בקרת מורפולוגיה של פולימרים אלקטרו-ספוניים להנדסת רקמות מודגמת באמצעות קו תאים hepG2

סיכום

שיטה זו מספקת את האמצעים לבדיקת מורפולוגיות וטופוגרפיות שונות של סיבי פוליקפרולקטון לצורך הנדסת רקמות. סיבים קטנים וגדולים מיוצרים עם כיוונים אקראיים, כיוונים מיושרים, וגם מבנים נקבוביים ומשמשים כפלטפורמות לתרבית תאים.

תקציר

אלקטרו-ספינינג מעניק לחוקרים את ההזדמנות לייצר סיבי פולימר מיקרו עד ננומטריים הניתנים לשחזור. הארכיטקטורה הסיבית התלת מימדית של פולימרים אלקטרוספונים נחשבת לחיקוי מבני של המטריצה החוץ-תאית (ECM). לפיכך, סיבים חשמליים המיוצרים מפולימרים תואמים ביולוגית נחקרו באופן נרחב על ידי חוקרי הנדסת רקמות בשל תפקידם הפוטנציאלי כ-ECM מלאכותי להנחיית צמיחת רקמות הן במבחנה והן ב-vivo. כל התאים רגישים מאוד לסביבה המכנית שלהם. זה הוכח על ידי גילוי של מסלולי טרנסדוקציה מכניים מרובים הקשורים באופן מהותי לחוטי האקטין של השלד הציטו-שלד. השלד הציטולוגי פועל כחיישן מכני שיכול לכוון את הפונקציונליות והבידול של התא המארח בהתאם לנוקשות ולמורפולוגיה של המצע שלו. ניתן לכוונן סיבים חשמליים הן מבחינת גודל הסיבים והן מבחינת המורפולוגיה כדי לווסת בקלות את הסביבה המכנית בתוך פיגום פולימרי סיבי. כאן מתוארות שיטות לאלקטרוספינינג פוליקפרולקטון (PCL) עבור שלוש מורפולוגיות נפרדות בשני קוטרי סיבים שונים. קטגוריות הסיבים המורפולוגיות מורכבות מסיבים בעלי אוריינטציה אקראית, סיבים מיושרים וסיבים נקבוביים מסובבים קריוגניים, בקוטר של 1 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר. השיטות המפורטות במחקר זה מוצעות כפלטפורמה לחקירת ההשפעה של ארכיטקטורת סיבים חשמליים על יצירת רקמות. הבנת ההשפעות הללו תאפשר לחוקרים לייעל את התכונות המכניות של סיבים חשמליים ולהדגים את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו בצורה יסודית יותר.

מבוא

שיטות הנדסת רקמות התפתחו בעשורים האחרונים כדי לספק לתאים סביבה ביומימטית על מנת לעודד התחדשות רקמות מוצלחת, הן למודלים של רקמות במבחנה והן לטכניקות התחדשות in vivo. שיטות אלו בדרך כלל מעודדות תאים ליצור אגרגטים תלת מימדיים, בעצמם או באמצעות פיגום מנחה¹. ניתן לייצר פיגומים כננו/מיקרו-מבנים פולימריים נקבוביים או סיביים, או כהידרוג'לים סופגי מים מאוד ^2,3,4. אלקטרו-ספינינג פולימרי היא טכניקת ייצור נפוצה המניבה מטריצות סיבי פולימר ננו-מיקרו-מיקרו לא ארוגים שיכולות לחקות את הארכיטקטורה הסיבית של המטריצה החוץ-תאית המקורית (ECM)⁵. פולימרים ביו-תואמים מרובים ישימים לתהליך האלקטרו-ספינינג; לפיכך, סיבים חשמליים הם מדיום פופולרי להקלה על התחדשות רקמות ^6,7,8. סיבים חשמליים שימשו בתרבית של מגוון רקמות, מה שמדגים שדרה מבטיחה לפלטפורמות פיגומים זולות וניתנות לשחזור 9,10,11,12,13.

לתאים יש רגישות חריפה לסביבתם המכנית. מחקרים קודמים הדגישו את הקשר החשוב הזה, הנקרא mechanotransduction, שיכול להשפיע על תפקוד התא, מורפולוגיה והתמיינות^14,15. הבסיס של השלד התא האיקריוטי בנוי מאקטין חוטי וממלא תפקידים מכניים מרכזיים בחלוקה תאית, הידבקות, נדידה, התכווצות ומורפולוגיה. הוא מנוהל על ידי גירויים מכניים חיצוניים באמצעות חיבור עם חלבוני פני שטח חוץ-תאיים 16,17,18. השפעה מורפולוגית על התמיינות תאי גזע הודגמה במחקרים רבים על ידי שינוי צורתו של מצע הניתן לחיבור, אשר לאחר מכן מסוגל לשלוט בצורת התא ולכוון את תהליך ההתמיינות^19,20. יתר על כן, קשיחות המצע שעליו מתחברים התאים משפיעה גם על גורל תאי הגזע ועל השושלת^21,22. מלבד תאי גזע, השפעות אלו נצפו כמשפיעות גם על תאים משושלות שונות^23,24. שיטות הנדסת רקמות תלת מימדיות הראו תוצאות דומות לאלו שנמצאו במחקרי מכניקה דו-ממדיים עם הידרוג'לים ופיגומים סיביים 25,26,27. יתר על כן, מכניקת המצע מועברת באמצעות אגרגטים של תאים תלת מימדיים באמצעות איתות תא-תא²⁸. מכניקת החומרים ממלאת תפקיד מכריע בהכוונת הפונקציונליות התאית ולכן צריכה להיות גורם מרכזי בתכנון פיגומים לרקמות מהונדסות.

מטרת שיטה זו היא להבין את ההשפעות של גודל ומורפולוגיה של סיבי פוליקפרולקטון (PCL) על תרביות תאים במבחנה. השיטה מותאמת ממחקרים קודמים שהתמקדו בהנדסת רקמות כליה⁹. פרוטוקול מפורט יותר שלב אחר שלב מוצע כאן על מנת להקל על שחזור פיגומים ולפתח שיטה סטנדרטית המתאימה לכל סוגי התאים. שש קבוצות של פיגומים נבנו בשיטה זו: שלוש הן סיבים גדולים של 5 מיקרומטר (LG) ושלושת האחרים סיבי 1 מיקרומטר קטנים (SM), תוך שימוש בריכוזי PCL שונים. בתוך קבוצות LG ו-SM אלה ישנם שלושה מבנים מורפולוגיים שונים: סיבים אקראיים (RA), סיבים מיושרים (AL) וסיבים קריוגניים נקבוביים (CR). לכל קבוצות הפיגומים הללו יש מבנים שונים מטבעם, וכך הן מספקות סביבות מכניות מקומיות ייחודיות שעליהן מתחברים התאים. כדי להדגים את ההשפעה המורפולוגית שזה מספק לתאים, קו התאים hepG2 נזרע על כל קבוצת פיגומים כמחקר מייצג. שיטה זו מוצעת כניתוח בסיסי לתכנון פיגום אלקטרוספולד עבור כל סוגי התאים מתאי גזע ועד קווי תאים ותאים ראשוניים.

פרוטוקול

1. הכנת פתרון

1. סיבים גדולים (אקראיים, מיושרים וקריוגניים)
   1. הכן יחס של 5:1 של כלורופורם ומתנול על ידי ערבוב של 50 מ"ל כלורופורם ו-10 מ"ל מתנול בבקבוק זכוכית חסין ממס באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית.
      זהירות: כלורופורם ומתנול הם ממיסים רעילים ויש לבצע ערבוב במכסה אדים.
   2. כדי ליצור תמיסה של 19 w/v% של PCL בכלורופורם:מתנול 5:1, שקלו 1.9 גרם PCL והוסיפו ל-10 מ"ל של 5:1 כלורופורם:מתנול בבקבוקון זכוכית חסין ממסים. אטמו פעמיים את הבקבוקון באמצעות סרט פרפין והשאירו את הבקבוקון על גלגלת למשך הלילה כדי לאפשר ל-PCL להתמוסס במלואו.
      זהירות: הערבוב חייב להתבצע במכסה אדים.
2. סיבים קטנים (אקראיים ומיושרים)
   1. להכנת תמיסה של 7 w/v% של PCL ב-hexafluoroisopropanol (HFIP), שקלו 0.7 גרם PCL וערבבו עם 10 מ"ל HFIP בבקבוקון זכוכית חסין ממס. אטמו פעמיים את הבקבוקון באמצעות סרט פרפין והשאירו על גלגלת למשך הלילה כדי לאפשר ל-PCL להתמוסס במלואו.
      זהירות: HFIP רעיל מאוד ויש לבצע ערבוב במכסה אדים.
3. סיבים קריוגניים קטנים
   זהירות: הערבוב חייב להתבצע במכסה אדים.
   1. הכן יחס של 3:1 של כלורופורם ומתנול על ידי ערבוב של 30 מ"ל כלורופורם ו-10 מ"ל מתנול בבקבוק זכוכית חסין ממס באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית.
   2. כדי ליצור תמיסה של 14 w/v% של PCL בכלורופורם:מתנול 3:1, שקלו 1.4 גרם PCL והוסיפו ל-10 מ"ל של 3:1 כלורופורם:מתנול בבקבוקון זכוכית חסין ממס. אטמו פעמיים את הבקבוקון באמצעות סרט פרפין והשאירו על גלגלת למשך הלילה כדי לאפשר ל-PCL להתמוסס במלואו.

2. הגדרת אלקטרו-ספינינג

הערה: יש להגדיר את הפרמטרים לפני תחילת תהליך האלקטרו-ספינינג.

1. גודל המחט ומיקומה
   1. עבור סיבים גדולים (אקראיים, מיושרים וקריוגניים) השתמש במחט פליז בגודל 1 מ"מ OD/0.8 מ"מ ID והנח את המחט במרחק של 230 מ"מ ממשטח הציר.
   2. עבור סיבים קטנים השתמש במחט פליז 1 מ"מ OD/0.4 מ"מ ID והנח את המחט במרחק של 15 מ"מ ממשטח הציר.
2. תנועת מחט לרוחב
   הערה: הפיגומים המפורטים באיור 1 יוצרו עם מחט של 100 מ"מ החוצה במהירות של 50 מ"מ לשנייה, עם תנועה חוזרת ונשנית שמאלה וימינה לאורך כל התהליך.
   1. כדי להגדיר את התנועה הרוחבית, לחץ על Motion | TNS 1 והגדר את מצב התחלה [מ"מ] ל-50, מרחק [מ"מ] ל-100, מהירות [מ"מ/שנייה] ל-50 ועיכוב סיבוב [ms] ל-750.
3. קצב זרימת משאבת מזרק
   1. עבור סיבים גדולים (אקראיים, מיושרים וקריוגניים), לחץ על הכרטיסייה חומר בממשק המשתמש והגדר את משאבת המזרק ל-4 מ"ל לשעה.
   2. עבור סיבים קטנים (אקראיים ומיושרים), הגדר את משאבת המזרק ל-0.8 מ"ל לשעה.
   3. עבור סיבים קריוגניים קטנים, הגדר את משאבת המזרק ל-2.5 מ"ל לשעה.
4. כרךtagהגדרות
   1. עבור הסיבים הגדולים, הגדר את מתח המחט ל-+15 קילו וולט ואת מתח השדרה ל-4 קילו וולט על ידי לחיצה על הלשונית מתח בממשק המשתמש ושינוי ערכי המתח החיובי והשלילי.
   2. עבור הסיבים הקטנים (אקראיים ומיושרים), הגדר את מתח המחט על +17 קילו וולט ואת מתח הציר על -4 קילו וולט.
   3. עבור הסיבים הקריוגניים הקטנים, הגדר את מתח המחט על +18 קילו וולט ואת מתח הציר על -4 קילו וולט.
5. סיבוב ציר (סיבים גדולים וקטנים)
   1. לסיבים אקראיים, לחץ על Motion | כוון והגדר את מהירות סיבוב הציר ל-250 סל"ד.
   2. עבור סיבים מיושרים, הגדר את מהירות סיבוב הציר ל-1,800 סל"ד.
   3. עבור סיבים קריוגניים, הגדר את מהירות סיבוב השדרה ל-180 סל"ד.

3. אלקטרו-ספינינג של סיבים אקראיים ומיושרים (סיבים גדולים וקטנים)

1. הכנס את המחט (עיין בסעיף 2.1 למידע על גודל המחט ומיקומה) לתוך צינור PTFE עם קדח 1 מ"מ ואבטח בתוך מחזיק המחט האלקטרו-ספינר.
2. מתחת למכסה אדים, העבירו את 10 מ"ל תמיסת הפולימר למזרק פוליפרופילן או זכוכית (חסין ממס). הקפד להסיר בועות על ידי מתן למזרק לעמוד לפני ההתחלה.
3. חבר את המזרק למחט דרך צינור ה-PTFE ואבטח את המזרק בתוך משאבת המזרק. לאחר החיבור, יש להפעיל את צינור ה-PTFE על ידי סחיטת בוכנת המזרק ומילוי הצינור בתמיסת פולימר.
4. עטפו את השדרה בנייר אלומיניום והדקו על מכשיר סיבוב הציר.
5. הפעל את סיבוב הציר על ידי לחיצה על Motion | טארגט | סובב את משאבת המזרק על ידי לחיצה על חומר | הפעל את משאבה 1.
6. כאשר נוצר חרוז קטן של פולימר בקצה המחט, הפעל את המתח על ידי לחיצה על ACTIVATE HIGH VOLTAGE. לאחר מכן יש לפלוט סילון של פולימר מבליטה חרוטית של תמיסת פולימר, הנקראת חרוט טיילור. בדוק את הציר כדי לאשר את שקיעת הסיבים על משטח הציר.
7. הפעל את תהליך האלקטרו-ספינינג עד שהכמות הרצויה של תמיסת PCL תהיה חשמלית.
   הערה: עבור הפיגומים המוצגים באיור 1, 4 מ"ל של תמיסה היו חשמליים.
8. לאחר סיום האלקטרו-ספינינג, הסר את נייר האלומיניום המכוסה בסיב מהשדרה והשאיר בארון אדים למשך הלילה כדי לאפשר אידוי עודף של ממס.
9. לאחר האידוי, אחסן את הסיבים בטמפרטורת החדר (RT).

4. אלקטרו-ספינינג של סיבים קריוגניים

1. עבור אלקטרוספינינג קריוגני, השתמש בציר המסתובב קריו. חזור על שלבים 3.1-3.3 ולאחר מכן המשך בשלבים הבאים.
2. עוטפים את השדרה בנייר אלומיניום.
3. מלאו את השדרה בכדורי קרח יבשים. אבטח את מכסה הציר המסתובב בהקפאה על הציר כדי להבטיח שקרח יבש לא יוכל לברוח מהשדרה אך לחץ יכול לברוח. גבישי קרח צריכים להיווצר על פני השדרה כמעט מיד.
   זהירות: השתמש בכפפות מגן בעת טיפול בקרח יבש כדי למנוע כוויות קור.
4. אבטח את הציר על מכשיר סיבוב הציר והפעל מיד את סיבוב הציר על ידי לחיצה על Motion | טארגט | סובב את משאבת המזרק על ידי לחיצה על חומר | הפעל את משאבה 1.
5. לאחר שנוצר חרוז פולימר בקצה המחט, הפעל את המתח על ידי לחיצה על ACTIVATE HIGH VOLTAGE. לאחר מכן יש לפלוט סילון של פולימר מבליטה חרוטית של תמיסת פולימר (כלומר, חרוט טיילור). בדוק את הציר כדי לאשר את שקיעת הסיבים על משטח הציר.
6. לאחר שעה אחת של אלקטרו-ספינינג, השהה את התהליך על ידי לחיצה על STOP ALL ומלא את השדרה בקרח יבש. הקפידו על הגנה נאותה מפני אדי ממס בזמן מילוי השדרה. בצע זאת בסך הכל 3x למשך 4 שעות בסך הכל של זמן אלקטרו-ספינינג.
   הערה: ניתן לחדש את האלקטרו-ספינינג על ידי חזרה על שלבים 4.4 ו-4.5.
7. לאחר סיום האלקטרו-ספינינג, הסר בזהירות את הציר והנח אותו מיד במייבש הקפאה למשך 24 שעות כדי לסובלימציה של גבישי הקרח על פני הציר.
8. לאחר הסובלימציה, הסר את נייר הכסף המכוסה בסיבים מהשדרה ואחסן ב-RT, תוך הקפדה על הימנעות מריסוק.

5. ניקוב פיגומים

1. אגרוף פיגומים מגיליון הסיבים באמצעות אגרוף ביופסיה 10-12 מ"מ. אם הסיבים נשארים דבוקים לרדיד האלומיניום, הניחו את הפיגומים באתנול 70% כדי להקל על הניתוק.

6. עיקור וציפוי פלזמה

1. מניחים את הפיגומים (פיגום אחד לבאר) בצלחת של 24 או 48 בארות ושוטפים אותם פי 3 באתנול של 70%. משאירים שקועים בכביסה הסופית, מכניסים למקפיא של -80 מעלות צלזיוס ומניחים להקפיא.
2. לאחר ההקפאה, הכניסו את הצלחת למייבש הקפאה ועשו ליופיליזציה למשך 24 שעות. כעת ניתן לצפות את הפיגומים המיובשים בפלזמה.
   הערה: אם אין גישה לציפוי פלזמה, טבלו את הפיגומים ב-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (אנטי-אנטי) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) והשאירו לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. הנח את הצלחת בתא הפלזמה והסר את המכסה. הפעל את ציפוי הפלזמה ב-500 mTorr ובתדר רדיו בינוני (RF) למשך 30 שניות.
4. לאחר ציפוי פלזמה, טבלו את הפיגומים ב-1 מ"ל PBS ו-1% אנטי-אנטי. הפיגומים צריכים לספוג בקלות את תמיסת ה-PBS.
   הערה: הפיגומים מוכנים כעת לזריעה עם תאים.

7. הכנה וזריעה של תאים

הערה: טכניקת תרבית התאים הבסיסית המופיעה להלן מיועדת לתאי hepg2 המשמשים למטרות הדגמה בתוצאות המייצגות. ניתן ליישם עקרונות אלה על כל סוג תא דבק; עם זאת, תאים שונים עשויים לדרוש חומרים שונים ותהליכים שונים. הטיפול בתאים חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגי, בטכניקה אספטית.

1. קח 1 x 10⁶ תאי hepg2 שמורים בהקפאה וזרע לתוך בקבוק תרבית תאים T75 עם 12 מ"ל של חומר שלם המורכב מהמצע החיוני המינימלי של Eagle (EMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין, 5 מ"מ L-גלוטמין ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות.
2. ברגע שהתאים נמצאים במפגש של 80%, נתקו את התאים מבקבוק התרבית על ידי שטיפה 3x ב-PBS ודגירה ב-2 מ"ל טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. לאחר הקשה על הבקבוק, התאים צריכים להתנתק.
3. השבת את הטריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל של מדיה שלמה. העבירו את תרחיף התאים לצינור של 15 מ"ל וסובבו את התאים בצנטריפוגה ב-120 x גרם למשך 5 דקות.
4. הסר את ה-supernatant מעל גלולת התא בעזרת פיפטה שואבת והחלף ב-5 מ"ל של מדיה שלמה. השעו מחדש את התאים על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
5. ספור את תרחיף התאים המתקבל בשיטת אי הכללת הטריפאן הכחול. קח 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים והוסף ל -100 מיקרוליטר של טריפאן כחול בבקבוקון של 1.5 מ"ל. הכניסו את התערובת להמוציטומטר מתחת לכיסוי זכוכית וספרו את התאים תחת מיקרוסקופ.
6. התאם את ריכוז התאים ל-2.6 x 10⁶ תאים/מ"ל על-ידי הוספה או הסרה של מדיה שלמה. כדי להסיר מדיה, תאי צנטריפוגה ב-220 x גרם למשך 5 דקות, הסר את המדיה הנדרשת והשהה מחדש את התאים.
7. שאפו את האנטי-אנטי 1% ב-PBS מצלחת הבאר וזרעו 50 מיקרוליטר של 2.6 x 10⁶ תאים/מ"ל תרחיף תאים על משטח הפיגום באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
8. אפשר לתאים להיצמד מתחת לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 1-3 שעות, וודא שהם לא מתייבשים. לאחר החיבור, הוסיפו 300 מיקרוליטר (לצלחת של 48 בארות) או 500 מיקרוליטר (לצלחת של 24 בארות) של מצע תרבית ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
   הערה: ניתן להשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיות מכאן ועד לניתוח פונקציונלי נוסף.

תוצאות

איור 1 מציג תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של סיבים קטנים (~1 מיקרומטר) וגדולים (~5 מיקרומטר) המיוצרים מתמיסות PCL. הסיבים היו מצופים בזהב-פלדיום (60:40) למשך 30 שניות באמצעות ציפוי מקרטע לפני הדמיית SEM. סיבים גדולים הופקו באמצעות ריכוז גבוה של 19 w/v% של PCL בתמיסה של 5:1 של כלורופורם ומתנול ליצירת תמיסת PCL בעלת צמיגות גבוהה. תמיסה בעלת צמיגות גבוהה זו עברה לאחר מכן אלקטרוסון בקצב זרימה גבוה כדי לפלוט חוט גדול של תמיסת פולימר בתוך השדה החשמלי. לכן, מרחק גדול של 230 מ"מ בין המחט לציר היה הכרחי כדי להבטיח אידוי יעיל של הממס לפני השיקוע על השדרה. לעומת זאת, סיבים קטנים יותר יוצרו באמצעות ריכוז נמוך של 7 w/v% של PCL ב-HFIP כדי ליצור תמיסת PCL עם צמיגות נמוכה. אלקטרו-ספינינג של תמיסת PCL עם צמיגות נמוכה בקצב זרימה נמוך הבטיח שחוט דק יותר של תמיסת PCL נפלט מהמחט בתוך השדה החשמלי. החוט הדק יותר איפשר אידוי מהיר יותר של הממס והמחט הייתה צריכה להיות קרובה יותר לשדרה בגובה 70 מ"מ כדי להבטיח שקיעה יציבה של סיבים. עבור סיבים קריוגניים קטנים, שינוי תמיסת ה-PCL היה הכרחי כדי להשיג פרוטוקול אמין. PCL ב-HFIP שסובב על השדרה הקריוגנית הביא שוב ושוב למבנה סיבים מפורק. אלקטרו-ספינינג של ריכוז PCL של 14 w/v% במתנול כלורופורם 3:1 פתר בעיה זו; עם זאת, זה יצר שונות גדולה יותר בגודל הסיבים בכל הפיגום. מידת יישור הסיבים (רדיוס סיבים וכיוון) עבור כל פיגום נותחה באמצעות התוסף ImageJ DiameterJ²⁹ והוצגה באיור 2 ובאיור 3.

איור 1: תמונות SEM המציגות את האיכויות המורפולוגיות של כל קבוצת פיגומים. השורה העליונה מציגה את הסיבים הקטנים ובשורה התחתונה את הסיבים הגדולים. קבוצות מורפולוגיות מופיעות משמאל לימין כסיבים אקראיים, סיבים מיושרים וסיבים קריוגניים, בהתאמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: רדיוס סיבים (משמאל) וכיוון סיבים (מימין) נתונים מהתוסף DiameterJ עבור קבוצת הסיבים הקטנה. מורפולוגיה רשומה מלמעלה למטה כסיבים אקראיים, סיבים מיושרים וסיבים קריוגניים, בהתאמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: רדיוס סיבים (משמאל) וכיוון סיבים (מימין) נתונים מהתוסף DiameterJ עבור קבוצת הסיבים הגדולה. מורפולוגיה רשומה מלמעלה למטה כסיבים אקראיים, סיבים מיושרים וסיבים קריוגניים, בהתאמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטה זו הציעה לנו סט פיגומים עם שש תכונות מתיחה שונות באופן מובהק כפי שנקבעו באמצעות מכונת בדיקת מתיחה על פי שיטות שתוארו קודם לכן⁹. כפי שמוצג בטבלה 1 , המודולים של יאנגס בקנה מידה מאקרו נעים בין 46.94 ±-3.48 מגה פיקסל בסיבים המיושרים הגדולים ל-0.20 ±-0.01 מגה פיקסל בסיבים הקריוגניים הגדולים. ערכי נוקשות הרקמה הפיזיולוגית נעים בין 100 Pa (רקמה עצבית) ל-2-4 GPa (רקמת עצם)³⁰; כל ערכי קשיחות הפיגומים שדווחו כאן היו בטווח זה.

פיגום	מודול יאנגס (MPa) למתח%
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
ס.מ. ר.א.	11.14 ± 2.13	9.31 ± 0.43	6.75 ± 0.64	4.75 ± 0.59	3.32 ± 0.40
ס.מ. אל	27.94 ± 8.63	28.27 ± 7.36	16.34 ± 4.87	9.10 ± 3.75	5.85 ± 3.11
ס.מ. קרי	0.27 ± 0.11	0.31 ± 0.44	0.31 ± 0.65	0.29 ± 0.59	0.26 ± 0.40
LG. ר.א.	9.23 ± 0.78	8.22 ± 0.87	5.96 ± 0.68	3.96 ± 0.59	2.63 ± 0.45
LG. אל	46.94 ± 3.48	38.03 ± 2.46	27.69 ± 1.22	16.10 ± 1.61	7.87 ± 1.32
LG. קרי	0.20 ± 0.01	0.16 ± 0.01	0.12 ± 0.01	0.10 ± 0.01	0.09 ± 0.01

טבלה 1: נתוני בדיקת מתיחה עבור כל קבוצת פיגומים במרווחים של 2% מתח. ס.מ. RA = אקראי קטן, SM. AL = מיושר קטן, SM. CR = קריוגני קטן, LG. RA = אקראי גדול, LG. AL = מיושר גדול, ו- LG. CR = קריוגני גדול. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, n = 5.

איור 4 מציג את צביעת ה-DAPI והפלואידין המשמשים להמחשת המורפולוגיה התאית. שיטת הצביעה בה נעשה שימוש מבוססת בספרות^11,12. התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ (טבלת חומרים) עם יעד הגדלה של פי 40. התמונות מראות כי הסיבים המיושרים המיוצרים בשיטה זו האריכו את מורפולוגיה של תאי hepG2 וכיוונו תאים מתרבים לאורך הסיבים, ויצרו כיווניות בתוך תרבית התאים. לעומת זאת, תאי hepG2 על סיבים אקראיים לא הציגו את ההתפשטות וההתארכות הכיוונית שנצפו במבנים המיושרים. במבנים האקראיים תאי hepG2 הציגו מורפולוגיה סדירה יותר עם בליטות מורחבות המתחברות לסיבי ה-PCL שמסביב.

איור 4: תאי hepG2 מוכתמים DAPI (כחול) ופלואידין (ירוק) על המורפולוגיה השונות של הפיגומים: אקראיים (משמאל), מיושרים (באמצע) וקריוגניים (מימין). השורה העליונה מציגה סיבים קטנים והשורה התחתונה מציגה סיבים גדולים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

יצירת גדלי סיבים שונים הושגה באמצעות שילוב של ממיסים שונים, ריכוזי PCL ופרמטרים של אלקטרו-ספינינג. סוג הפולימר, משקלו המולקולרי והממס משפיעים מאוד על תכונות הצמיגות והמטען של התמיסה המתקבלת ולכן משפיעים חזק על תכונות האלקטרו-ספינינג³¹. המתחים המוצגים בשיטה זו כפופים לשינוי בהתאם לתנאים שבהם מוליכים את האלקטרו-ספינינג. טמפרטורה ולחות משפיעים על התנהגות תהליך האלקטרו-ספינינג³². לכן, מומלץ לקורא להיות מוכן לשנות את המתח כדי להתמודד עם כל מכשול ולהשיג חרוט טיילור יציב. מומלץ לשכן את האלקטרו-ספינר בתוך מארז בקרה סביבתי כדי להפחית את השונות מאצווה לאצווה בתהליך האלקטרו-ספינינג.

השגת המורפולוגיה השונות המוצגות בשיטה זו אפשרית בשל היכולות של מכשיר האלקטרו-ספינינג IME. ציר במהירות משתנה חיוני לשליטה ביישור הסיבים. סיבוב ציר בסל"ד נמוך (<250 סל"ד) מניב סיבים בעלי אוריינטציה אקראית עקב התנהגות סילון הפולימר. כאשר תמיסת הפולימר הטעונה נפלטת מהמחט, המטענים הפנימיים והכוחות האווירודינמיים גורמים לאפקט הצלפה כאוטי המנוצל להנחת סידור כאוטי של סיבים על השדרה^33,34. ניתן להתגבר על אפקט ההקצפה הזה על ידי הגדלת מהירות סיבוב הציר מעל 1,800 סל"ד. סיבים המופקדים על ציר סל"ד כה גבוה מציגים מבנה מיושר מכיוון שמהירות פני השטח מספיקה כדי להתמודד ביעילות עם כל תנועה רוחבית המוצגת על ידי סיב ההקצפה. חשוב לציין שכאשר משתמשים במהירויות ציר גבוהות, סביר להניח שזה ישבש את האוויר שמסביב, מה שעלול להשפיע לרעה על ייצור חרוט טיילור יציב.

פיגומים קריוגניים נקבוביים במיוחד מיוצרים על ידי מילוי השדרה בקרח יבש בטמפרטורה של -78.5 מעלות צלזיוס. זה מפחית את טמפרטורת השדרה ומקדם עיבוי והקפאה של טיפות מים על פני השטח. הגבישים שנוצרו מציגים פסגות היוצאות משטח השדרה והסיבים מופקדים לאורך הפסגות. לאחר שגבישי הקרח עוברים סובלימציה החוצה, נותר מבנה נקבובי של סיבים על השדרה^35,36. המשקל והשבריריות של הגבישים מגבילים את היכולת ליצור סיבים מיושרים נקבוביים, שכן מהירויות ציר גבוהות מדי (>250 סל"ד) גורמות לניתוק הגבישים והסיבים מהשדרה עקב כוחות צנטריפטליים ואווירודינמיים מוגזמים. אפשר להתמודד עם קשיים בשיטה זו בגלל שבריריות המבנים שנוצרו. יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בשדרה וגם בעת הטיפול בפיגומים לאחר מכן, מכיוון שהמבנים נוטים להיות שטוחים בעת סחיטה וקיפול בעת הוצאתם מנוזלים. קיימת גם אפשרות שתמיסות שמתחשמלות בהצלחה ללא השדרה הקריוגנית עלולות להיות משובשות באופן קטלני על ידי שינוי הטמפרטורה ומבני הגביש. בעת סיבוב קריו, כמות הקרח הנוצרת על פני השדרה תלויה מאוד בלחות, מה שיוצר שונות בתוצאה הסופית. לכן מומלץ מאוד להכיל את תהליך האלקטרו-ספינינג בתוך מארז בקרה סביבתי.

כדי להעריך את הביצועים הסלולריים על פיגומים אלה, יש צורך לעקר את החומר מראש. ישנן אפשרויות רבות זמינות לעיקור פולימרים, כולל שיטות כימיות, שיטות קרינה ושיטות מבוססות חום^37,38. חשוב להעריך את היעילות של כל שיטה ואת ההתאמה הן לשימוש בחומר והן לחומר עצמו. פרוטוקול זה משתמש בעיקור ב-70% אתנול לפני ליופיליזציה, טיפול בפלזמה וטבילה בתמיסה אנטי-אנטי 1%. השימוש באתנול מאפשר לעבור דנטורציה ולייבש חלבונים ומיקרואורגניזמים מבלי לשבש את חומר ה-PCL³⁷. השימוש בממיסים חזקים יותר עלול לגרום לפירוק ה-PCL. ציפוי פלזמה שולב בשיטה זו בעיקר כדי להגביר את ההידרופיליות של PCL, הידוע לשמצה בהידרופוביה, ולשפר את הצמדת התאים^39,40. באופן נוח, זה עובד גם כשלב עיקור משני, אך יש להקפיד לשמור על הפיגומים בסביבה סטרילית לפני ואחרי טיפול בפלזמה. שיטה זו הוכחה כמתאימה למחקרי מבחנה עם מדיה המטופלת באנטיביוטיקה. עם זאת, עבור יישומי in vivo, יש לשקול אפשרויות חזקות יותר כגון אתילן אוקסיד (EtO) וחשיפה לגמא. לאחר ביצוע העיקור, ניתן לזרוע תאים על הפיגום וליישם טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות ליצירת תרביות תאים תלת מימדיות במבחנה.

חשוב לציין כי יש לייחס את ערכי הנוקשות למיקרו-מבנים השונים שנוצרו בתוך הפיגומים. החומר בתפזורת (PCL) נשאר קבוע בין הפיגומים. לכן, קשיחות החומר בתפזורת אינה משתנה בין קבוצות. הפיגומים הקריוגניים מציגים קשיחות נמוכה בהרבה מהקבוצות האחרות בשל הקישוריות המופחתת בתוך מטריצת הסיבים, אותה ניתן לראות בטבלה 1. הקישוריות המופחתת נחשבת כגורמת לעיוות דומיננטי יותר בכיפוף בניגוד לעיוות דומיננטי במתיחה בתוך המבנה הסיבי⁴¹. מעניין שנוקשות הפיגום אינה תלויה מאוד בגודל הסיבים בקבוצות האקראיות והקריוגניות. עם זאת, הנוקשות האורכית של הסיבים המיושרים מראה תלות גבוהה משמעותית בגודל הסיבים כאשר מודול יאנגס במתח של 0-2% הוא 27.94 ±-8.63 מגה פיקסל לסיבים קטנים ו-46.94 ±-3.48 מגה פיקסל לסיבים גדולים. בשל אופי המתיחה של בדיקת המתיחה, הדבר מרמז על צפיפות PCL בתפזורת גבוהה יותר בחתך האורך. יש לחזור ולהדגיש כי הנתונים המכניים המוצגים כאן הם תמונת מצב מכנית בקנה מידה מאקרו של הארכיטקטורות הסיביות. אפיון מיקרומכני נוסף יועיל להבנה מלאה של ההשפעות המכניות על קנה המידה של התא.

ארכיטקטורות אקראיות ומיושרות נכללו בשיטה זו כדי לספק השוואה בין מורפולוגיות איזוטרופיות ואנאיזוטרופיות. ניתן לראות את מידת יישור הסיבים בתמונות SEM באיור 2 ובניתוחי הסיבים המוצגים באיור 2 ובאיור 3. תכונות אנזוטרופיות נצפות ברבות מהרקמות בגוף. בפרט, זה נצפה בדרך כלל במבנים תאיים מיושרים כמו אלה הנמצאים ברקמות שריר ועצבים. מבני סיבים פולימריים מיושרים מציעים את היכולת לסכם את המבנים המיושרים הללו במבחנה^42,43. כפי שתואר קודם לכן, תפקוד התא רגיש לשינויים מורפולוגיים ומכניים, ולכן יש לבצע ניתוח תפקודי נוסף על תאים הקשורים לפיגום כדי לקבוע את ההשפעה הביולוגית של כל סוג פיגום.

בהשוואה לטכניקות ייצור פיגומים קיימות אחרות, שיטה זו מספקת דרך פשוטה לייצר מבני פיגומים בקנה מידה מיקרו עם שליטה גבוהה יחסית על התכונות המכניות והמורפולוגיה. ייצור פיגומי PCL חלופיים כגון הפרדת פאזה, שטיפת מלח וקצף גז מאפשרים שליטה מורפולוגית במונחים של חלל ריק וגודל נקבוביות. עם זאת, הנקבוביות והגיאומטריה המבנית נשארות במידה רבה זהות 44,45,46,47. לכן, איכויות כמו רמת האיזוטרופיה אינן ניתנות לשינוי באותה קלות בהשוואה לאלקטרוספינינג. חומרי הידרוג'ל, הפופולריים לייצור פיגומים, מספקים את האמצעים לשינוי קשיחות המצע הפולימרי באמצעות שינוי רמת שרשראות הפולימר הצולבות⁴⁸. ניתן גם להדפיס בתלת מימד במגוון שיטות, המספקות שליטה מצוינת על המורפולוגיה⁴⁹. עם זאת, השגת רזולוציה בקנה מידה אלקטרו-ספינינג בחומרי הידרוג'ל תואמים ביולוגית נותרה אתגר ליישום מעשי^50,51. פיגומים אלקטרוספונים הופיעו בדרך כלל במחקר הנדסת רקמות במהלך העשור האחרון, והכנסת חומרים ויישומים חדשים עם סוגי תאים שונים נחקרת תמיד. בעוד שחומרים חדשים נמצאים בפיתוח מתמיד לצורך פיגומי אלקטרו-ספינינג, נותרו הזדמנויות לאפיון ביולוגי נוסף של חומרים ושיטות אלקטרו-ספינינג קיימים. השיטה המתוארת מוצעת כשיטה להקלה על מחקר ביולוגי במבחנה, מכיוון שהיא ישימה ישירות לטכניקות תרבית תאים בסיסיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביופסיה 10 מ"מ אגרוף	Acuderm	P1025
15 מ"ל צינור פלקון	תרמו-מדעי	339650
20 מ"ל בקבוקון זכוכית	פישרברנד	11513542
48 באר צלחת תרבית תאים	גריינר ביו-וואן	677180
אנטי אנטי 100X	גיבקו	15240062
כלורופורם	אקרוס אורגני
DAPI	Sigma-aldrich	D9542
Eagles Minimum Essential Media	Gibco	11090081
Electrospinner	IME Technologies	EC-DIG
סרום בקר עוברי	GE Healthcare	SH30071.03
ציפוי זהב-פלדיום מקרטע	Emscope	SC500A
תא HepG2 קו	סיגמא-אולדריץ'	85011430
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Manchester Organics	G26383
L-גלוטמין 200 מ"מ	Gibco	25030081
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	Gibco	11140050
מתנול	Acros Organics	11984591
פניצילין-סטרפטומיצין 10,000 U/mL	Gibco
Phalloidin	Abcam	ab176754
פוספט חוצץ מלח (PBS)	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
ציפוי פלזמה	Harrick Plasma	PDC-002
Polycaprolactone (ממוצע MW 80,000)	Sigma-aldrich	440744
PTFE מזרק	פישרברנד	12941031
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	היטאצ'י	S4700
T75 תרבות בקבוק	קורנינג	CLS430641
טריפן כחול (0.4%)	Gibco	15250061