באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

Wenhua Li; Mingrui Yuan; Yaqin Wu

doi:10.3791/61022

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

5.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61022

⸱

1 במאי 2020

Wenhua Li¹ , Mingrui Yuan¹ , Yaqin Wu¹

¹Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

תקציר

באתרו היברידיזציה (ISH) היא טכניקה מאוד אינפורמטיבי להציג דפוסי הפצה תאית של גנים ספציפיים (g., mRNA ו ncRNA) ברקמות. התולעת הסיפנעית מהווה משאב-דיג מכריע, שכן הוא בעל ערכי תזונה ומרפא גבוהים. כיום, המחקר על הביולוגיה המולקולרית של סיפונקולוס נודוס עדיין בחיתוליו. מטרת מאמר זה היא לפתח שיטה רגישה לאיתור mRNA מסוים בנוזל הסיפונקולוס nudus . הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים של ISH, כולל digoxigenin-התווית אנטי הגיוני הכנה החלקה, לאסוף נוזלים קולוממית והכנה מקטע, הכלאה החוצה באופן ספציפי, הדגירה הנוגדן, צבע ושלאחר צבע טיפולים. תוצאות הנציג שהתקבלו מניסוי מוצלח באמצעות שיטה זו מומחש. הפרוטוקול צריך להיות רלוונטי גם. למינים אחרים של האחרים

מבוא

ISH, באמצעות בדיקה חומצה גרעין בתווית כדי לזהות את ה-DNA הספציפי או רצף RNA של עניין, היא שיטה שימושית כדי לתאר את תבנית הביטוי המרחבי של גנים היעד ברקמות שנשמרו מורפולוגית¹^,²^,³. בדרך כלל, רצף היעד מופק על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולאחר מכן משמש כתבנית כדי לסנתז את antisense/תחושה RNA בדיקה מתויג עם digoxigenin uridine-5'-triphosphate. הדגימות קבועות ומופרחות לפני הדגירה. לאחר שטיפת המקדח עודף, היברידיזציה היא דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי digoxygenin, שהוא בסיסי פוספטאז-מצומת³^,⁴^,⁵^,⁶.

סיפונקולוס נודוס (מאכל שמנת; הזמנת סיקולידה: סיפונקולרוב) היא תולעת מחולקת, קומטואט ובקיעים ימית של התולעים⁷^,⁸. סיפונקולוס נודוס הוא זן קוסמופוליטי המופץ באופן נרחב במימי חוף טרופיים וממוזגים. זהו גם משאב הדיג הימי החשוב בדרום סין בשל ערכי התזונה והמרפא הגבוהים שלה⁹^,¹⁰. עם זאת, הסיפונקולוס נודוס בביולוגיה מולקולרית עדיין בחיתוליו. כדי להבין באופן מלא את התפקיד הביולוגי של הגנים, החקירה של ביטויים גנים דפוסי ברזולוציה תאית הוא מעניין מאוד. באורגניזם הלא מודל Sipunculus nudus, השיטה ISH, שהיא שיטה אידיאלית כדי לזהות את דפוסי הביטוי גנים, עדיין לא הוקם. נוזל קולאומית שלו מכיל מספר סוגי תאים, כולל גרנולוציטים, בתאי urn, תאים vesicular תאי הנבט, אריתרופוציטים, וכו '¹¹. מין כפול/mab-3 מקדם התעתיק הקשור-1 (dmrt1), משמש כג מייצג בשיטה זו, הוא מווסת הטרנססקריפט שימור מאוד של קביעת מין ובידול ברוב המינים החל מיצורים חסרי חוליות ליונקים¹²^,¹³. במגוון מינים (כלומר, פורגיה שחורה וכו ') ¹⁴, dmrt1 ביטא בתאי sertoli, סביב התאים נבטי, שתפקידם דומה לתאי הפיצוץ של סיפונקולוס nudus. לכן, אנו שיערו שdmrt1 של הסידקולוס נודוס באה לידי ביטוי בתאי הפיצוץ של spermatozeugmata, והתוצאה של שיטת ISH אישרה בבירור את ההשערה.

פרוטוקול זה בפעם הראשונה מתאר ISH, עם digoxigenin-התווית אנטי sense/תחושה mRNA, כדי לקבוע דפוסי ביטוי mRNA במכתם נוזל קולאומית שלה. תנאי התגובה האופטימליים מסופקים, המאפשרים הדמיה מאוד רגישה של ביטוי mRNA ברזולוציה גבוהה. שיטת ה-ISH המפותחת יכולה להיות מיושמת בעוד מינים של סיפונקולידה מלבד סיפנקולוס נודוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נוהל בעלי החיים אושר על ידי ועדת הבריאות והרווחה של אוניברסיטת Huaqao.

1. הכנה לריבוחלוק

פריימר עיצוב
1. פתח את התוכנית פריימר 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). העתק את רצף dmrt1 (genbank: MK182259) לתוך חלון הרצף.
2. הגדר אורך פריימר (23-25 bp), טמפרטורת ההיתוך (55-60 ° c), ו-G/C תוכן (40-60%). לחץ על בחר התחל.
  הערה: הגודל המינימלי הנדרש עבור בדיקה RNA הוא כ 500 bp. הבדיקות הארוכות בדרך כלל כוללים ספציפיות יותר.
3. הוסיפו את רצף המקדם של T7 RNA פולימראז (5^,-taאטקg, טטקקאכא2-3^,) לאחד מצבעי היסוד שנבחרו. רצפי dmrt1 פריימר עבור ISH מוצגים בטבלה 1.
  הערה: לבדיקות הגיוניות, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם בקצה של 5 התחל הקדמי. עבור בדיקה נגד היגיון, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם ב 5 '-סוף של התחל לאחור.
הגברה הPCR
1. מניחים את הצינורות microfuge על הקרח, ולהכין את תערובת התגובה הבאה (עבור התגובה μL 50): 1x Taq DNA פולימראז לערבב, 1 μg של cDNA (אשר מוכן 100 μL של נוזל קולוממית), 1 μM קדימה פריימר, 1 μM הפוכה פריימר ו nuclease מים ללא.
2. מערבבים את תגובת ה-PCR באמצעות ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
3. מניחים את צינור התגובה ב ציקלייר תרמית, ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התנאים הבאים: דנטורציה הראשונית ב 95 ° c עבור 2 דקות ואחריו 36 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° צ' עבור 30 s, ריפוי ב 55-60 ° c עבור 30, הארכה בשעה 72 ° צלזיוס עבור 30 ו הארכה הסופית בשעה 72 °
  הערה: טמפרטורת הריפוי צריכה להיות ממוטבת לפי התחל.
מוצר הטיהור והאימות של מוצרי PCR
1. לטעון את 50 μL של התערובת PCR ישירות על 1% agarose ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 150-180 V עבור 10 דקות ב 0.5 x TBE. בודד את קטעי ה-DNA הספציפיים מ 1% הצמח ג'ל.
  הערה: הדנ א אמור להופיע כלהקה אחת ולא ככתם.
2. לטהר את קטעי ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ ג'ל על פי פרוטוקול של היצרן. לכמת את המוצרים מטוהרים ידי ספקטרופוטומטר באורך גל של 260 ננומטר.
3. בדוק את אמיתות מוצרי ה-PCR לפי רצף.
  הערה: (נקודת השהיה) ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR המטוהרים ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
סינתזה של ריבוגלימה
1. מניחים את RNase-microfuge לשחרר את הצינורות על קרח, ולהוסיף את הבאות לצינור microfuge (עבור התגובה 10 μL): 1x Digoxygenin-RNA תיוג שילוב, 1x שעתוק מאגר, 0.5 μL של מעכבי RNase, 1 μL של T7 RNA פולימס, 1 μg של המוצר PCR ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
2. הוסף 2 μL של RNase-חינם DNase לערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה של 15 דקות ב 37 ° c.
3. הוסף 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0). ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
4. הוסף 2.5 μL של 4 M LiCl ו 75 μL של אתנול מקורר לתגובה לעיל. . תערבב היטב השאירו 30 דקות ב-70 ° c.
5. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מדקלת את האתנול הוסף 1 מ ל של מקורר 70% אתנול (v/v) ולשטוף את המשקעים על ידי ערבוב בעדינות.
6. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. Decant 70% אתנול ויבש את המשקעים בקצרה ליד מנורת אלכוהול. מתמוסס את המשקעים על ידי הוספת 30 μL של מים ללא RNase-חינם ולערבב בעדינות.
7. טען 2 μL של רנ א מסונתז על 1% צמח ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 180 V עבור 5-10 דקות ב 0.5 x TBE. למדוד את הריכוז של ה-RNA שכותרתו באמצעות ספקטרוסקופיה באורך גל של 260 ננומטר.
  1. השימוש RNase-microfuge בחינם צינורות וטיפים מסנן כדי למנוע זיהום RNase.
    הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את הבדיקות המסומנות ב-digoxygenin-70 ° c במשך מספר חודשים.

2. אוסף נוזלים קולאומית

. תקן את ס. נודוס על שולחן הניתוח עם סיכות פתח את גופתו של ה . nudus עם מספריים אוטוקליים קטנים. בודד את נוזל קולוממית עם פיפטה.
לאסוף ולהעביר 1 mL הנוזל קולוממית עם פיפטה כדי פולי-D-ליזין מיקרוסקופ שקופיות. החל את הנוזל הקולאומית באופן שווה עם טיפ פיפטה. מייבשים את השקופיות ב-37 ° c.

3. באתרו היברידיזציה

היום הראשון
1. מימה מחדש את השקופיות בצנצנת מכתים שקופית המכילה 100 mL של מלוחים באגירה מפוספז של 1x דיאתיל פירוקרבונט (depc-PBS). מייבשים 3 פעמים עם 1 x DEPC-PBS, 5 דקות לכל כביסה עם עצבנות עדינה.
2. החדירות הכתם של נוזל קולוממית על ידי עיכול עם 10 μg/mL פרוטטינואז K בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. מארג השקופיות ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עבור 20 דקות כדי לעצור את העיכול. שטוף את השקופיות ב-1x-PBS עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות 3 פעמים.
3. הוסף 50 μL של תערובת היברידיזציה (HM) המכילה את הגלימה של התחושה/החושים על השקופיות והוסף תגית כיסוי.
4. הוסף מאגר תיבות רטובות לתוך התיבה הרטובה. שים את השקופיות לתוך הקופסה רטוב לאטום היטב עם סרט פרפין. Hybridize לילה (לפחות 16 h) ב 60 ° c.
היום השני
1. מחממים את מאגר הכביסה ב-65 ° c. הישאב את השקופית לצנצנת המכתים שקופיות המכילה את מאגר הכביסה והעמד אותו עד להצגת השקופיות באופן אוטומטי. . זה לוקח בערך 5 דקות
2. רוחצים 2 פעמים עם מאגר כביסה ב 65 ° c, 30 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. רוחצים 2 פעמים עם מלוחים של 0.2 x-נתרן ציטראט ב65 ° c, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה. שטוף 2 פעמים עם מאגר חומצה מלפימית המכילה את הטמפרטורה 20 (מאבטי) בטמפרטורת החדר, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
3. מודיית את השקופיות בטמפרטורת החדר עבור 3 – 4 h במאגר חסימת. מודלת את השקופיות ב-1 mL anti-digoxigenin-AP שברי הפתרון מדולל ב 1/5000 עם מאגר חסימת ב 4 ° c לילה.
היום השלישי
1. הסר את פתרון הנוגדן ושטוף את השקופיות לזמן קצר ב-מאבט. שטפו 4 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 25 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
2. מודאת השקופיות עם מאגר פוספספטאז אלקליין בטמפרטורת החדר 3 פעמים, 5 דקות לכביסה. להסיר את מאגר פוספספטאז בסיסי, ולהוסיף 1 מ ל 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl פוספט (BCIP)/ניטרו כחול הטטרזויום (NBT) כתמים הפתרון. . שמור את השקופיות בחושך
3. שימו לב לתגובת הצבע מידי פעם תחת מיקרוסקופ אופטי. כאשר הצבע מפותח במלואו (זמן התגובה בטווח של 1-4 h), שטוף את השקופיות 2 פעמים עם מייבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
4. שטוף 2 פעמים עם פתרון הפסקה בטמפרטורת החדר, 15 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. דגירה את השקופיות ב מתנול להסיר כתם עודף, בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. על פי צבע הרקע, שטיפת מתנול יכול להיעשות 2 או 3 פעמים את הזמן decolorization ניתן להאריך.
5. שטוף 2 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. העבר את השקופיות לנייר סינון טרי. הוסף 50 μL של גליצרול. הוסף את הכיסויים ובדוק את המיקרוסקוזה.
  הערה: הרכב הפתרון מופיע בטבלה 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סיכום השלבים המעורבים ב-ISH מומחש באיור 1. Antisense ואת התחושה המתאימה riboprobes עבור dmrt1 היו מסונתז מ-PCR מוצרים הוגדל מתוך cdomic נוזלים. האותנטיות של מוצרי ה-PCR אומתה באמצעות רצף ישיר. ריבוגלימות היו מסונתז באמצעות T7 RNA פולימות לפי פרוטוקולי היצרן ודוח קודם⁴ עם כמה שינויים משניים. האותות הנציגים של ISH מוצגים באיור 2. איש של סיפונקולוס nudus מנוזל קווממית עם הריבוכי מטרות dmrt1 מגלה מכתים סגול מרוכז בת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים קודמים הראו כי איש מתאים לזיהוי מרובים rnas מטרה¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטת ISH ברזולוציה גבוהה כדי לאתר את ה-mRNA בנוזל הקולאומית ולהדגיש את תנאי הכלאה הממוטבים בסיפונקולוס נודוס. האותות הברורים של dmrt1 הבחנו ביישום מוצלח של פרוטוקול זה בזיהוי של ביטוי גנים (איור 2).

במהלך הניסוי, צריך להעניק לסדרה של צעדים תשומת לב מיוחדת. ראשית, תחושה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי קרן המדענים הצעירים של הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (גרנט No. 31801034), הקרן המדע הטבעי של מחוז פוג'יין, סין (2016J01161), קרנות המחקר המדעי של אוניברסיטת Huaqiao (15BS306) ו פוסט בוגרי הקרן החדשנית מחקר מדעי של אוניברסיטת Huaqao

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP שברי Fab	Roche	11093274910
ערכת פיתוח צבע פוספטאז אלקליין BCIP/NBT	Beyotime	C3206
סרום בקר אלבומין	סיגמא	B2064
צנטריפוגה	Eppendorf	5415R
חומצת	לימוןסינופארם ריאגנט כימי ושות'	5949-29-1
חומצת לימון טריסודיום	סינופארם ריאגנט כימי ושות'	4/3/6132
תלושי כיסוי	Beyotime	FCGF60
פורממיד אמרסקו נטול יונים		12/7/1975
דיאתיל פירוקרבונט, DEPC	Sigma	D5758	חומר מזיק
Digoxigenin (DIG) תערובת תיוג RNA	Roche	11277073910
DNase I,	18047019
EDTA	Sigma	431788
הדמיית ג'ל אלקטרופורזה	Bio-Rad	Universal Hood III
אתנול	סינופארם ריאגנט כימי ושות'.	64-17-5
ערכות מיצוי ג'ל	אומגה	D2500
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל	בייג'ינג Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
גליצרול	סינופארם מגיב כימי ושות'.	56-81-5
גליצין	סיגמא	G5417
הפרין	סיגמא	8/1/9041
KCl	סינופארם ריאגנט כימי ושות'	7447-40-7
KH₂PO₄	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
חומצה מאלית	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
מתנול	סינופארם ריאגנט כימי ושות'	67-56-1	חומר רעיל
MgCl₂	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na₂HPO₄	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2
סרט פרפין	חברת Bemis, Inc.	PM-996
פרפורמלדהיד, PFA	סיגמא	158127	חומר מזיק
PCR מכשיר	חיים טכנולוגיית חיים	סיכות פרופלקס
	מעדנייה	16
פיפטה	אפנדורף	פלוס G
שקופיות מיקרוסקופ מטופלות פולי-D-ליזין	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma
מים ללא RNase	HyClone	SH30538. 02
מעכב RNase	Roche	3335399001
S. nudus
סרום כבשים	Beyotime	C0265
צנצנת צביעת שקופיות	Beyotime	FG010
קופסת אחסון שקופיות	Beyotime	FBX011
מספריים אוטוקלאב קטנים	Shuanglu	sku_8330
ספקטרופוטומטרים	תרמו פישר	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA פולימראזות	Roche	10881767001
Taq DNA פולימראז תערובת (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche
Tween-20	Sigma	P1379
אמבט מים	Zhengzhou Great Wall מדעי תעשייתי	HH-S2

Invitrogen ללא RNase מאכל SRE000510109517001

מקורות

Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884(2009).
Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41(2012).
Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361(1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הכנת ריבופרוב אינקובציית נוגדנים פיתוח צבע חיתוך רקמות ניתוח ביטוי גנים סימון בדיגוקסיגנין צביעה בפוספטאזה השרית

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית