הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

17.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60998

⸱

9 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

תקציר

שתי ממדיות (2D) תרביות תאים לא לחקות את הגידול vivo בסדר משביע רצון. לכן, מודלים תלת ממדיים (3D) תרבות ספרואיד פותחו. מודלים אלה עשויים להיות חשובים במיוחד בתחום של נוירולוגיה-אונקולוגיה. אכן, גידולים במוח יש נטייה לפלוש לסביבת המוח הבריא. אנו מתארים זאת באופן אידיאלי 3d גליובלסטומה המבוססת על מבוססי שפיתחנו לחקור את הפלישה הגידול. אנו מספקים את כל הפרטים הטכניים והכלים האנליטיים כדי לבצע בהצלחה את השיטת העבודה.

מבוא

ברוב המחקרים באמצעות קווי תא ראשי או מסחרית, בחני מבוצעים על תאים שגדלו על משטחי פלסטיק כמו תרבויות דופלקס. ניהול תרבות התא ב-2D מייצג חסרונות, כפי שהוא אינו מחקה בסביבת תא vivo 3D. בתרבויות דו-ממדיות, כל משטח התא הוא ישירות במגע עם המדיום, שינוי צמיחת התאים ושינוי זמינות התרופה. יתר על כן, משטח פלסטיק לא פיזיולוגי מפעיל בידול תא1. מודלים תלת ממדיים של תרבות פותחו כדי להתגבר על הקשיים הללו. יש להם את היתרון של לחקות את האדריכלות הרב-תאיים ואת טרוגניות של גידולים2, ולכן יכול להיחשב למודל רלוונטי יותר עבור גידולים מוצק3. המבנה המורכב של הספרואידים תורם להערכה טובה יותר של חדירה לסמים והתנגדות4. הגידול טרוגניות ב ספרואיד משפיע על הדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, ואת התגובה של סוכני תרופתי (איור 1A). דיפוזיה של חמצן משתנה כאשר גודל ספרואיד מגיע 300 μm, גרימת סביבה ארוי במרכז הספרואיד (איור 1A, C). מטבוליטים הם גם פחות חודר דרך שכבות התא והתגובות מטבולית לפצות להתרחש5. כאשר קוטרו של מגדיל ספרואיד, ליבות נקרוטיות ניתן לצפות, עוד מאפיינים לחקות המצויים בסוגי סרטן מוצק רבים, כולל סרטן המוח האגרסיבי גליובלסטומה (GBM)6.

מספר הפלישה 2d או 3d שאומר עבור gliנובלסטומה דווחו בספרות7,8. מימד דו-מימדי הם בעיקר לחקר הפלישה במישור אופקי על שכבת מטריצה דקה או בתוך שיטת הקאמרית Boyden9. תלת מימדי בחני שתוארו עם תרבויות תלת-ממד ספרואיד באמצעות קווי התאים הקלאסיים גליובלסטומה10. גרסאות מורכבות יותר מיוצגים על ידי פלישה של אורגנואידים המוח על ידי spheroids הגידול בתרבויות העימות11. עם זאת, עדיין חשוב לפתח שיטת קל לשימוש ושימוש בלתי זמין לכל מעבדה. פיתחנו פרוטוקול לייצר תאים של גזע גלנובלסטומה מדגימות המטופל. הקוונפיקציה של מספר אלה ניתן לניהול בקלות ודורשת רק תוכנה מקוונת גישה לפתוח. בקצרה, חתיכות הגידול הם חותכים לחתיכות קטנות מתעכל באמצעות אנזימטי. תאים בודדים הנגזרים מהעיכול מעובדים במדיום נוירו-בסיס. לאחר 4-7 ימים, מבנים ספרואיד יוצרים באופן ספונטני. עם השרשה הגולגולתית בדגמי עכברים, הם יוצרים גידולים המציגות ליבה נקרוטיק מוקפת בתאי מדומה-פאליפורם12. זה דומה מאוד למאפיינים המצויים בחולים GBM.

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לייצר spheroids מתוך מספר נחוש של תאים כדי להבטיח התוכסות. ניתן להשתמש בשני מטריצות משלימות למטרה זו: מטריצות וסוג קולגן I. מטריצות מועשר בגורמי גדילה ומחקה את קרום המוח הבזתי הנדרש לתא המצורף והגירה. מצד שני, קולגן סוג אני, אלמנט מבנית של משתית, הוא הנפוץ ביותר fibrillary מטריקס מטריצה והוא משמש הפלישה התא assays. להלן, אנו ממחישים את המודל הספרואיד שלנו על-ידי ביצוע הגירה והפצת מוסר. ניתוח נעשה לא רק בנקודות בזמן קבוע אלא גם על ידי ניטור התרחבות ספרואיד ותנועת התאים על ידי הדמיה חיה. יתר על כן, המיקרוסקופיה אלקטרונית נעשתה כדי להמחיש פרטים מורפולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסכמה בכתב מושכלת הושגה מכל המטופלים (מבית החולים האוקלאני, ברגן, נורבגיה על פי תקנות וועדת האתיקה המקומיות). הפרוטוקול שלנו עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המוסד האנושי.

1. הדור של הגידולים הסרטניים בגודל אחיד

הערה: תאים כמו גזע הם מתורבתים בינונית נוירובסיס משלימה עם תוספת B27, הפארין, FGF-2, פניצילין, ו סטרפטומיצין, כפי שמתואר בסעיפים הקודמים12. תאים אלה יוצרים באופן ספונטני את הספאידים בתרבות.

  1. לשטוף את התאים הסרטניים עם מלוחים 5 מ ל פוספט באגירה (PBS) ו הדגירה של תאים עם 0.5-1 mL האנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° c.
  2. לשטוף עם 4-4.5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ ל של הצמיחה המלאה בינונית (מדיום neurobasal סיס מלא, cNBM).
  3. ספור את התאים תוך שימוש בטכניקת ספירה אוטומטית עם טרי, כחול ושקופית תא ספירת תאים.
  4. כדי ליצור 100 spheroids עם 104 תאים לספרואיד (לפי גודל מועדף), לערבב 106 תאים ב 8 מ ל Nbm עם 2 מ ל של 2% מתילצלולוזה.
  5. להעביר את ההשעיה אל מיכל סטרילי מערכת ולוותר 100 μL/ובכן עם פיפטה רב-ערוצית לתוך הלוח 96 בסיבוב התחתון היטב.
  6. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2 ו 95% לחות. שוויון בגדלים שווים יהיה ליצור וניתן להשתמש בהם לאחר 3-4 ימים.

2. ניסויים תלת-ממדיים

  1. תפשטות
    1. כנה
      1. להשעות מעכבי (למשל, rotenone כמו באיור 4א) וכימיקלים ב 100 μl של בינוני ולהוסיף 100 μl של בינוני בכל טוב (כלומר, אחד ספרואיד לכל טוב).
      2. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2, ו 95% לחות.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות עם מיקרוסקופ וידאו ב ברייטפילד כדי ליצור סדרה של תנאים ב-T0 והמועדים הבאים צפויים.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר עיגול סביב הליבה ספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור של כל ספרואיד. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו המוצג במסמך משלים 1 עם האזור המרכזי בלבד.
  2. פלישה
    1. כנה
      1. הכן את מטריצת קולגן בשפופרת על הקרח עם סוג אני קולגן ב 1 מ"ג/mL הריכוז הסופי, 1x PBS, 0.023 החמישה עשרקולגן, 1 M נתרן הידרוקסיד, ו-H סטרילי2O. הפתרון על הקרח עבור 30 דקות.
      2. לאסוף spheroids מן התחתון העגול צלחת הבאר ב 500 μL צינורות ולשטוף 2x עם 200 μL 1x PBS.
      3. פיפטה את הספרואידים בקפידה לתוך 100 μL של מטריצת קולגן ולהכניס במרכז באר בצלחות רגילות 96 טוב.
      4. דגירה ג'ל קולגן עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן להוסיף cNBM על גבי ג'ל. מעכבי או מפעילים (למשל, מימן כלוריד כפי שמוצג באיור 4ב, 4c) ניתן להוסיף למדיום בשלב זה.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות ברצף עם מיקרוסקופ וידאו במצב ברייטפילד 24 שעות לאחר הכללת קולגן.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר סביב הליבה ואת האזור הכולל של הספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור פולשני של כל ספרואיד על ידי הפחתה באזור כולל עם אזור הליבה. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1 כדי לקבוע את האזור הפולשני.
  3. העברה
    1. כנה
      1. מעיל לוחית 6 היטב עם מטריצות (0.2 mg/mL) ב NBM עבור 30 דקות ב 37 ° c, לאחר מכן להסיר את מטריצות ולהוסיף 2 מ ל cNBM.
      2. העברת spheroids לתוך 50 μL של cNBM מצלחת התחתונה העגולה היטב עד 6 צלחת הבאר.
      3. מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ולחכות 30 דקות כדי spheroids לדבוק.
      4. לאחר 24 שעות של דגירה, כתם עם 10 ng/mL של Hoechst ו הדגירה 30 דקות ב 37 ° c.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ וידאו ברייטפילד. לייזר 405 ננומטר משמש להדמיה של כתמים מואכסט.
      2. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לנתח תמונות ולהפעיל את המאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1.
        הערה: נגיעה בתחתית הבאר או הסרת לחלוטין את נזקי הסופרנאנט. עבור סוג קולגן אני ג'ל טיפול, לשמור על הג על הקרח כדי למנוע הקולגן פולימור, לא להוסיף רכיב חומצי כי השינוי ב-pH ישפיע על הקומפקטיות של הג, ו פיפטה תאים במהירות לתוך הקולגן כדי למנוע את המוות התאים ואת ההשפלה של ג'ל.

3. מאקרו פיג'י

הערה: פיג'י היא תוכנית ניתוח תמונה שפותחה בתחום הציבורי המאפשר פיתוח של פקודות מאקרו כדי להאיץ את ניתוח התמונה. ניתוח ידני אפשרי גם, אבל זהו תהליך איטי והוא עשוי להציג הטיות. ניתן לייבא תמונות על-ידי גרירה ושחרור בתוכנה וכימות עם תוסף מנהל הכלים של ROI. הנוהל המשמש במחקר זה מתואר להלן:

  1. פתח את חלון המאקרו: תוספים | פקודות מאקרו | מתרגם אינטראקטיבי.
  2. העתק והדבק את הלולאה הסגולה הבאה שהותאמה. שמור על המשפטים הסגולים והוסף את משפטים הריבית הירוקים (מסמך משלים 1).
  3. כדי לנתח את הסידרה כולה, התאימו את הפרמטרים באדום לקוונפיקציה מסוימים והפעל את המאקרו באמצעות פקודות מאקרו | הפעל מאקרו או הקש Ctrl + R.
  4. בדוק ובמידת הצורך, התאם ידנית את אזור הריבית (ROI).

4. מיקרוסקופ אלקטרוני של מספרואידים

הערה: יש לבצע את רוב הצעדים הבאים במכסה כימי.

  1. שלב קיבוע
    1. לאסוף את הספרואיד עם טיפ חיתוך לחתוך, לשים אותו בצינור 1.5 mL, ולשטוף 1x עם 0.1 M פוספט מאגר (PB).
    2. תקן את הלילה הספרואיד ב -4 ° c ב-2% גלוטרלדהיד/2% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) ב-0.1 M PB.
    3. החליפו את פתרון הקיבעון בתמיסה של 1% בכיוון התנועה ב0.1 M PB ולאחריה הכנה לדוגמה.
  2. הכנה לדוגמא
    1. להעביר את הספרואידים לתוך מסננת ולשים אותם בתוך גביע זכוכית כדי למנוע נזק כלאיד.
    2. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
    3. , מיכל הלילה. דלל את אוסמיום ל 4% ב 1% 0.1 M PB מאגר.
    4. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
      1. הדמיים כדלקמן: להשרות ב-50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, 2x 90% אתנול עבור 15 דקות, 2x 100% אתנול עבור 20 דקות, ו-2x אצטון עבור 30 דקות.
    5. מודטה את הדגימות בתערובת 50/50 של אצטון/שרף עבור 2 h. במהלך שלב זה, להכין את שרף EPON (להטביע-812:11.25 g; DDSA: 9 גרם; NMA: 4.5 g).
    6. להיפטר אצטון/שרף תערובת, להחליף עם שרף שהוכן טרי, הדגירה הלילה.
    7. החלף את השרף על ידי אחד חדש ו-דגירה בין 2-6 h.
    8. מוסיפים את הספרואידים בשרף לתוך עובש ב 60 ° c עבור 48-72 h.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הספרואידים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקולים ותצפיות נעשו לגבי הגירה, פלישה, התפשטות ומיקרוסקופ. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה כדורית, כתמים carboxic התשיעי המשמש לקביעת פעילות ארוי (איור 1א-ג). תאים CAIX-חיוביים נוספים נצפו במרכז ספרואיד (איור 1א-ג). תאים ארוי ממוקם בליבת ספרואיד נוטים להיות גליקוליטיק יותר מאשר אלה שמסביב. ניתן להציג את המיטוסקופיה לניתוח נוסף כפי שמוצג על ידי אלקטרון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הגידול ספרואיד בחני מותאמים היטב כדי ללמוד מאפייני הגידול כולל התפשטות, פלישה, הגירה, כמו גם מוות תאים ותגובת סמים. תאים סרטניים לפלוש מטריקס 3D ויוצרים גידול פולשני מיקרו, כפי שנראה באיור 4B, C. במהלך התהליך פולשנית, מטריצה מטאלואוטיות (MMP) לעכל מטריצות מסביב תאים סרטניים13, ו mmp מעכבי (g., GM6001 או Rebimastat) עלול לפגוע בפלישה לתא אבל לא הגירה14. ההגירה והפלישה כרוכות באירועים מולקולריים אך נפרדים, הניתנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre הסרטן (הקומיא דה לה גירדה et דה לה Charente-ימית). Joris Guyon הוא מקבל התחברות מבית החולים באוניברסיטת טולוז (CHU טולוז).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 צלחת תחתונה עגולה היטבFalcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-01מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, אנזים דיסוציאציה כדורית
B27Gibco12587מאוחסן ב-20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש
Basic Fibroblast Growth FactorPeprotech100-18Bמאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתInvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-500מאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות;
C תוכנת פיג'יImageJמשמשת לניתוח תמונות
בקבוק 75 ס"מ2Falcon10497302
MatrigelCorning354230מאוחסן ב-20 מעלות; C, מדולל לריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל ב-NBM
MethylcelluloseSigmaM0512מדולל ב-NBM לריכוז סופי של 2%
NBMGibco21103-049מאוחסן ב-4 מעלות; C
מדיום נוירובזאליGibco21103049מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
פניצילין - StreptomycinGibco15140-122מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
טריפן כחול 0.4%ThermoFisherT10282משמש לספירת תאים
354236 קולגן מסוג Iמאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג
קר

מקורות

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219(2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FijiCarbonic Anhydrase IX
מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.