Method Article

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיבים עמילואיד קשורים מספר מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון, או אלצהיימר. העמילואיד הללו יכול להתאים חלבונים אנדוגניים, כמו גם רכיבים של רשת פרוטאוסטזיס (PN) ובכך להחריף את החלבון misfolding בתא. יש מספר מוגבל של כלים הזמינים כדי להעריך את תהליך הצבירה של חלבונים עמילואיד בתוך בעל חיים. אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופ לכל החיים של הזריחה (FLIM) המאפשר ניטור כמו גם כימות של העמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, בצורה לא פולשנית ועם ההתקדמות של הזדקנות על הפרטורציה של PN. FLIM אינה תלויה ברמות הביטוי של הפלואורוופפור ומאפשרת ניתוח של תהליך הצבירה ללא כתמים או הלבנה נוספים. Fluorophores הם מורהים כאשר הם בקרבת מבנים עמילואיד, אשר גורמת לירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית. הקוצ'ינג מתואם ישירות לצבירת חלבון ה-עמילואיד. FLIM היא טכניקה רב-תכליתית שניתן להחיל כדי להשוות את תהליך fibrilization של חלבונים עמילואיד שונים, גירויים סביבתיים, או רקע גנטי vivo באופן לא פולשני.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבירת חלבונים מתרחשת הן בהזדקנות והן במחלה. המסלולים להוביל היווצרות והתצהיר של amyloids גדול או אמורפיות קשה לעקוב אחר הקינטיקה שלהם הם דומים מאתגרת לפענח. חלבונים יכול להטעות בשל מוטציות פנימיות בתוך רצפי הקידוד שלהם, כמו במקרה של מחלות גנטיות. חלבונים גם misfold כי הרשת פרוטאוסטזיס (PN) שמשאיר אותם מסיסים ומקופל כראוי הוא לקוי, כפי שקורה במהלך ההזדקנות. ה-PN כולל מלווים מולקולריים וmachineries השפלה והוא אחראי על ביוגנזה, קיפול, סחר והשפלה של חלבונים1.

ג. אלגיה התפתחה כמודל לחקר הזדקנות ומחלות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הטבע האיזוגני וקלות התפעול הגנטי. מספר זנים של C. אלגיה המבטאים את החלבונים ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סנכרון הג

  1. סינכרון C. אלגיה או באמצעות הטיפול היפוכלוריט פתרון אלקליין או דרך הנחת ביצה פשוטה עבור 4 h ב 20 ° צ'8.
  2. לגדול ולתחזק נמטודות ב 20 ° c על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות שנזרע עם OP50 E. coli על פי הליכים סטנדרטיים9. גיל הנמדות עד לשלב או ליום ההתפתחותי המבוקש.
    הערה: בפרוטוקול זה, מבוגרים צעירים מתתמונות ביום 4 והנמטודות הישנים מתתמונות ביום 8 של החיים.

2. RNAi-בתיווך הסתרה של מכונות המלווה באמצעות האכלה

הערה: ביצוע הנוק-אין של חלבון הלם חום 1 (hsp-1) המלווה על ידי הזנת וקטור rnai המקביל ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מראה כיצד לפקח באופן מדויק על היווצרות מינים צבורים בתוך החיים,הן במהלך ההזדקנות הטבעית וכאשר הם חשופים ללחץ. בחרנו ארבעה זנים שונים של נמטודות המבטא חלבונים polyglutamine של או 40q, 44q, או 85 q חוזר על עצמו. חלבונים אלה מסונתז ברקמות שונות התמזגו fluorophores שונים. ה -C. אלגיה זנים הביעו Q40-mrfp בשרירי קיר הגוף (MQ40-rfp), Q40-CFP במערכת העצבים (NQ40-cfp), או Q44-yfp או Q85-yfp במעי (IQ44-yfp ו IQ85-yfp)13. כדי להמחיש כיצד ההזדקנות מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה מבוססת-מיקרוסקופית לזיהוי מינים צבורים במערכת המודל של C. אלגיה . FLIM יכולה לאפיין במדויק את הנוכחות של מינים צבורים ומסיסים התמזגו לפלואורופור באמצעות מדידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית שלהם. כאשר חלבון היתוך מתחיל לצבור חיים ממוצע מוקלט שלה יעבור מגבוה יותר לערך נמוך יותר16. הנטייה של מצבור יכול להיות להסיק על ידי ירידה בחיים: ככל שתקופת החיים נמוכה יותר, הנוכחות של מינים מצטברים של חלבון במערכת. ובכך, זה הופך להיות אפשרי לעקוב אחר ההשפעות של הזדקנות, מח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתח שרירים-Q40-mRFP שסופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). הQ40-CFP היה מתנה מהסוג של מעבדת מורימוטו. אנו מכירים DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי אשכול נוירוקיור של מצוינות to MLP), EMBO (האחווה לטווח קצר MLP) והחברה של ביולוגים (מענקים נסיעה ל-CG ו MLP) עבור מימון. אנו מכירים גם את מתקן הדימות המתקדם של מיקרוסקופ האור במרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית, ברלין, על מנת לספק את הכיוונון לדימוי המבנים של YFP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co.KG K029.3Antibiotic
B& H DCS-120 SPC-150בקר & Hickl GmbHFLIM תוכנת Aquisition
B& H SPC830-SPC תמונהבקר & Hickl GmbHFLIM Aquisition software
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677רכיב NGM
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPמתנה נדיבה ממעבדת Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPמתנה אדיבה ממעבדת מורימוטו
C. elegans nQ40-CFPמתנה נדיבה ממעבדת Morimoto
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2תלושי כיסוי
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGהרכבה סטריאומיקרוסקופ
Leica TCS SP5Leica מצלמה AGמיקרוסקופ קונפוקלי
Levamisole הידרוכלורידAppliChem GmbHA4341חומר הרדמה
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM תוכנת אקוויזיציה
נתרן אזידקארל רוט GmbH + Co.KG K305.1
נתרן כלוריקארל רוט GmbH + Co. KG3957.2רכיב
NGMStandard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1שקופיות זכוכית
אוניברסלי AgaroseBio & למכור GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGמיקרוסקופ קונפוקלי
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGמיקרוסקופ קונפוקלי
מאלחש

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles