מאמר שיטה

הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק

DOI:

10.3791/61025

⸱

18 במאי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science, King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS), King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמנון וירוס מחלת האגם (TiLVD), מחלה נגיפית המתעוררים ב אמנון הנגרמת על ידי וירוס האגם אמנון (Tilvd), הוא אתגר מתמשך בתעשיית מידגה כי הביא את התחלואה ההמוני ואת התמותה של אמנון בחלקים רבים של העולם. יעילה, מהירה, ומדויקת אבחון מדויק עבור זיהום TiLV הוא אפוא הכרחי כדי לזהות את הזיהום הראשוני כדי למנוע את התפשטות המחלה בחקלאות מידגה. במחקר זה, לולאה הפוכה רגיש מאוד ומעשי לולאת איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטה מוצגת לזיהוי וירוס האגם אמנון ברקמת הדג. השוואה של rt-qpcr ו-rt-המנורה בחני של דגימות נגוע חשף תוצאות חיוביות ב 63 (100%) ו 51 (80.95%) דגימות, בהתאמה. יתר על כן, ניתוח של דגימות נגוע הראו כי כל 63 רקמות נגוע הניבו תוצאות שליליות הן RT-qPCR ו-RT-המנורה assays. החוצה הפעילות הצולבת עם חמישה פתוגנים ב אמנון הוערך באמצעות RT-מנורה, וכל הבדיקות הראו תוצאות שליליות. הן הכבד והן דגימות ריר שהתקבלו מדגים נגועים הראו תוצאות דומות באמצעות RT-המנורה שיטה, רומז כי ריר ניתן להשתמש RT-מנורה כמו שיטת לא קטלני כדי למנוע הריגת דגים. לסיכום, התוצאות הראו כי הציג RT-מנורה שיטת מספק שיטה יעילה לזיהוי TiLV ברקמת אמנון בתוך 1 h. לפיכך, השיטה מומלצת ככלי הקרנה בחוות לאבחון מהיר של TiLV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמנון וירוס מחלת האגם (tilvd) היא מחלה נגיפית ב אמנון (oreochromis spp.) כי הדיווחים גורם מקרי מוות אמנון באזורים רבים של העולם, כולל אסיה1,2, אפריקה, ואמריקה. המחלה הוכרה לראשונה בתקופת התמותה ההמונית של האמנון ב-2009 בישראל, כאשר מספר האמנון הפראי באגם כנרת צנח באופן דרמטי מ-257 ל -8 טון בשנה2. המחלה נגרמת על ידי וירוס באגם האמנון (TiLV), אשר הוקצה המשפחה האמריתיים כסוג חדש tilapinevirus ו אמנון מיני חדש tilapinevirus3. האפיון הגנטי של tilv הראה כי הווירוס הוא הרומן עטוף, שלילי-הגיון, יחיד תקוע וירוס RNA כי יש 10 מקטעים קידוד 10 חלבונים1,2,4. מינים שונים של אמנון בסוג סרטרדון, oreochromis, ו tilapine ודגי מים חמים אחרים (למשל, גורמי ענק (osphronemus גוראמי) הוכחו להיות רגישים כדי tilv2,5. כיום, וירוס זה ממשיך להתפשט ברחבי העולם, אולי דרך התנועה של הנגועים דגים חיים6,7, בעוד הסיכון של שידור נגיפי דרך אמנון קפוא או המוצר שלה הוא מוגבל8. תמותה ניכרת בשל זיהום TiLV יש את הפוטנציאל יש השפעה כלכלית מזיקה משמעותית על תעשיית האמנון. לדוגמה, ההשפעה הכלכלית של תסמונת תמותת הקיץ במצרים המשויכת לזיהום TiLV חושבה להיות $100 מיליון9. לכן, חשוב לפתח שיטת אבחון מהירה ונאותה כדי להקל על השליטה במחלה זו בחוות הדגים.

עד עכשיו, האבחנה של TiLVD התבססה על מולקולרית הספר, בידוד נגיפי, ו histopathology. פרוטוקולים מסוגים שונים של PCR והתחל פותחו עבור אבחון TiLV10,11. למשל, שיטת SYBR ירוק מבוססי הפוכה PCR כמותי (RT-qPCR) שיטה עם רגישות לזהות כמה כמו שני עותקים/μL של הווירוס פותחה ואומת עבור הזיהוי TiLV10. שיטות ה-PCR האחרות לזיהוי TiLV כוללות את ה-PCR הכמותי של TaqMan11, RT-pcr2, מקונן rt-pcr12, ומקונן למחצה, rt-pcr13. עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מעבדה מתוחכם ופרקי זמן מורחבים יחסית כדי להניב תוצאות בשל מורכבות התגובות, מה שהופך אותם לאינם מתאימים ליישום שדה.

האיזותרמי לולאה בתיווך הגברה (מנורה) הוא יישום מהיר, פשוט ופרקטי לשדה14,15. הטכניקה מעסיקה את העיקרון של תגובת העתקה סטרנד, בעוד תגובת הגברה פועלת בתנאים איזותרמי ללא מתוחכם ויקר הציקלאה תרמית14,15. כתוצאה מכך, מוצרים מנורה מוגברת או RT-מנורה מוצרים מנותח בלהקות כמו הסולם באמצעות אגקום ג ' ל ג'ל עם כתם פלורסנט עבור או הדמיה בטוחה של DNA או RNA14 או התבוננות עם עין בעירום לנוכחות של עכירות או לבנים מעלה16,17,18. מסיבות אלה, טכניקה זו שימש לזיהוי באתר של פתוגנים דגים שונים17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. מטרת מחקר זה היה להקים מהירה, רגיש, מדויק RT-מנורה שיטת זיהוי TiLV. The RT-מנורה מציעה הקרנה של TiLV בדגימות דגים בתוך 30 דקות. ניתן ליישם את הטכניקה לאבחון ומעקב של TiLVD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסוי זה, שהיה מעורב בשימוש ברקמת בעלי חיים, אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של אוניברסיטת Kasetsart, בנגקוק, תאילנד (פרוטוקול מספר ACKU61-VET-009).

1. אוסף רקמות

  1. המתת חסד דגים באמצעות מנת יתר של שמן הציפורן (כלומר, יותר מ 3 מ"ל/L). מתיונין טריקיין יכול לשמש כחלופה לשמן הציפורן.
  2. השתמש מספריים ומלקחיים סטרילי לחתוך לפתוח את הבטן של האמנון הנתיחה שלאחר המוות ואת הבלו כ 30-50 מ ג של רקמת הכבד, או באמצעות זכוכית לכסות מיקרוסקופ, לאסוף 100 μL של ריר על ידי גירוד שכבת העור דגים longitudinally (מאחורי לאחוריים) לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
  3. המשך לשלב החילוץ של ה-RNA מיד או שמור על המדגם שנאסף ב--80 ° c עד לניסוי. כמו רנ א שלם רגיש יותר מ-DNA, להשתמש RNase-חינם חומרים ריאגנטים במהלך חילוץ RNA.

2. הוצאת רנ א

  1. כדי לחלץ את ה-RNA מן רקמת הכבד, להוסיף 30-50 מ"ג של רקמת האמנון לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל 600 – 1000 μL של guanidinium-חומצה-להפקת פנול מגיב (שולחן החומרים), ו לרסק את המדגם עד הומוגנית באמצעות יד החזיק רקמות ההומובית. דגימות הרקמה דורשות בערך 10%. מהפקת חומצות החומצה-פנול עבור דגימות הריר, השתמש רק 300 μL של שאיבת החומצות-חומצה-פנול מגיב (3:1).
    התראה: בריאנידיניום-חומצה-פנול מגיב החילוץ רעיל; לכן, הטיפול חייב להתבצע בזהירות. ציוד מגן, כגון משקפי בטיחות, שמלת מעבדה וכפפות בטיחות, חייב להיות שחוק.
  2. צנטריפוגה את המדגם הומוגניים ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש סטרילי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
  3. הוסיפו נפח שווה של 95% אתנול לצינור וערבבו היטב.
  4. להעביר את הפתרון לתוך טור ספין (טבלה של חומרים) ממוקם בצינור אוסף וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השמט את הזרימה והעבר את עמודת הסחרור לצינור אוסף חדש.
  5. הוסף 400 μL של מגיב טרום השטיפה של RNA (טבלה של חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר לפני מחיקת הזרימה-through. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
    הערה: כדי להכין את ה-RNA Pre-לשטוף, להוסיף 10 מ ל של 95% אתנול ל 40 מ ל של RNA לשטוף מראש לרחוץ.
  6. הוסף 700 μL של מאגר שטיפת RNA (טבלת חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את העמודה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית 1.5 mL.
    הערה: כדי להכין מאגר לשטוף RNA, להוסיף 52 mL של 95% אתנול ל 12 מ ל של RNA מאגר לשטוף להתרכז.
  7. Elute לדוגמה RNA שנלכד במטריקס טור הספין עם 100 μL של nuclease-מים חינם וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
  8. למדוד את הריכוז של ה-RNA שחולצו באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume ולדלל את ה-RNA לריכוז הרצוי באמצעות מים בחינם nuclease.
    הערה: ערך הספיגה המוסמך של OD260/OD280 נע בין 1.6 ל-1.9, ומציין את טוהר ה-RNA המקובל לצורך שיטת ה-RT-מנורה.
  9. המשך לשלב הבא באופן מיידי, או השאר את המדגם בשעה 80 ° צ' עד השימוש.

3. פריימר עיצוב

  1. השתמש פריימר Explorer גירסה 4 כדי לעצב את צבעי היסוד הספציפיים עבור RT-מנורה. עבור אל אתר האינטרנט, הhttps://primerexplorer.jp/e/ולחץ על לחצן V4 של PrimerExplorer.
  2. בחר את הקובץ המכיל את רצפי קטע 3 של TiLV בפורמט FASTA ולאחר מכן לחץ על לחצן עיצוב פריימר .
    הערה: לאחזר את הרצפים בפורמט FASTA מKX631923 מספר ההצטרפות של GenBank, המייצג וירוס אמנון לייק TV1 קטע 31.
  3. כדי לעצב את התחל, הקלט את הפרמטרים הבסיסיים הבאים:
    -תוכן GC של 40% – 60%
    -אמפליקון של ≥ 280 זוגות בסיס (bp)
    -טמפרטורת ההיתוך דומה (Tm) בין התחל עם הבדל מרבי של 5 ° c
    הערה: אסור להתחל להשלים אחד את השני
    1. הימנע מאזורי רצף הנוטים להרכיב מבנים משניים.
    2. בחרו את האנליזה הדיפית עם מינימום של 3.5 לקבלת עיצוב אופטימלי לΔG הגדול ביותר, ובחרו את קצות התחל בעיצוב מיטבי של הΔG הקטנים.
  4. לחץ על לחצן צור .
    הערה: לאחר שהתוכנה מסתיימת בעיבוד נתוני הקלט, התוצאות התחל יוצגו (איור 1).

4. RT-שיטת מנורה

  1. להכין לערבב מנורות RT-מנורה המכיל 2.5 μL של 1 x SD II מאגר התגובה, 3 μL של 6 מ"מ MgSO4, 1.4 μl של 1.4 מ"מ מערכת dntp, 4 μl של 0.8 M בקובץ, 1.3 μl של 0.052 מילימטר calcein, 1 μl של 1.6 μm ליטר-F3, 1 μm, מתוך 1.6 Μv-B3 פריימר, 1 μl של 0.2 ΜM-bip-cp פריימר, 1 μl של 0.2 ΜV-FIP פריימר, 1 μl של 0.3 יו. אן. אנ. איי פולימראז, 1 μl של 0.1 U amv הפוכה הטרנססקריפט, ו 3.8 μl של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
    הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל לפחות 10% מנפח התגובה הכולל.
  2. לחלק 22 μL של שילוב מנורה מנורת RT-המנורה לצינור 1.5 מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
  3. הוסף 3 μL של ה-RNA שחולצו לצינור התגובה, ולערבב את המדגם על ידי vortexing. לשליטה השלילית, השתמשו במים מזוקקים במקום בחומרי RNA.
  4. דגירה התגובה ב 65 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 80 ° צ' עבור 10 דקות כדי לסיים את התגובה.
  5. לאחר הדגירה, להתבונן באופן חזותי שינויים הצביעה בעין בעירום. תוצאה חיובית תופיע כצבע ירוק פלורסנט.

5. אגבה ג'ל

  1. הכינו 1.5% w/v agarose ג'ל על ידי השעיית 0.6 g של אבקת agarose ב 40 mL של 1 x טה מאגר. ממיסים את התערובת על ידי חימום אותו במיקרוגל במשך 3 – 5 דקות עד שהאגקם מומס לחלוטין, ומערבולת לערבב.
  2. הניחו לאגקם להתקרר עד שטמפרטורת הטמפרטורה תגיע ל-65 ° c. יוצקים 40 mL של הפתרון agarose על מגש ג'ל ולהוסיף מסרק לתבנית ג'ל.
  3. אפשר לג ג'ל להגדיר בטמפרטורת החדר במשך 20 – 30 דקות עד שהוא מתחזק לחלוטין. ואז להסיר את המסרק ולמקם את ג'ל במיכל ג'ל.
  4. הוסף מאגר פועל כדי לכסות את המשטח של ג'ל במיכל הג.
  5. הוסף 10 μL של הדגם RT-מנורה ו 2 μL של שישה x ג'ל טעינת מאגר לכל טוב. הוסף 5 μL של סולם DNA של 1 kb לנתיב ההתייחסות.
  6. חבר את המכסה המצורף לקתודה והאנדה המחובר לספק כוח. הפעל את ספק הכוח, להגדיר אותו קבוע 100 V, ולרוץ עבור 40 דקות.
  7. לאחר שסיימו את ההפרדה ג'ל, הסירו את הג ממגש הג. ואז להכתים את ג'ל סחוט באמצעות אתידיום ברומיד (EtBr) בריכוז של 10 מ"ג/mL עבור 7 דקות ו restain אותו מים מזוקקים עבור 5 דקות.
    התראה: EtBr הוא רעיל ונחשב מסרטן; לכן, היזהר בעת השימוש סוכן זה.
  8. לחשוף את ג'ל לאור UV באמצעות מערכת התיעוד ג'ל שבו מופיעים להקות, ולצלם את הג.

6. סינתזה של דנ א (cDNA) משלימה

  1. להכין מיקס cDNA שילוב מאסטר המכיל 2 μL של 5x RT מאגר, 0.5 μL של פריימר לערבב, 0.5 μL של האנזים RT, ו 2 μL של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
    הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל 1 x את התגובה עקב אובדן פוטנציאלי במהלך הליטוף.
  2. מערבבים 5 μL של המיקס הראשי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי 1.5 mL.
  3. הוסף 100 ng של RNA המחולצים (שהושג משלב 2.8) לצינור התגובה, לערבב ספין למטה כדי להעביר את כל התערובת לתחתית הכלי.
  4. מודיית את התגובות ב 42 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 98 ° צ' עבור 5 דקות במכונת ה-PCR. יש לאחסן את cDNA ב-20 ° צ' עד השימוש.

7. RT-qPCR

  1. להכין שילוב מאסטר TiLV qPCR המכיל 0.3 μL של 10 μM הפוכה פריימר, 0.3 μL של 10 μM קדימה פריימר, 5 μL של 2x SYBR ירוק DNA פולימראז, ו 0.4 μL של nuclease-מים ללא תשלום לכל תגובה. השתמש בבקרי התחל ובפקדים הבאים:
    פריימר קדימה (TiLV-112F): 5 '-מסכת מעבר
    פריימר הפוכה (TiLV-112R): 5 '-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3 '
  2. לחלק 6 μL של מיקס מאסטר TiLV qPCR לתוך כל טוב של רצועת qPCR תואם את הציקלייה תרמית בזמן אמת בשימוש.
  3. הוסף 4 μL של תבנית cDNA, שליטה שלילית (nuclease-מים ללא תשלום), בקרה חיובית (10 pg/μL), ו pTiLV (פלבאמצע)10 או מדולל באופן סדרתי tilv פלמיד לבאר, ולערבב כל מדגם על ידי מצליף. . לנהל כל דוגמא בטרילקטה
  4. הציבו את התגובות qPCR לתוך הציקלור התרמי בזמן אמת מתוכנת. הגדר את התוכנית qPCR כדי לבצע את הדגירה ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s ו60 ° c עבור 30 לפני השלב עקומת ההיתוך שבו הטמפרטורה צריך לעלות מ-65 ° c כדי 95 ° c במרווחים של ° צלזיוס/5.
  5. נהל את ניתוח הנתונים על-ידי הערכת עקומות הגברה והתכה ולאחר מכן חשב את מספר עותקי TiLV באמצעות העקומה הסטנדרטית שמתקבלת מהנתונים באמצעות הפלמידים המדולל באופן סדרתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, שיטת RT-המנורה פותחה כדי לזהות זיהום TiLV ב אמנון. דגימות נבדק נאספו 14 חוות ממוקם בחלקים שונים של תאילנד בין 2015 ו 2016. הדגים נגוע ולא נגוע היו מקובצים בעיקר בהתבסס על אבחנות פיזיות הופעות של TiLVD סימפטומים. זיהום TiLV אושר לאחר מכן באמצעות RT-PCR לאחר תהליך האיסוף. האלקטרופורזה בג ג'ל ואיתור צבע ירוק זורח נבחרו כשיטות הערכה של הגברה המנורה (איור 2). הכבד והריר של הדג האמנון הנגוע והלא נגוע התאפיין במראה הקליני של תסמיני מחלת TiLV, כולל שחיקת העור, אדמומיות בעור, האקפתלמוס ונפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תעשיית מידגה מאוימת ברציפות על ידי זיהומים נגיפי הגורמים הפסדים כלכליים ניכרים9,23,28. למשל, tilv המתעוררים מהווה איום גדול למדינות מניבות אמנון בחלקים רבים של העולם1,6,9. עד עכשיו, לא היו therapeutics מסוימים זמינים כדי למנוע TiLVD. בעוד התפתחות של החיסון מתמשך, חיסון יעיל ידרוש זמן משמעותי לפני שהוא זמין למטרות מסחריות. בהינתן נסיבות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט ממומן כלכלית על ידי קרן תאילנד מחקר (trf) מענק מספר RDG6050078 והמרכז ללימודים מתקדמים לחקלאות ומזון, המכון ללימודים מתקדמים, אוניברסיטת kasetsart, בנגקוק, תאילנד תחת קידום מחקר ההשכלה הגבוהה ופרויקט המחקר הלאומי של תאילנד, משרד ועדת ההשכלה הגבוהה, משרד ה המחקר נתמך בחלקו על ידי מלגת הלימודים לתואר שני מבית הספר לתארים מוסמכים, אוניברסיטת קאסטסארט. המחברים רוצים להודות לד ר Kwanrawee Sirikanchana לגבי הנרטיב העלילתי של וידאו ופייוואווצ סיקרין לעריכת הווידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>אוסף רקמות:
שמן ציפורןBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521אפשרות חלופית למיצוי RNA של שמן ציפורן
:
מגיב מבוסס חומצה גואנידיניום-פנול (מגיב TRIzol)ThermoFisherScientific Corp.
מגיב מבוסס חומצה גואנידיניום-פנול (מגיב GENEzol)GeneaidGZR100
Direct-zol:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- מאגר
- מים ללא
- עמודותIIICG של Zymo-spin
- שפופרות
<חזק>RT-LAMP:
1x SD II מאגר תגובהBiotechrabbitBR1101301
מגנזיום גופרתי (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP סטBioline BIO-39053
בטאיןסיגמא-אולדריץ'B2629
תערובת סידןMerck1461-15-0
Bst DNA פולימראזBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
מים נטולי נוקלאזInvitrogen10320995
עלית חממת אמבטיה יבשה, יחידה אחתמדעראשיEL-01-220
<חזק>ג'ל אלקטרופורזה:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) מאגר
Tris-acetic-EDTA (TAE):
- חומצה אצטית (קרחון), EMSUREMerck Millipore1000632500
- דיסודיום אתילנדיאמין-טטראצטט דיהידראט (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd.GR107
צבע טעינת ג'ל DNA (6X)ThermoFisher Scientific Corp.סולם וסמני DNA R0611
Vivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (מערכת אלקטרופורזה אופקית)Bio-Rad1704487
PowerPac HC ספק כוחBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
מגש דגימת UVBio-Rad1708271
Nα מצלמת BINeogene Science
cDNA סינתזה:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA SynthesisKit Vivantis TechnologiescDSK01אפשרות חלופית לסינתזת cDNA
NanoDrop2000 (ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq אוניברסלי SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
מים ללא נוקלאז', מים סטרילייםMultiCell809-115-CL
8 צינורות PCR רצועות,TLS0851ביו-ראד
רצועות PCR שטוחות עם 8 כובעים, אופטיBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
<חזק>ציוד וחומרים כלליים:
מאיו מספריים
מלקחייםN/A
תעשיות
מיקרוצנטריפוגה LM-60LioFugeCM610
קורנינג LSE מיני מיקרוצנטריפוגהקורנינג6765
פיפטותRaininPipete-Lite XLS
QSP קצות פיפטה מסונניםאיכות פלסטיק מדעיTF סדרת
קורנינג איזוטיפ טיפים מסונניםסדרת MerckCLS
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל נטולי נוקלאז, NESTWuxi NEST ביוטכנולוגיה615601
15596026ערכת RNA של שטיפת RNA DNase/RNase איסוף סיגמא-אולדריץ' SRE0062 - Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG לבן N/A Vortex Genie 2 (מערבל מערבולת) מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431(2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83(2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342(2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים