויות גדולות בעלות נמוכה יחסית. יכול לייצר מאות. דגי זחל בשבוע בשל גודלם הקטן, ניתן לתחזק את הזחל הזה ב-96-לוחיות הרישוי לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. הזחלים לא צריך להיות מוזן במהלך ניסוי טיפוסי מבע, כמו שק החלמון שלהם מספק את החומרים המזינים לקיים אותם בשבוע הראשון שלהם של החיים. יתר על כן, דג זברה אין מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין עד 7 dpf, כלומר הם לא דורשים הקרנה או מדכאים חיסוני משטרי לפני הזרקת מבע. בסופו של דבר, קווי דג זברה ברורים לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גידול מיקרואקולוגיה.
אולי היישום המבטיח ביותר של דג זברה כמו מודל מבע היא היכולת לבצע הקרנת סמים בתפוקה גבוהה על דגימות סרטן האדם באופן שאינו אפשרי באמצעות כל אורגניזם מודל אחר. הזחלים סופגים סמים מהמים דרך העור, ומשפרים את קלות מינהל התרופות5. מכיוון שבעלי חיים נשמרים ב-96-צלחות, בדרך כלל ב-100-300 μL של מים, המסכים דורשים כמויות קטנות יותר של סמים בהשוואה לעכברים. כיום, ישנן מספר שיטות שונות לסטנדרטיזציה וכימות ההשפעה של תרופות על נטל הגידול האנושי של דג zebrafish, כמה מהם הם מעשיים יותר מאשר אחרים עבור שדרוג בדיקות סמים יחיד להקרנה בתפוקה גבוהה. לדוגמה, קבוצות מסוימות מנתק דגים לתוך השעיה תא בודד, ו לכמת בצורה פלואורוסקופים או תאים סרטניים מוכתם על ידי הדמיה של טיפות בודדות של ההשעיה וכימות זריחה באמצעות ImageJ חצי אוטומטי מאקרו4. חצי אוטומטי למחצה הזחלים שיטת הדמיה פותחה בו דגי זחל תוקנו ב 96-היטב צלחות והדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה לפני היישור של תמונות מרוכבים וכימות של הגידול בתוך התאים6. שני הצדדים האלה הם למעשה שיטות תובעניות לעבודה עבור כימות, אשר עשה באמת התפוקה בקצב גבוהה הקרנת סמים ב-דג זברה מודלים מבע מעשי.
בעיה זו טופלה על ידי התפתחות של בעלי חוליות הקרנה אוטומטית טכנולוגיה (המכריע) bioimager ו חלקיקים גדולים (LP) דוגם, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי (איור 1 וטבלה של חומרים), שהיא שיטה אוטומטית באמת עבור תפוקה גבוהה הדמיה של הזחלים דג זברה7,8,9. עם יחידה זו, הדגים מורדם, שנדגמו באופן אוטומטי מצלחת 96-באר, ממוקם בקפילר ומסובבת לכיוון הגדרת מבוסס על העדפה משתמש מוגדרת מראש, התמונה, ולאחר מכן ממוקם בחזרה לתוך אותו טוב של הצלחת 96-באר חדש למחקרים נוספים או מושלך. שילוב זה טכנולוגיה הדמיה עם דג זברה xשתלי עשוי לאפשר את האפשרות של רפואה אישית המשתמשת הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של ספריות מתחם גדול סמים נגד גידולים החולה הפרט. זייברפיש xenografts גם להציע שיטה בקנה מידה גדול ובעלות נמוכה לבדיקת הן רעילות ויעילות של תרכובות הרומן ב vivo. Zebrafish יכול לשמש צעד הקרנה ראשונית לפני שתמשיך מודלים מבע העכבר.
פיתחנו זרימת עבודה יעילה עבור תאים מטופלים לוקמיה של החולה שתלה וביצוע מסכי סמים בתפוקה גבוהה עם הדמיה וכימות אוטומטי, אשר ניתן להחיל על כל התאים הראשוניים של החולה הראשי או קו התא של סרטן. זרימת עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה יחידת דוגם אוטומטי כדי לשפר את התקינה הנוכחית שיטות כימות ומציעה חלופה אוטומטית הקודם, יותר העבודה אינטנסיבית שיטות של המסה הגידול לכמת ב vivo.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על-ידי הוועדה המוסדית של אוניברסיטת קנטקי והשימוש בבעלי חיים (פרוטוקול 2015-2225). דגימות המטופל נאספו תחת הלוח המוסדי של אוניברסיטת קנטקי (פרוטוקול 44672). כל ניסויי החיות שבוצעו בעקבות פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית של המשתמש לטיפול בבעלי חיים.
1. מטופל ראשוני לוקמיה לימפובלסטית חריפה
- הפשרת החולה העיקרי דם היקפי תאים מוננונקה (PBMCs) ממלאי קפוא באמבט מים 37 ° c. מיד לאחר התאים הופלו, העברת תאים במדיה הקפאה שלהם (90% FBS + 10% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) ל 15 מ"ל שפופרת חרוטי עם ליטוף איטי, הימנעות בועות אוויר. הוסף 10 מ ל של prewarmed 37 ° צ' מדיה התאגף (25% סרום של שור עוברי [FBS] ב Iscove שונה בינונית של המדיום [IMDM]) dropwise (כ 2-3 ל-mL) לתאים בתוך 15 מ"ל צינור חרוט.
הערה: PBMCs נאספו דגימות דם החולה בזמן האבחון. מעיל באפי הופרד על ידי צפיפות צנטריפוגה ותאים נשטפו 2x ב RPMI 1640 + 10% FBS. תאים נספרו ו 107 תאים היו קפואים לקריובקבוקון 1 מ ל של הקפאת מדיה, ואוחסנו ב-80 ° c. - בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות ומין מדיה מתוך הגלולה התא. חזור על הוספת הפשרת מדיה, צנטריפוגה, ושאיפה נוספת להסרת DMSO שיורית.
- השהה תאים מחדש ב-5 מ ל של מלוחים באגירה מפוספז (PBS) והסר 10 μL לספירה על מונה תאים אוטומטי או הומוציטומטר. הוסף 10 μL של טרימטר כחול עד 10 μL של תאים שהוסרו לספירה. ספירת מספר התאים ל-mL ורשומה לחישוב מאוחר יותר של אמצעי האחסון להשהיה מחדש של תאים עבור השתלה של שתלה ראה שלב 2.5).
הערה: בדרך כלל, 500 תאים מושתלים. לדוגמה, 5 x 105 תאים נחוצים כדי להזריק 1,000 zebrafish. הכדאיות צריכה להיות > 85% לשימוש עבור השתלה של xenografting בניסוי זה, הכדאיות של התאים הייתה 96% לאחר היפיית, והעריכו על ידי טריפי כתמים כחולים.
2. בסיפוק תוויות תאים עם DiI
- צנטריפוגה את מספר התא הרצוי ב-5 מ ל של PBS ב 200 x g עבור 5 דקות ו-לאכול supernatant. כתם מינימום של 2 x 106 תאים במקרה של הסדר או בעיות טעינת המחט במהלך ההזרקה.
- לעשות 1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (dii) צביעת פתרון (5 מ ל של PBS המכיל 4 μl לכל mL של הכתם dii, שולחן של חומרים) ולהשעות את הגלולה תא בתמיסה הצביעת.
הערה: צפיפות התא לא תעלה על 2 x 106 תאים/mL כאשר הושעה מחדש בפתרון הצביעת. - בתאי הדגירה ב 37 ° צ' מוגן מפני אור עבור 20 דקות, ומערבולת בעדינות, ואז לאחר מכן דגירה תאים על הקרח עבור 15 דקות מוגן מפני אור.
- בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ו-לאכול supernatant. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ו-שטפי דם supernatant. חזור על השטיפה, הצנטריפוגה והשאיפה פעם נוספת.
- השהה תאים מחדש ב-1 μL של PBS לכל 250,000 תאים חיים והעבר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. לשמור על השעיית תאים מחדש על קרח בחושך ומיד להמשיך מיקרו זריקות.
הערה: זה מבטיח כי 500 תאים החולה מוזרק לתוך דג דג זברה כל משאבת הזרקת של 2 nL נפח.
3. הרימות מיקרוזרקת דגים
הערה: מיקרו זריקות צריך להסתיים בתוך 1-3 h של כתמים כדי לשפר את הכדאיות של תאים.
- לפני צביעת תאים והזרקת, להפוך לוחיות להזריק על ידי שפיכת 25 מ ל של 3% agarose ב-1x טריס/בוראט/EDTA (TBE) לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לגבש. הצלחות בחנויות ב -4 ° c עד שבועיים.
- גם לפני צביעת תאים והזרקת, ביטול 2 dpf דג באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ מבתר. לקבלת משיכה ידנית, למשוך מקצוות מנוגדים של chorion מגן הדגים עם מלקחיים עד הדמעות chorion הדגים הופך להיות ללא עטוף10.
הערה: ניתן לבצע גם באמצעות טיפול אנזימטי באמצעות הפרואז, כפי שמתואר בעבר10. קספר (רועי-/-; היארי-/-) זייברפיש שימשו לניסויים אלה11. ניתן להשתמש בכל מאמץ זחל. להשתלת-השתלה אם פיגמנט מפריעה הדמיה או הדמיה, הטיפול מאפשר להשתמש כדי לחסום סינתזה המלנין אם זנים ברורים של ברור דג זברה אינם זמינים12. - מחטים prechill ב 4 ° צ' או על הקרח כדי למנוע החלקה של תאים במהלך מיקרו הזרקה. טען 5 μL של תאים ויטראז ' לתוך מחט זכוכית מקורר בורוזאמייסיליקט באמצעות מיקרוטוען מיקרו מעמיס טיפים.
הערה: שיטות ההתקנה של מיקרו מזרק ומחט פורסמו בעבר13. - לטעון את המחט לתוך הזרוע מיקרו מזרק. השקוע את קצה המחט באמצעות להב גילוח סטרילי. מדוד את גודל droplet בשמן מינרלי באמצעות מיקרומטר שלב, שמירה על נפח droplet בעקביות ב 2 nL (~ 0.15 מ"מ קוטר) ברחבי.
- השתמש ב-350 μL של 4 מ"ג/mL tricaine-S להרדמה ~ 30 ביטול 2 dpf דג בצלחת פטרי המכילה 25 מ ל של E3 מדיה. לאחר ~ 1 דקות העברת הזחלים מורדם לצלחת הזרקה שטוח (3% העלה בצלחת פטרי) ולהזריק הזחלים עם משאבה אחת של תאים ויטראז באתר ההזרקה הרצוי (למשל, חלמון או קרום הלב; ראה איור 2א, ב).
הערה: אתר ההזרקה צריך להיבחר על בסיס מטרת הניסוי. אתר ההזרקה השכיח ביותר הוא החלמון. כדי לקבל תאים במחזור הדם, קרום הלב, הצינור של Cuvier, מרחב perivitelline, או משטח רטרו מסלולית ניתן להשתמש כאתרי הזרקה. ניתן להשתמש גם באתרי הזרקה אורתוטופית, כגון המוח. - לשטוף את הזחלים את לוחית ההזרקה לתוך 10 ס מ2 צלחת פטרי (30 הזחלים לצלחת) המכיל E3 מדיה14 ללא מתילן כחול ו דגירה ב 28 ° צ' עבור 1 h תקופת ההחלמה. המשיכו להזריק עד שמספר הזחלים המבוקש הוזרק.
הערה: באופן אידיאלי, הכנס 2-2.5 לקפל את מספר הזחלים הדרושים לניסויים. יהיו כמה למות של הזחלים בשל לחץ מפני הזרקה ואת טמפרטורת הדגירה מוגברת. בדרך כלל, לאחר התרגול עם הטכניקה, ניתן להזריק 800 ש ח הזחלים מתוך 1 עד 3 כאשר תאים מוכתמים צריך להזריק. - להעביר צלחות של הזחלים מוזרק לאינקובטור 34 ° c. אין להניח את מנות פטרי של הזחלים ישירות על מדף מתכת בחממה כדי למנוע התחממות יתר של המים E3. לדוגמה, מניחים צלחת פטרי ריקה בין המדף לבין צלחת פטרי של הזחלים לפעול כחוצץ. הסרת מתים הזחלים המלח לאחר 24 ו 48 שעות לאחר הזרקת (hpi).
4. הגדרת מסך הסמים עם דגי מנובתרים
-
ב 48 hpi, המסך דג זברה הזחלים עבור מיפתח זריחה/גידול בריאות (איור 2C, D). הוציאו ממנו את הדגים המתים או הפגומים, ובחרו בציידג עם חרט דומה (איור 2ג, ד, 1-3 ו-1-3). הסירו ממנו את הדגים (איור 2C, D, 5 ו -5).
- עבור החלמון דגים מוזרק, להסיר דגים שבו גבולות החלמון לא ניתן לראות סביב מיסת התא מנופה (איור 2C, 4) כפי שהוא עושה קשה לכמת. עבור קרום הלב מוזרק דגים, להסיר דגים שם מוזרק תא המסה פולש לתוך שק החלמון (איור 2D, 4 ').
- . מוסיפים דג בצלחת 96 כדי לעשות זאת, לחתוך את הקצה של טיפ 200 μl הצינורות, רק גדול מספיק עבור 4 הדגים דג זברה להשתלב. מרוקן 150 μl של E3 מדיה עם אחד דג זברה מן הצלחת באמצעות P200, ולהוסיף לבאר ריקה של שטוח בתחתית 96-באר צלחת.
- לדלל את הסם כדי להיבדק בנפח הנדרש של E3 מדיה, ב 150 μL לכל טוב. הכן תרופה ב-2 מקפלים את הריכוז הרצוי. לדוגמה, הכינו 20 μM של תרופות ב-E3 אם הריכוז הסופי הרצוי הוא 10 μM, כיוון שמחצית הנפח הכולל בכל באר מורכבת מפתרון התרופה. עבור קבוצת הבקרה DMSO, הוסף DMSO באותו אמצעי אחסון כמו התרופה.
- הוסף 150 μl של הפתרון התרופתי מדולל 2x לכל טוב המכיל את הזחלים דג זברה ב 150 μl של E3, עבור נפח הסופי של 300 μl עם פתרון התרופה 1x לכל טוב.
- מודקת את הצלחת ב 34 ° c. . תבדקי אם יש דג מת מדי יום לאחר יומיים, אם תרצה, לרענן את הסם על ידי הסרת 200 μL של נוזל מכל טוב של הצלחת 96-באר והחלפת עם 200 μL של 1 x מדלל פתרון תרופה או DMSO ב-E3 מדיה.
הערה: התוצאות הטובות ביותר נמצאו לאחר 3 ימים של טיפול תרופתי לניסוי זה; עם זאת, אורך הטיפול בסמים יכול להשתנות בין 2 ל -4 ימים, וייתכן שיהיה צורך למטב את השימוש בניסוי שנעשה או שימוש בסמים.
5. הדמיה Xenografted דגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת דימות ויחידת סמפלר אוטומטית
- להכין 1 L של טרי 4 מ"ג/mL tricaine ו 1.5 L של E3 מדיה. מילוי בקבוק מדיה 1 עם E3 מדיה בקבוק מדיה 2 עם tricaine.
- הסר את כל ערוצי הפלורסנט הלא רצויים בתוכנת הדימות והוסף את הערוץ הרצוי (DiI לניסוי זה). בדוק את ערוץ הפלורסנט הרצוי כתמונה רק עבור הערוצים עם סימן ביקורת. כמו כן, בחר כיצד התמונות יילקחו (z-ערימות, אוטומציה, לולאות בסדרה, וכו ').
הערה: עבור ניסוי זה, המוקד הוגדר באופן ידני עבור כל התמונות דגים כדי להשיג את המספר הגבוה ביותר של דימויים עם מיקוד אופטימלי. - התמונה של דג הבקרה DMSO לפני הדג שטופלו בסמים, כך שניתן יהיה להגדיר את זמן החשיפה המתאים בתוכנת הדימות. לאחר הגדרת החשיפה, אל תשנה את זמן החשיפה למשך הניסוי.
הערה: המוקד יכול להיות מותאם באופן ידני עבור כל דג בכדי להבטיח שאין מתוך תמונות מיקוד, או עבור הדמיה אוטומטית לחלוטין, את המוקד אותו ניתן להשתמש בין דגים עם מתוך מיקוד תמונות להיות מושלך או דגים מחדש לפני ביצוע ניתוח. יתר על כן, ניסוי זה יכול להתבצע על ידי שימוש בכל אננגר פלורסנט ואחריו כימות הניאון באמצעות התוכנה ImageJ.
6. כימות הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות ImageJ
- פתח את תוכנת ImageJ.
-
עבור לקובץ | פתח ובחר בקובץ. czi הרצוי. התוכנה תביא חלון אפשרויות ייבוא.
- להצגת מחסנית בחירת היפרערימות, בדוק את האפשרות פתח קבצים בנפרד, בדוק את קנה מידה אוטומטיובדוק ערוצים מפוצלים. לאפשרות ' צבע ' בחר ' צביעת'.
- לחץ על תוספים | פקודות מאקרו | רשומה.
- לחץ על תמונה | כוונן | הסף. בחר סוג תמונה כאדום בתפריט הנפתח שבצידו השמאלי של חלון הסף. התאימו את הסף המינימלי עד שהתוכנה רק ממירה אזורים בעלי קרינה פלואורסצנטית (איור 3A) ולחצו על ' החל '. התוכנה תמיר את התמונה לשחור-לבן, עם האזור שנבחר בשחור.
הערה: השתמש באותו סף עבור כל תמונה במסך התרופה כדי לשמור על תוצאות סטנדרטיות ודומות. - לחץ על נתח | . תמדודאת זה התוכנה תמשוך חלון תוצאות המכיל את אזור הפלורסנט עבור תמונה זו.
- לחץ על יצירה בחלון מקליט המאקרו . פעולה זו תפתח חלון חדש עם הקוד עבור המאקרו. סמן את כל התמונות הרצויות לניתוח ופתח כמו בשלב 6.2.
- בחר באפשרות הפעלה בחלון עם המאקרו. חלון התוצאות יכיל כעת את האזור עבור כל תמונה.
הערה: ניתן לבצע את ניתוח התמונה בנפרד מבלי להקליט ולהפעיל מאקרו, כמו גם על-ידי חזרה על השלבים שלעיל עבור כל תמונה. - העתק את הנתונים שנמדדו לתוך גיליון אלקטרוני. ממוצע הקרינה הפלואורסצנטית הכוללת של כל שליטה (DMSO) דגימות. חשב את ההפרש באחוזים באמצעות הנוסחה הבאה: – [(אזור DMSO ממוצע – אזור ניסיוני)/ממוצע DMSO אזור] x 100% (איור 3B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, דג דג זברה היו מושתלים בחלמון ואת קרום הלב עם pbmcs החולה הראשי שהיו מבודדים במקור לוקמיה לימפובלסטית חריפה בתאי t (t-ALL) מטופל באבחון הפקדה כמדגם בר קיימא, קפוא. ב 48 hpi, דגים x, מושתלים הוקרן עבור פלואורוסקופים בעלי תווית תאים סרטניים (איור 2ג, ד) ומטופלים עם כימותרפיה (dexamethasone או VINCRISTINE) או dmso. הדגים התמונות היו על 7 dpi, לאחר 3 ימים על טיפול בסמים באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, הדגמנו שיטה סטנדרטית להחדרה והזרקה של תאי לוקמיה של המטופל העיקרי לתוך דג דג זברה כמודל מבע. כמו כן הקמנו פרוטוקול עבור הקרנת התרופה בתפוקה גבוהה של דגי מכסימום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי. בעבר, שתלי xenografts עם קווי התאים האנושיים, וכימות של גידולים xenografts באופן תפוקה גבוהה היתה אתגר בתחום. שיטה זו משמשת כבסיס למחקרים כדי לנצל מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה כדרך להפוך את ההדמיה של הדמיה של x, עם המטרה האולטימטיבית של ביצוע מס...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה היה נתמך על ידי פרס V המלומד הקרן v ו NIH מענקים DP2CA228043, R01CA227656 (ל ס בלקברן) ו NIH הדרכה מענק T32CA165990 (כדי מ Haney).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תרכיז נוזלי 10x TBE | VWR | 0658-5L | |
| צלחת 96 בארות, תחתית שטוחה | CELLTREAT | 229195 | VAST תואם למגוון צלחות באר סטנדרטיות או עמוקות 24, 48 או 96 בארות |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| נימי זכוכית בורוסיליקט ללא נימה | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| דקסמתזון | אנזו מדעי החיים | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | סיגמא-אולדריץ' | D2438-5X10ML | |
| E3 מדיה | N/A | 5 מ"מ NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 מ"מ MgSO4 | |
| Femtotips טיפים מיקרו-מעמיס טיפים | אפנדורף | 930001007 | |
| סרום בקר עוברי (פרימיום לא מופעל בחום) | אטלנטה ביולוגית | S11150H | |
| תמונהJ | פיג'י | N/A | |
| STEMCELL Technologies | Medium STEMCELL Technologies של Iscove's Modified Dulbecco | 36150 | |
| דגימה | ביומטרית | N / A | יחידת דגימה אוטומטית http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| מטוטרקסט | סיגמא-אולדריץ' | A6770-10MG | |
| שמן מינרלי | פישר סיינטיפיק | BP26291 | |
| פוספט חוצץ מלח (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| מיקרומטר שלב (400 שלב) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/ | יחידת הדמיה מצוידת במיקרוסקופ פלואורסצנטי https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
מקורות
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281(2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
