הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

6.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61018

⸱

29 במרץ 2020

 , 
1Department of Pharmacology, UC Davis School of Medicine

במאמר זה

סיכום

Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג'ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.

תקציר

שינויים תלויי-הפעילות ברמות קולטני הסינפטיות (AMPARs) בתוך צפיפות הפוסט-סינפטית (PSD) נחשבת לייצוג מנגנון הסלולר ללמידה ולזיכרון. Palmitoylation מסדיר את הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים סינפטיים רבים כולל אמפא-Rs, גורמי עזר ומקפלים סינפטיים באופן תלוי-פעילות. זיהינו את הסינפסה המושרה גן (syndig) משפחה של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים חלבון טראנסממברנלי השייך ampars ולווסת את הכוח סינפסה. SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות ציסטאין הממוקמים במיקום 191 ו 192 באזור juxta-טרנסקרום חשוב עבור פיתוח התפתחות הפעולה התלויית-סינפסה. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית ביוכימית, משמרת ג'ל החליפין של acyl-PEGyl (אפגס), כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין ולהדגים את כלי השירות שלה עם משפחת הסינדיג של חלבונים במוח העכבר lysates.

מבוא

S-palmitoylation הוא שינוי הפיך לאחר השינוי של חלבונים היעד המסדיר האיגוד קרום יציב, סחר בחלבונים, ואינטראקציות חלבונים חלבון1. זה כולל תוספת של 16-פחמן palmitate moiety כדי שאריות ציסטאין באמצעות הצמדה מזרז ההצמדה של palmitoyl (PAT) אנזימים. חלבונים סינפטית רבים במוח הם palmitoylated, כולל האמפא-Rs ו-PSD-95, באופן התלוי בפעילות כדי להסדיר את היציבות, הלוקליזציה והפונקציה2,3,4. שינויים ברמות הסינפטית של AMPARs ב-PSD באמצעות האינטראקציה של גורמי עזר עם הפיגומים הסינפטית כגון PSD-95 ביסוד הפלסטיות הסינפטית; לכן, שיטות לקבוע את מצב הפלמיטלציה של חלבונים סינפטית מספק תובנה חשובה למנגנונים של פלסטיות סינפטית.

בעבר, זיהינו את משפחת SynDIG של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים טרנסקרום הקשר עם AMPARs5. ביטוי יתר או להפיל את SynDIG1 בתוך היפואת הנוירונים ההיפוקמא היפוקרטס מגדילה או פוחתת, בהתאמה, מזהה ה-, מספר ה-הסינפסה-R ו-x ב-~ 50% כפי שזוהה באמצעות האימונוציטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה5. אנו מנוצל החליפין acyl-biotin (אייב) מאפשר להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות juxta-transממברני (נמצא בכל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. השיטת אייב מסתמכת על חילופי ביוטין על cysteines מוגן על ידי שינוי וטיהור אהדה הבאים7. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית חדשנית, שינוי החליפין של ה-acyl-pegyl (אפגס), הקובע8,9,10,11,12, שאינו דורש טיהור אהדה ובמקום זאת מנצל שינויים בניידות ג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים עבור חלבון מעניין. הפרוטוקול מתואר לחקירה של חלבונים ממברנה אנדודוגני ממוח העכבר שעבורו נוגדנים מתאימים זמינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכים בעלי חיים בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס.

1. הכנת קרום מוח העכבר

  1. עכבר מערוף את ראשו באמצעות מכשיר הגיליוטינה ולנתח את המוח החוצה במהירות (ב< 1 דקות, אם אפשרי, כדי למזער שינויים בפלמיטלציה שעלולים להתרחש במהלך הליך הניתוח). המגון באופן מיידי ב 10 מ ל של מאגר הומומטר (שולחן 1) בתוך זכוכית הומוגניצר (~ 12 משיכות) על קרח.
  2. צנטריפוגה לעבור 15 דקות ב 1,400 x g ב 4 ° c. להעביר את הסופרנטאנט. לצינור חדש על הקרח השהה מחדש את הגלולה (~ 6 משיכות) בנפח שווה של מאגר החלשת ההגון וצנטריפוגה ב 710 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  3. לשלב את supernatants משלב 1.2 ו צנטריפוגה ב 40,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.
  4. למחוק את הסופרנטנט (שבר ציטוזה) ולהשעות מחדש את הקרום פלאד (P2) שבר במאגר המגון.
    הערה: דגימות יכול להיות פלאש קפוא ומאוחסן ב-80 ° c לשימוש מאוחר יותר.
  5. ביצוע חומצה בבינובית (BCA) שיטת בדיקת רמות החלבון בקוונטייט. עבור הצורך של ה-אפגס, התחל עם ~ 100-200 מ ג חלבון (מקסימום 250 mg) בנפח של 470 μL של מאגר A (טבלה 1) בשפופרת 1.5 mL. Sonicate וצנטריפוגה ב-> 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° צ' כדי להסיר חלבון לא מסיסים. העבר חלבון מסיסות לצינור חדש 1.5 mL.

2. שיטת ה-acyl-PEGyl החלפת ג'ל

  1. הפרעה באיגרות חוב דיסולניות וחסום את הקיסטרינס החופשיים.
    1. לשבש את איגרות החוב קשר דיסולפידי על ידי הארגדירוג ב -25 מילימטר טריס (2-carboxyethyl) פוספטין (tcep; 25 μl, התווסף מתוך פתרון מניות; שולחן 1) עבור 60 דקות ב-55 ° c.
    2. לחסום cysteines חינם עם 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12.5 μL, נוסף מתוך פתרון מניות; שולחן 1) בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות.
      הערה: ניתן להאריך את התגובה למשך הלילה.
  2. ביצוע כלורופורם מתנול (CM) משקעים.
    1. העבר את התמיסה חלבון מ 1.5 mL צינור פוליפרופילן או זכוכית צינור שיכול להיות centrifuged ברוטור דלי מנופף במהירות צנועה. שפופרת של 5 מ ל הינה אידיאלית. הוסף ארבעה אמצעי אחסון (2 מ ל) של מתנול (MeOH) ומערבולת בקצרה.
    2. הוסף שני כרכים (1 מ ל) של כלורופורם ומערבולת בקצרה.
    3. הוסף שלושה כרכים (1.5 mL) של dH2O ו וורטקס לזמן קצר.
    4. צנטריפוגה את דגימות ב 3,000 x g עבור 30 דקות ב 25 ° c ב רוטור דלי מנופף.
    5. הסר והתעלם בזהירות מהשלב העליון.
    6. להוסיף 3 אמצעי אחסון (1.5 mL) של MeOH ולערבב בעדינות אבל ביסודיות, להיות זהירים לא רסיס פנקייק חלבון אטום.
    7. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c ב רוטור דלי מנופף.
    8. באמצעות זכוכית הסרת המחמד, להסיר כמה השלב העליון ככל האפשר מבלי להפריע פנקייק חלבון.
    9. שטפו בזהירות את הגלולה עם 1 מ ל של MeOH.
    10. האוויר יבש את הגלולה. לפחות 10 דקות
      הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.
  3. לבצע מחשוף של הקשר הפלמיאוקסיל-thioester עם הידרוקסילמין (NH2הו, HAM).
    1. השהה מחדש את מזרז החלבונים ב-125 μL של מאגר A וsonicate בקצרה. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° צ' כדי להסיר חומר לא מסיסים. העבר חלבון מסיסות לצינור חדש 1.5 mL.
    2. הוסף 375 μL של מאגר H (HAM +; שולחן 1) או מאגר T (HAM-; שולחן 1) ודגימות הדגירה של 60 דקות ב -25 ° c.
  4. חזור על משקעים CM המתוארים בשלב 2.2.
    הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.
  5. הוסף mPEG לציסטרינס לא מוגנים.
    1. השהה את הגלולה מחדש ב-100 μL של מאגר A המכיל 10 מ"מ TCEP. . העבר לצינור 1.5-mL
      הערה: זה נורמלי לאובדן משמעותי של חלבונים שהתרחשו במהלך שלבי משקעים CM. כל השלבים הבאים יבוצעו בצינור 1.5 mL, מגביל את נפח החלבון עד למקסימום של ~ 120-130 μL. זה יפחית את אובדן החלבון בזמן המשקעים הסופיים.
    2. הוסף 20 מ"מ mPEG-5k (25 μL, נוסף מפתרון מניות; שולחן 1) לדגימת חלבונים ומערבבים באמצעות ליטוף. מודטה עבור 60 דקות ב-25 ° צ' עם סיבוב מהסוף לקצה.
    3. כדי להסיר mPEG-5k משולב, לבצע משקעים CM כמתואר בשלב 2.2 באמצעות אלה אמצעי אחסון מנוכי: 4 כרכים של MeOH (500 μL), 2 כרכים של כלורופורם (250 μL), ו 3 כרכים של dH2O (375 μl). צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c.
    4. הסר בזהירות את השלב העליון כמו לפני, הימנעות פנקייק עבה, לוקקולאנט. הוסף 1 מ ל של MeOH ולערבב בעדינות אבל ביסודיות. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c.
    5. הסירו בזהירות את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה עם 1 מ ל של MeOH. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c. . כבשי אוויר יבשה
      הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.
    6. השהה מחדש את הגלולה מיובשים ב 50 μL של מאגר A (ללא TCEP או כל סוכן הפחתת). שריין 5 μL עבור כימות חלבון BCA. לאחר כימות, להוסיף כמות מתאימה של מאגר לדוגמה 4x Laemmli ו, בהתאם חלבון הריבית, לחמם את הדגימה ל 70-100 ° צ' עבור 10 דקות.
      הערה: הרתיחה עלולה לגרום לצבירה של כמה חלבונים קרום.

3. ניתוח כתמי האבן המערבי של החלבונים הקשורים

  1. לטעון את המדגם על נתרן dodecyl סולפט פוליאקרילמיד ג'ל (SDS-עמוד) ג'ל13.
    הערה: בפרוטוקול זה שימש 10% פוליאקרילאמיד.
  2. השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים של הפרדה, העברה וזיהוי של14.
  3. השתמש בdensi,14 כדי לקבוע את הכמויות היחסיות של הפגינן לעומת החלבונים שאינם מפעילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המוח החיסוני עם נוגדנים נגד חלבון הריבית חושף את המדינה palmitoylated (לא, ביחידים, כפליים, וכו ') במוחו מוחית העכבר כפי שנקבע על ידי משמרת ניידות לעומת דגימות שבהן HAM לא נכלל. קודם לכן, הדגמנו שSynDIG1 הייתה בשני אתרים באמצעות שיטת אייב6; עם זאת, לא יכולנו לקבוע אם שני האתרים שונו ברקמת המוח. כאן אנו מראים כי SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, ו Prrt2 הם palmitoylated במוח העכבר וכי יש להם שני אתרים פוטנציאליים הפלמיטציה (איור 1). מעניין, לכל ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבודה הקודמת שלנו, אנו משתמשים באותו שיטת אייב כדי להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני משקעי juxta שימור ממברנה Cys (נמצא כל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. מגבלה היא כי שיטת אייב דורש טיהור אהדה עם שרפים agarose מצומת אבידין moieties כשלב הסופי בהליך, וכתוצאה מכך אובדן משמעותי של האות המדסבך את האנליזה הכמותית. יתרה מזאת, שיטת ה-ABE אינה יכולה להבחין אם החלבון הוא מפלאויום או באתרים מרובים.

כאן אנו משתמשים בשיט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים לג וולפריי לקבלת ייעוץ וכניסה בנוגע לשיטת ה-אפגס. מחקרים אלה היו ממומנים על ידי מענקי מחקר כדי E.D. מן הקרן וייטהול ו NIH-NIMH (1R01MH119347).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הידרוקסילאמין (HAM)ThermoFisher26103
מתוקסי-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)NOFME-050MAMW ~ 5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Rאו ציוד שווה ערך
N-ethylmalemide (NEM)Calbiochem34115רעיל מאוד.
הדמיה אופטית לצפיפותAzureBiosystems Sapphire Biomolecular Imagerאו ציוד שווה ערך
צינורות פוליפרופילן עם מכסהFisher Scientific14-956-1D
צנרת סרולוגית (זכוכית)Fisher Scientific13-678-27D
צנטריפוגה שולחניתBeckmanAllegra X-15Rאו ציוד
שווה ערךטריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין-הידרוכלוריד (TCEP)EMD Millipore580560

מקורות

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  14. Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SynDIGWestern BlotTCEPNEM
Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.