מאמר שיטה

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

DOI:

10.3791/61039

⸱

17 באפריל 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rotaviruses הם אוכלוסייה גדולה ומתפתחת של וירוסים כפולה ומקוטע של RNA הגורמות לדלקת במעיים חמורה בצעירים של מינים רבים ומארחים העופות, כולל בני אדם. עם הופעתו האחרונה של רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות, זה הפך להיות אפשרי להשתמש מוטגנזה מכוונת כדי לחקור ביולוגיה רוטוירוס, לשנות ולמטב את הקיימים חיסונים רוטוירוס, ולפתח רוטוירוס רב היעד וקטורים החיסון. בדו ח זה, אנו מתארים מערכת גנטית הפוכה פשוטה המאפשרת התאוששות יעילה ואמינה של רקומביננטי rotaviruses. המערכת מבוססת על שיתוף הפעולה של T7 וקטורים המבטאת באורך מלא רוטוירוס (+) rnas ו-cmv קידוד וקטור האנזים הסגירה לתוך התאים bhk מכונן לייצר T7 RNA פולימראז (bhk-T7). רקומביננטי rotaviruses הם מוגברת על ידי זריעת יתר של תאים BHK-T7 מזוהמים עם תאים MA104, תא כליות קוף קו כי הוא מאוד מתירני עבור צמיחת וירוסים. בדו ח זה, אנו מתארים גם גישה ליצירת רקומביננטי rotaviruses המבטאים חלבון נפרד העיתונאי פלורסנט באמצעות המבוא של האלמנט להפסיק להפעיל מחדש באמצעות translational לקטע הגנום 7 (NSP3). גישה זו נמנעת ממחיקה או שינוי של כל מסגרות קריאה ויראלי פתוח, ובכך לאפשר ייצור של רקומביננטי rotaviruses השומרים חלבונים נגיפי פונקציונלי באופן מלא תוך הבעת ביטוי חלבון פלורסנט.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rotaviruses הם הגורמים העיקריים של דלקת במעיים חמורה אצל תינוקות וילדים צעירים, כמו גם צעירים של יונקים רבים אחרים העופות1. כחברים של המשפחה Reo, וירוסים יש מקוטע כפולה תקוע-RNA (dsRNA) הגנום. מגזרי הגנום כלולים בתוך וויאון לא עטוף שנוצר משלוש שכבות קונצנטריות של חלבון2. מבוסס על רצף וניתוח פילוגנטי של מקטעי הגנום, תשעה מינים של רוטוירוס (A-D, F-J) הוגדרו3. אלה זנים הכוללת מינים רוטוירוס הם אחראים לרוב המכריע של המחלה האנושית4. המבוא של חיסונים רוטוירוס לתוך תוכניות החיסון לילדות החל בעשור האחרון הוא בקורלציה עם הנחות משמעותיות בתמותה רוטוירוס ותחלואה. בעיקר, מספר מקרי המוות של הילדות rotavirus הקשורים ירדו מ כ 528,000 ב 2000 ל 128,500 ב 20164,5. חיסונים rotavirus מנוסחים זני לחיות החליש של הווירוס, עם 2 כדי 3 מינונים מנוהל לילדים על ידי גיל 6 חודשים. המספר הגדול של זנים רוטוירוס ירוס מגוונת גנטית במחזור בני אדם ומינים אחרים היונקים, בשילוב עם יכולתם להתפתח במהירות באמצעות מוטאוסיס והקצאה מראש, עלול להוביל לשינויים אנטיגניים בסוגים של רוטוירוס להדביק ילדים6,7,8. שינויים כאלה עלולים לערער את היעילות של חיסונים קיימים, המחייבים החלפת או שינוי שלהם.

התפתחות של מערכות גנטיקה הפוכה במלואו בסיס המאפשר מניפולציה של כל 11 מקטעי הגנום רוטוירוס הושגה רק לאחרונה9. עם הזמינות של מערכות אלה, זה הפך להיות אפשרי לפענח פרטים מולקולריים של שכפול רוטוירוס ו פתוגנזה, כדי לפתח שיפור תפוקה גבוהה שיטות ההקרנה עבור תרכובות אנטי-רוטוירוס, וכיצד ליצור מחלקות חדשות פוטנציאלי יותר יעיל של חיסונים רוטוירוס. במהלך שכפול רוטוירוס, הכתיר ויראלי (+) rnas לא רק מדריך סינתזה של חלבונים ויראלי, אלא גם לשמש כתבניות לסינתזה של צאצאי הגנום dsrna מגזרים10,11. כל רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות שתוארו עד תאריך להסתמך על הT7 של שעתוק וקטורים לתוך שורות התא של היונקים כמקור cdna-נגזר (+) rnas בשימוש בשחזור רקומביננטי וירוסים9,12,13. בתוך וקטורים שעתוק, cDNAs באורך מלא ממוקמים בין היזם T7 במעלה למטה הפטיטיס דלתא וירוס (HDV) ריבוזים כגון זה ויראלי (+) RNAs מסונתז על ידי T7 RNA פולימראז המכילים אותנטי 5 ' ו 3 '-termini (איור 1A). במערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון, וירוסים רקומביננטי נעשו על ידי התינוק מצפה בתאי כליה אוגר ביטוי T7 RNA פולימראז (bhk-T7) עם 11 T7 (pT7) תמלול וקטורים, כל מכוון סינתזה של ייחודי (+) RNA של מאמץ SA11 וירוס קופיים, ושלושה cmv יזם-כונן ביטוי פלמידים, קידוד אחד החלבון reovirus p10FAST היתוך ושני חלבוניות קידוד של vaccinia וירוס D1R-D12L הסגירה אנזים מורכב9. וירוסים רקומביננטי SA11 שנוצרו בתאי bhk-T7 מזוהמים היו מוגבר על ידי זריעה יתר עם MA104 תאים, קו תא מתירני עבור צמיחה רוטוירוס. גירסה ששונתה של מערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון תוארה שכבר לא משתמשת ב-פלמידים תומכים12. במקום, המערכת ששונתה מייצרת בהצלחה רקומביננטי rotaviruses פשוט על ידי transfecting T7 תאים ב-hk עם 11 SA11 שעתוק וקטורים, עם האזהרה כי וקטורים עבור המפעל ויראלי (viroפלסטיות) אבני בניין (חלבונים לא מבניים NSP2 ו NSP5) מתווספים ברמות 3 מתקפל גבוה יותר מאשר וקטורים אחרים14,15. גרסאות ששונו של מערכת הגנטיקה הפוכה פותחו גם כי תמיכה ההתאוששות של קו האדם ו אודליה וזנים של רוטוירוס16,17. הגנום רוטוירוס היא קלה להפליא מניפולציה על ידי הפוך גנטיקה, עם רקומביננטי וירוסים שנוצרו עד היום עם מוטציות הציג לתוך VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, ו NSP522,23. בין הווירוסים השימושיים ביותר שנוצר עד כה הם אלה שעברו הנדסה לבטא חלבונים כתב פלורסנט (FPs)9,12,21,24,25.

בפרסום זה, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת הגנטיקה הפוכה שאנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לייצר רקומביננטי זנים של SA11 rotavirus. התכונה המפתח של הפרוטוקול שלנו היא שיתוף של התאים BHK-T7 עם 11 pT7 וקטורים (שונה לכלול רמות 3x של pT7/NSP2SA11 ו pT7/NSP5SA11 וקטורים) ו-CMV ביטוי קידוד וקטור החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים21 (איור 2). בידינו, נוכחות של NP868R באמצע מוביל את הייצור של מגדל גבוה יותר של וירוסים רקומביננטי על ידי מנוכר bhk-T7 תאים. בפרסום זה, אנו מספקים גם פרוטוקול עבור שינוי pT7/NSP3SA11 הפלמיד כגון הרקומביננטי וירוסים ניתן ליצור כי לבטא לא רק את המוצר 7 מוצר חלבון NSP3 אלא גם FP נפרד. זה מושגת על ידי מחדש הנדסה NSP3 פתוח מסגרת הקריאה (orf) ב pT7/NSP3SA11 פלמיד להכיל במורד הזרם 2a לעצור הפעלה מחדש האלמנט ואחריו FP (איור 1b)24,26. באמצעות גישה זו, יצרנו רקומביננטי rotaviruses ביטוי FPs שונים: unag (ירוק), mkate (רחוק-אדום), mkate (אדום), tagbfp (כחול), CFP (ציאן), ו-yfp (צהוב)24,27,28. אלה וירוסים FP ביטוי זה נעשים מבלי למחוק את NSP3 ORF, ובכך וירוסים מניבים כי צפויים לקודד השלמה מלאה של התפקוד חלבונים נגיפי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה ותחזוקת תרבות תאים

  1. להשיג כליות אוגר התינוק בתאי ביטוי מבחינה T7 RNA פולימראז (BHK-T7) ו אפריקה ירוק כליות הקוף MA104 תאים.
    הערה: BHK-T7 (או בסר-T7) תאים אינם זמינים מסחרית, אבל הם קו התא המשותף של מעבדות באמצעות גנטיקה הפוכה ללמוד ביולוגיה של וירוס RNA. קו BHK-T7 בשימוש בפרוטוקול זה הושג ד ר. אורסולה בוכהולץ (המכון הלאומי לבריאות, בת, MD, ארה ב), מפתח משותף של קו התאים BHK המקורי המבטא T7 RNA פולימראז29. תאים MA104 זמינים מאוסף האירופאי של תרביות תאים מאומתים (ECACC) ומאוסף התרבות האמריקנית (ATCC).
  2. הכינו את מדיית התרבות הבאה בסביבה סטרילית, עדיף ארון בטיחות ביולוגי מסוג Class II. מאחסנים מדיה בחשכה ב-4 ° צ' וחמים עד 37 ° c מייד לפני השימוש.
    הערה: מקורות של רכיבי מדיה ניתנים ברשימת חומרים.
    1. כדי להכין בינונית DMEM לאה, לשלב 500 mL של מדיום חיוני מינימלי של הנשר של Dulbecco (הגברת) המכיל 4.5 g/L גלוקוז ו 1% גלוטמין עם 5 מ ל של 100x עט.
    2. כדי להכין את dmem דיום להשלים השלם, לשלב 500 mL של המדיום DMEM לא שלם עם 25 מ ל של סרום העוברי העובר (FBS).
    3. כדי להכין בינונית GMEM לאה, לשלב 500 mL של מדיום חיוני מינימלי של גלאזגו, 5 מ ל גלוטמין 100x, 50 מ ל של טריז-פוספט ציר (TPB), 5 מ ל של 100x חומצות אמינו לא הכרחית (NEAA), ו 5 מ ל של 100x עט.
    4. כדי להכין את GMEM דיום להשלים, לשלב 500 mL של המדיום השלם gmem דיה עם 25 מ ל של FBS חום מופעל.
    5. כדי להכין GMEM + G להשלים בינונית, להוסיף 10 מ ל של 50 mg/mL ג ' ל/מ"ל (G418) כדי 500 mL של המדיום השלם GMEM זיכרון.
    6. כדי להכין את המדיום הבלתי מושלם, לשלב 500 mL של הנשר שונה של יוליק, 5 מ ל גלוטמין 100x, 50 mL של TPB, 5 מ ל של 100x NEAA, ו 5 מ"ל של 100 x עט-דלקת.
  3. תרבות MA104 תאים ב T75 או T175 צלוחיות המכילות 12 או 25 מ ל של מדיום השלם Dמאמ, בהתאמה. כדי מעבר MA104 תאים שהגיעו 100% השטף, לשטוף את התא מונאולייר 2x עם מלוחים פוספט באגירה (PBS), הנתק עם טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) פתרון, ולהשעות מחדש ב-5 (T75 תרמוס) או 10 מ ל (T175 בקבוקון) של בינוני לא שלם של DMEM דיה.
    1. מקום 0.5-1.0 mL של תאים מושעה מחדש מבחנות טריים ולהביא את הנפח הסופי המתאים על ידי הוספת DMEM דיום השלם. בקבוקי מקום ב 37 ° c, 5% חממה2 .
  4. הפצת BHK-T7 תאים ב T75 מבחנות, לסירוגין בין השימוש של GMEM ו GMEM גברת + G בינונית להשלים עם כל סיבוב של מעבר. כדי תת-תרבות BHK-T7 תאים שהגיעו 100% השטף, לשטוף את התאים מונאולייר 2x עם PBS, לנתק עם הפתרון טריפסין-EDTA, ולהשעות מחדש 5 מ ל של בינוני.
    1. לאחר הצבת 15 מ ל של פנינה או GMEM דיום + G להשלים בינונית T75 בקבוקון טרי, להוסיף ארבע טיפות של BHK-T7 תאים השעיית מחדש. מניחים בקבוקון 37 ° c, 5% חממה2 .

2. הכנה פלסמיד

  1. השג את הפלמידים הבאים המבטאים את רוטוירוס SA11 (+) rnas מ-addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/, NSP3SA11/,/pT7,/NSP4SA11. השג את הפלסמיד המבטא את האנזים הסגירה ASFV (pCMV/NP868R) מהמחברים21.
    הערה: הpT7/NSP3SA11 פלמידים שעברו הנדסה כדי לבטא FP באמצעות הפעילות של אלמנט של 2a (pT7/NSP3-2a-3xfl-FP) ניתן גם לקבל מן המחברים24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP מבטאים את הFPs הבאים זמינים: UnaG (ירוק), mKate (רחוק-אדום), Mkate (אדום), TagBFP (כחול), CFP (ציאן), ו-YFP (צהוב)24.
  2. הפוך את הפלמידים לתוך Eהמוסמכת. coli DH5α והפיצו חיידקים ללוחות מרק לוריא אגר המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה. לגדל תרבויות חיידקי לאסוף ממושבות בודדות ולהכין כמויות קטנות יותר של פלפרמיד (20 μg) באמצעות ערכת טיהור מיני הכנה לטווח (טבלת חומרים), על פי הוראות היצרן. הכינו כמויות גדולות יותר של פלסטלינה מתרבויות חיידקית באמצעות ערכות טיהור midi ומקסי (טבלת חומרים).
    הערה: פלמידים המתאימים לשימוש במערכת הגנטיקה הפוכה הוכנו גם עם ערכות טיהור אחרות. אין צורך להכין פלמידים באמצעות ערכות שתוכננו במיוחד כדי ליצור חומרים אנטוקסין-חינם.
  3. כוונן ריכוזים של פלמידים מטוהרים ל 1 מ"ג/mL ב nuclease-חינם ביולוגיה מולקולרית מים כיתה. בדוק את טוהר הפלמיד על ידי אישור יחס הספיגה 260/280 של ~ 1.8 באמצעות ספקטרוסקופיה. כמו כן, להשתמש באלקטרופורזה על 0.8% agarose עלה ג'ל כדי לוודא כי הפלמיונים הם בעיקר מתפתל על ידי.
  4. Aliquot מטוהרים הפלמידים לתוך 0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה סטרילי צינורות, כל אחד המכיל 10 μL. Store פלמידים ב-80 ° c.

3. דור של וירוס רקומביננטי

הערה: מחקר רוטוירוס אדם ובעלי חיים, כולל הדור והאפיון של זנים רקומביננטי רוטוירוס, חייב להיות מטופל תחת רמת biosafety טיחות 2 (bsl-2) התנאים ידרוש אישור מראש על ידי ועדת biosafety טיחות מוסדית (IBC). התנאים המתאימים BSL-2 המעבדה מתוארים בביובטיחות במעבדות מיקרוביולוגית וביורפואית (bmbl) המיוצר על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעה (CDC)30.

  1. יום 1: זריעת תאים BHK-T7 לצלחות 12-טוב
    1. לשטוף מונאולייר טרי שוטפת של BHK-T7 תאים הכלולים T75 בקבוקון 2x עם PBS. השבש את התא מונאולייר עם פתרון טריפסין-EDTA והשהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של מדיום שלם של GMEM דיה.
    2. השתמש במונה תאים אוטומטיים ובפתרון טרינטן-כחול כדי לקבוע את הריכוז של תאים קיימא BHK-T7 במדיום. תאים הזרע לתוך 12-היטב לוחיות התרבות התא, עם כל הכיל 2 x 105 תאים בנפח כולל של 1 מ ל של gmem (G418-free) מדיום להשלים. דגירה ב 37 ° c, 5% חממה2 . התאים אמורים להגיע ל-80-90 אחוז שליטה ביום 2.
  2. יום 2: העברה של תאים BHK-T7 עם תערובות פלמיד
    1. כדי להכין את תערובת, הפלסאמצע לשלב את הפרטים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL באמצעות מניות פלביניים מותאם ל 1 מ"ג/mL: 0.8 μL כל אחד SA11 pT7 פלמידים VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 ו NSP4, 2.4 μL כל אחד SA11 pT7 ב וNSP2, ו0.8 μL של pCMV/NSP5. בעדינות לערבב פלמידים על ידי הקשה על הצינור ולאסוף את התוכן על ידי דופק צנטריפוגה. כדי להכין וירוסים רקומביננטי ביטוי FPs, להחליף pT7/NSP3SA11 עם pT7 המתאים/NSP3-2A-3xFL-FP בינוני.
      הערה: תערובות פלביניים יש לאחסן על הקרח עד שימוש. צינור נפרד צריך להיות מוכן לכל העברה.
    2. כדי להכין את הסרום הפלסטי בינוני/מופחת התרכובת הכימית: הוסף 110 μL של טרום התחממות (37 ° c) סרום מופחת (טבלת חומרים) על כל תערובת פלסטלינה לערבב על ידי בעדינות ליטוף למעלה ולמטה. לאחר מכן, להוסיף 32 μL של מגיב העברה (טבלת חומרים) על כל הפלסטיק הפחתת בינוני/סרום מופחת; זה התשואות ריכוז של 2.5 μL של החצייה מגיב לכל μg של פלפמיד בתערובות. תערובות מערבולת בעדינות ומודרות בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
    3. במהלך 20 דקות דגירה התקופה, לשטוף BHK-T7 תאים ב 12-היטב צלחות (מוכן ביום 1) פעם עם 2 מ ל של מדיה לא מלאה של GMEM. לאחר מכן, יש להוסיף 1 מ ל של סמימ בינונית לא מלאה לכל הבאר ולהחזיר את הצלחות לחממה.
    4. אחרי 20 דקות דגירה הזמן, להוסיף את הסרום בינוני/מופחת התערובת בינונית/העברה ירידה על ידי ירידה לכל הבאר של 12-לוחות היטב באמצעות הצינורות 200 μL. בעדינות צלחות סלע ולחזור 37 ° c, 5% החממה2 .
  3. יום 4: הT7 בתאי הMA104
    1. לשטוף מונאולייר טרי שוטפת של תאים MA104 הכלולים T75 בקבוקון 2x עם PBS. ששבש את המונאולייר באמצעות פתרון טריפסין-EDTA והשהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של מדיום שלם של DMEM דיה.
    2. באמצעות מונה תא אוטומטי ופתרון טרימין כחול, לקבוע את הריכוז של תאים MA104 קיימא במדיום. להתאים את הריכוז 8 x 105 MA104 תאים/mL ב-dmem בינונית לא מלאה ולהוסיף 0.25 mL של תאים מושעה (2 x 105 תאים) dropwise אל הבארות המכילים בתאי bhk-T7.
    3. להתאים את הריכוז של טריפסין (porcine הלבלב סוג IX) במדיום כדי ~ 0.5 μg/mL על ידי הוספת 0.8 μL של 1 מ"ג/mL טריפסין מניות לכל באר.
      הערה: מניות טריפסין צריכות להיות מוכנות ב-PBS, מצוטט ומאוחסנות ב-20 ° c.
    4. השתמש בתאי MA104 הנותרים כדי להכין לוחות 6-היטב כי יהיה צורך ביום 7 כדי להגביר רקומביננטי וירוסים. כדי זרע 6-צלחות היטב, לדלל מחדש את התאים MA104 לריכוז של 1.5 x 105 תאים/ML ב dmem דיום להשלים ומקום 2 mL בכל טוב. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% חממה2 .
  4. יום 7: התאוששות והגברה של וירוס מרקומביננטי מתאים מזוהמים
    1. הנושא BHK-T7/MA104 תאים 12-לוחות לשלושה מחזורים של הקפאת ההפשרה תחת תנאים סטריליים, הזזת צלחות בין-20 ° c מקפיא ומשטח טמפרטורת החדר. לאחר העברת lysates כדי 1.5 mL, צינורות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 500 x g (4 ° c) כדי גלולה פסולת תאית גדולה. לאסוף את הסופרנטנט ולאחסן ב -4 ° צ' (טווח קצר) או-20 ° צ' (טווח ארוך).
    2. לשטוף MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות (מוכן ביום 4) 2x עם PBS. מניחים 2 מ ל של המדיום השלם DMEM לאה לכל טוב המכיל 0.5 μg/mL טריפסין. הוסף 300 μL של סופרנטנט התאושש מ-BHK-T7/MA104 תא lysates לתוך בארות ומקום לוחות ב 37 ° c, 5% ושות חממה2 .
    3. הצלחות דגירה של 7 ימים או עד להשלמת אפקט ציטופתי אפקטים (cpe) הם נצפו. Lyse MA104 תאים 6-צלחות היטב על ידי שלושה מחזורים של הקפאת ההפשרה, ולאחר מכן להעביר lysates כדי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. גלולה פסולת תאית גדולה על ידי צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 500 x g (4 ° c). העבר את lysates התא הבהיר לתוך הצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° c.

4. פלאק בידוד של וירוסים רקומביננטי

  1. הפעל וירוסים ב-100 μL הבהיר תא ליטים על ידי הוספת טריפסין לריכוז הסופי של 10 μg/mL ו דגירה ב 37 ° c עבור 1 h. הכינו סדרת דילול טורי 10 מקפלים החל מ -10-1 עד 10-7 (1 מ"ל כל אחד) במדיום dmem לא שלם.
  2. לשטוף MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות 2x עם 2 מ ל של PBS ופעם עם DMEM דיום לא מושלם. הוסף 400 mL של מדלל הליפוסט בשכפול ללוחות. מודקות את הצלחות עבור 1 h ב 37 ° c, 5% החממה2 , נדנדה כל 10 עד 15 דקות כדי להפיץ את הדילול על פני המונאולייר.
  3. הכינו פתרון של שכבת-על על-ידי שילוב של כרכים שווים של מדיום חיוני של 2x איגל (EMEM; מראש עד 37 ° c) עם 1.5% הצמח שנמס במים באמצעות תנור מיקרוגל ומקורר ל 45 ° c. שמרו על פתרון הכיסוי ב42 ° c באמצעות אמבט מים והתאימו לריכוז הסופי של 0.5 μg/mL באופן מיידי לפני הנחת התאים.
  4. לצייר לחות מתוך 6-טוב צלחות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל של DMEM שלם. שכבת-על בעדינות 3 מ ל של הפתרון של כיסוי הראש של הצמח אל המונאולייר הכלול בכל באר. הניחו לשכבת-העל להיות מרדן בטמפרטורת החדר ולאחר מכן החזר צלחות לחממה.
  5. שלושה ימים לאחר מכן, הכינו פתרון של שכבת-על של agarose כמו בשלב 4.3 והביאו ל-42 ° c. מיד לפני השימוש, להתאים את הפתרון כיסוי לריכוז הסופי של 50 μg/mL ניטרלי אדום (טבלת חומרים).
  6. הוסף 2 מ ל של פתרון שכבת-העל מעל השכבה הקיימת של הצמח בצלחות 6-היטב. לאחר התרת שכבת האגרה החדשה להארדן, החזר צלחות לחממה. הגנה על פתרונות וצלחות המכילות אדום נייטרלי מחשיפה לאור.
  7. במהלך 6 ה ' הבאה, לזהות שלטים רוטוירוס בצלחות 6-היטב בעזרת תיבת אור. בחר לוחיות מוגדרות בבהירות באמצעות pipets העברה חד פעמיות, שחזור אטמי agarose כי להאריך לחלוטין את שכבת התא.
  8. לגרש את התקע לתוך צינור 1.5 mL המכיל 0.5 mL של המדיום השלם DMEM ומערבולת המדגם עבור 30 s. להגביר את הפלאק וירוס מבודד לתוך המדיום על ידי התפשטות על MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות או T25 מבחנות המכילים DMEM בינוני לא שלם ו 0.5 μg/mL טריפסין.
    הערה: מידע נוסף הנוגע לבידוד ולניתוק של רוטוירוס באמצעות שיטת הפלאק זמין בארנולד ואח '31.

5. ג'ל אלקטרופורזה של dsRNA נגיפי

  1. מקום 600 μL הבהיר תא נגוע lysates ו 400 μL של guanidinium thiocyanate ב 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות, מערבולת עבור 30 s, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 200 μL של כלורופורם, מערבולת עבור 30 s, ו דגירה עבור 3 דקות. לאחר תפרידו עבור 5 דקות ב 13,000 x g (4 ° c), העברה ~ 550 μl של השלב העליון מימית לתוך צינורות טריים.
  2. שחזור dsRNA ויראלי מן השלב מימית על ידי הוספת 2 אמצעי אחסון (~ 900 μL) של אלכוהול איזופרופילי קר ו היפוך צינורות 4-6x. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות, צינורות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 13,000 x g (4 ° c). להיפטר supernatants ולשמור את כדורי RNA.
  3. לשטוף את כדורי על ידי הוספת 1 מ ל של 75% אתנול לצינור, היפוך פעם אחת, ו תפרידו עבור 5 דקות ב 7,500 x g (4 ° c). לאחר הסרת בזהירות את שטיפת האתנול עם פיפטורים, לאפשר כדורי RNA לאוויר יבש על הספסל במעבדה עבור 5-10 דקות. התמוססות כדורי RNA ב 15 μL של nuclease-חינם ביולוגיה מולקולרית בכיתה וחנות ב-20 ° c.
  4. לשלב 10 μL של דגימות RNA מומס עם 2 μL של 6x מאגר הטעינה של ה-DNA, טען אל מיני ג ' ל 10% פוליאקרילמיד מיניבר (או יד יצוקה שווי), ולפתור RNAs על ידי אלקטרופורזה ב טריס-גליצין פועל מאגר עבור 2 h תחת זרם קבוע (16 mA). לטבול ג'ל עבור 5-10 דקות במים המכילים ~ 1 μg/mL אתידיום ברומיד ולזהות מקטעי הגנום רוטוירוס עם מעבר UV.

6. שחזור ורצף של dsRNA ויראלי

  1. אתר להקות ויראליות dsRNA על ג'ל פוליאקרילאמיד רצוי באמצעות עוצמה נמוכה אורך גל UV אור, כדי למנוע יצירת הצלב חומצה גרעין. באמצעות להב תער טרי, גזור שברי ג'ל המכיל להקות dsRNA ולהעביר לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  2. לאחר הוספת 10 של20 μL of RNase-מים ללא תשלום, למחוץ כל רסיס עם הגלולה RNase-חינם כדור אחד שנועד להתאים שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL או על ידי ציור למעלה ולמטה דרך מחט 18 G. מודצת שברי כתוש לילה ב 4 ° c.
  3. לשחזר 3 μL של נוזל מצינורות המכילים שברי ג'ל כתוש. צור cDNAs של dsRNAs נגיפי באמצעות הפוכה צעד אחד הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) ערכת (טבלת חומרים) ומתאים לשימוש בצבעי היסוד.
    הערה: מוצרי PCR מטוהרים בעזרת ערכת ניקוי של ה-PCR (טבלת חומרים) ונשלחת לרצף לילה, יחד עם התחל, על-ידי שירותי רצף DNA מסחריים.

7. ניתוח חיסוני של חלבונים ויראליות

  1. זרעים 6-צלחות עם 3 x 105 MA104 תאים לכל טוב בנפח כולל של 2 מ ל של מדיום להשלים dמאמ. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% בחממה2 ולעזוב עד התאים להגיע שליטה (3-5 ימים).
    הערה: בארות עם מונולאיירס מכיל ~ 1.2 x 106 תאים.
  2. הטיפול הבהיר סופרנטנים על ידי הדגירה עם 10 μg/mL טריפסין ב 37 ° c עבור 1 h כדי להפעיל חלקיקים רקומביננטי רוטוירוס הכלולים בתוכם.
  3. לשטוף MA104 monolayers ב 6-טוב צלחות 2x עם 2 מ ל PBS. להדביק את התאים על ידי הוספת, לכל באר, 200 μl של היווצרות המכיל 3-5 הפלאק להרכיב יחידות (pfu) לכל תא של טריפסין מופעל רוטוירוס ב dmem בינוני לא שלם. . החזר צלחות לחממה
  4. כל 10 דקות, להסיר צלחות וסלעים בעדינות כדי להפיץ מפצה על פני מונאולייר התא. לאחר 1 h, החלף את האינויית עם 2 מ ל של בינוני לא שלם של DMEM.
  5. ב 8 הפוסט לאחר זיהום, לשטוף את התאים 6-היטב צלחות 2x עם PBS. לגרד תאים לתוך 750 μL של PBS והעברת נפח לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. לשטוף את הצלחת עם אחר 750 μL של PBS ולשלב עם הקודם שנאסף 750 μL לדוגמה.
  6. גלולה תאים במדגם על ידי תפרידו ב 5,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לאחר השלכת supernatant, לאחסן כדורי תא ב-80 ° c עד מעובד יותר.
  7. הכן מאגר פירוק תאים המכיל 300 מ"מ הנאל, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2% טריטון X-100, ו-1x EDTA ללא מעכב פרוטאז מלאה. לאחר הוספת 300 μL של מאגר הליזה כדי כדורי תא קפואים, בקצרה דוגמאות מערבולת ו-דגירה על הקרח עבור 10 דקות.
  8. חזור על התהליך של וורטקנג ודגימות הדגירה על 3x קרח. לאחר מכן, דגימות צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, ואז לאסוף סופרנטנים ולאחסן ב-80 ° c.
  9. לפתור חלבונים הכלולים 20 כרכים μL של דגימות סופרנטאנט על-ידי אלקטרופורזה על מיני ליניארי 8-16% פוליאקרילאמיד המיני ג'ל והעברת לממברנות תאית. ממברנות לחסום על ידי דגירה עם הערוץ 20 (0.02%) תמיסה המכילה 5% חלב יבש ללא שומן.
  10. ממברנות בדיקה על ידי הדגירה עם אחד או יותר נוגדנים העיקרי (למשל, חזיר גיניאה anti-NSP3 או anti-VP6 antisera, העכבר מונושבטיים נגד הדגל M2 נוגדן, או הארנב מונושבטיים אנטי PCNA נוגדן). לזהות נוגדנים ראשוניים על ידי ממברנות ה, עם סוס נגד עכבר IgG, anti-גיניאה חזיר IgG, או עז נגד ארנב IgG חזרת peroxidase-מעלה מעלה נוגדנים משניים, ואחריו משופרת כימויומינינציה (ECL) חזרת כימוהמצע. המחש באופן חזותי אותות באמצעות מערכת הדמיה ג'ל (טבלת חומרים) או צילום רנטגן.

8. תאים לחיות הדמיה של תאים נגועים בווירוסים ביטוי FP

  1. זרעים 6-צלחות עם 3 x 105 MA104 תאים לכל היותר בסכום של 2 מ ל של המדיום השלם Dמאמ. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% בחממה2 ולעזוב עד התאים להגיע שליטה (3-5 ימים).
    הערה: בארות עם מונולאיירס מכיל ~ 1.2 x 106 תאים.
  2. הפעל דגימות רוטוירוס, של titer ידוע, על ידי דגירה עם 10 μg/mL טריפסין ב 37 ° c עבור 1 h.
  3. לשטוף 6-היטב צלחות עם MA104 monolayers 2x עם 2 מ ל של PBS. להדביק את התאים על ידי הוספת כל טוב 200 μL של הרשת המכילה 3-5 PFU לכל תא של טריפסין מופעל הנגיף במדיום DMEM לאה. החזר צלחות לחממה ולוחות אבן בעדינות לפיזור הפצה משני התאים ברחבי התא כל 10 דקות.
    הערה: בארות שאינן נגועות בווירוסים הנגועים בווירוס בחינם, יש לכלול כפקדים.
  4. לאחר 1 שעות של וירוס ספיחה, לשטוף מונאולייר 2x עם PBS ולהחליף בינוני עם 0.5 mL לכל טוב של המדיום השלם DMEM דיה. ב 7.5 h לאחר זיהום, להחליף בינוני תרבות עם DMEM עם זריחה נמוכה ברקע (טבלת חומרים). ב 8 h לאחר ההדבקה, להשתמש הטלפון הנייד לחיות כדי לבדוק את התאים בהגדלה 20x עבור הירוק, אדום, או כחול האות זריחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הגנטי הפוך המתואר במאמר זה ההכנסות דרך מספר שלבים מובחנת: (1) שיתוף הפעולה של תאים bhk-T7 עם וקטורים שעתוק רוטוירוס pT7 ו pcmv/NP868R ביטוי פלאמאמצע, (2) זריעת יתר של תאים מזוהמים bhk-T7 עם MA104 תאים, (3) הגברה של רקומביננטי וירוסים הנמצאים bhk-T7/MA104 תאים lysates באמצעות תאים MA104, ו (4) פלאק בידוד של רקומביננטי וירוס באמצעות תאים MA104 (איור 2). בידינו, הפרוטוקול הוא יעיל, מניבים מניב של רקומביננטי wildtype SA11 וירוס (rSA11/wt) ב BHK-T7/MA104 תאים lysates של ~ 104...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במעבדה שלנו, אנו סומכים באופן שגרתי על הפרוטוקול גנטיקה הפוכה המתוארת בזאת כדי לייצר רקומביננטי SA11 rotaviruses. עם גישה זו, אנשים עם ניסיון קטן בטכניקות ביולוגיה מולקולרית או עבודה עם rotaviruses לשחזר וירוסים רקומביננטי גם בניסיון הראשון שלהם. יצרנו קרוב 100 וירוסים רקומביננטי בעקבות פרוטוקול זה, כולל אלה עם גנום שעברו הנדסה מחדש כדי לבטא חלבונים זרים (למשל, FPs) וזה מכיל התוספות רצף, מחיקות, ומוטציות נקודה.

התנאים וזמני הדגירה שניתנו בפרוטוקול זה חלים על ההתאוששות של זנים הגדלים היטב של וי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים R03 AI131072 ו R21 AI144881, מימון הסטארט-Up של אוניברסיטת אינדיאנה, ואת קרן לורנס M.. אנו מודים לחברי מעבדת הרנטגן של המעבדה, אולריך דסלברגר, וגואידו פאפא בגין תרומותיהם הרבות והצעותיהם בפיתוח פרוטוקול הגנטיקה הפוכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כליה אוגר לתינוק - T7 RdRP (BHK-T7) תאיםמגע: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-GelBio-Rad45608105
Cellometer AutoT4 מונה תאים בר קיימאNexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging SystemBio-Rad
ChloroformMP194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) SubstrateBio-Rad170-5060
Qualified E.coli DH5alpha BacteriaLucigen60602-2
מעכב פרוטאז שלםפירסA32965
פיפטות העברה חד פעמיות, טיפים מורחבים עדינים במיוחדMTC BioP4113-11
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)Lonza12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)איכות ביולוגית115-073-101
אתנול, אבסולוט (200 הוכחה)פישר ביו-ריאגנטיםBP2818-500
תמיסת אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל)Invitrogen15585-011
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג35-010-CV
סרום בקר עוברי (FBS),קורנינג35-011-CV
דגל M2 נוגדן, עכבר חד-שבטיSigma-AldrichF1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep KitSigmaNA0200-1KT
Geneticin (G-418)Invitrogen10131-027
Gibco FluroBrite DMEMThermoFisherA1896701DMEM עם רקע נמוך פלואורסצנטי
גלזגו מדיום חיוני מינימלי (GMEM)Gibco11710-035
עיזים נגד ארנב IgG, חזרת פרוקסידאז (HRP)טכנולוגיית איתות תאיםמצומדים 7074S
חזיר ניסיונות אנטי-NSP3 אנטי סרוםפטון מעבדהלוט 55068
חזיר ניסיונות אנטי-VP6 AntierumPattonמעבדה מגרש 53963
חזיר נגד גינאה IgG של סוסים, חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומדKPL5220-0366
IgG נגד עכבר סוסים, חזרת ארוקסידאז (HRP)טכנולוגיית איתות תאים7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR DetectionKit JH Science25235
איזופרופיל אלכוהולמקרון3032-02
תמיסת L-גלוטמין ( 100x)Gibco25030-081
אבקת לוריא אגר (אגר LB של מילר)מוצרי מחקר RPIL24020-2000.0
בינוני 199 (M199) תרבית בינוניתשיקלוןSh30253.01
מינימלי חיוני בינוני -פורום נשר ג'וקליק (SMEM)לונזה04-719Q
כליות קוף (MA104) תאיATCCATCC CRL-2378.1
NanoDrop One SpectrophotometerThermoScientific
תמיסה אדומה ניטרלית (0.33%)Sigma-AldrichN2889-100 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)Gibco11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide מיני-ג'לInvitrogenXP00102BOX
נוקלאז ביולוגיה מולקולרית כיתה מיםInvitrogen10977-015
ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR NucleoSpinTakara740609.25
Opti-MEM סרום מופחת בינוניGibco31985-070
עלי גלולה (ללא RNase, חד פעמי)פישר12-141-368
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, (100x penn-strep)קורנינג30-002-Cl
פוספט תמיסת מלח חוצצת (PBS), 10xפישר ביוריאגנטיםBP399-20
טריפסין חזיר, סוג IX-Sסיגמא-אולדריץ'T0303
PureYield פלסמיד Miniprep מערכתPromegaA1223
Qiagen פלסמיד מקסי ערכתQiagen12162
Qiagen פלסמיד מידי ערכת Qiagen12143
QIAprep ספין MiniprepQiagen27104
SA11 pT7 וקטורי שעתוקAddgene89162-89172
SA11 pT7/NSP3 וקטורי שעתוק המבטאים חלבונים פלואורסצנטייםאיש קשר: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE AgaroseLonza50000לאלקטרופורזה של ג'ל
SeaPlaque agaroseLonza50100לבדיקת
פלאקSuperscript III ערכת RT-PCR חד-שלביתInvitrogen12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer KitBio-Rad170-4270
Trans-Llot TurboBio-Rad
TransIT-LTI Transfection ReagentMirusMIR2306
Tris-Glycine-SDS ג'ל מאגר ריצה (10x)Bio-Rad161-0772
טריטון X 100פישר ביוריאגנטיםBP151-500
טריזול ריאגנט מיצוי RNAאמביון15596026
טריפן כחולקורנינג25-900-CI
טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) איכות תמיסת דיסוציאציה של תאיםביולוגית118-087-721
מרק טריפטוז פוספטג'יבקו18050-039
Tween-20VWR0777-1L
Vertrel VF ממסZoroG0707178
Zoe Fluorescent Live Cell ImagerBio-Rad
מומת בחום מצומד ללא Transfer System

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BHKT7MA1042ARNA

מאמרים קשורים