דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Summary

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

Abstract

Vaccinia וירוס (VACV) היה אינסטרומנטלי וירוס בריאולה (VARV), הסוכן סיבתי של אבעבועות שחורות, מן הטבע. מאז השימוש הראשון שלה כחיסון, VACV פותחה כווקטור עבור חיסונים טיפוליים כמו וירוס oncolytic. יישומים אלה מנצלים את הגנום של VACV בקלות מניפולציה וטווח מארח רחב כפלטפורמה מצטיינים לייצר וירוסים רקומביננטי עם מגוון רחב של יישומים טיפוליים. מספר שיטות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV, כולל סמן שיטות בחירה שולטת ארעי. כאן, אנו מציגים עידון של שיטת בחירת טווח מארח ביחד עם זיהוי חזותי של וירוסים רקומביננטי. השיטה שלנו מנצלת לחץ סלקטיבי שנוצר על ידי מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) בשילוב עם גן היתוך פלורסנט ביטוי mCherry-tagged E3L, אחד משני היריבים VACV PKR. הקלטת, כולל הגן של הריבית ואת הפיוז mCherry-E3L מוקף רצפים נגזר הגנום VACV. בין הגן של הריבית ו-mCherry-E3L הוא אזור קטן יותר זהה הראשון ~ 150 נוקלאוטידים של 3 ' זרוע, כדי לקדם הומוולוגי מחדש ואובדן של הגן mCherry-E3L לאחר בחירה. אנו מדגימים כי שיטה זו מאפשרת דור יעיל, חלקה של rVACV במגוון סוגי תאים מבלי לדרוש בחירת סמים או הקרנה נרחבת עבור וירוסים מוטציה.

Introduction

Vaccinia וירוס (vacv) היה אינסטרומנטלי החיסול המוצלח הראשון של פתוגן אנושי, וירוס אבעבועות (varv), מן הטבע. מאז ההשמדה של וירוס אבעבועות, poxviruses כולל vacv המשיכו להיות שימושי וירוסים טיפולית עבור תרופות לבני אדם ובעלי חיים. לדוגמה, חיסון וירוס כלבת מבוסס VACV היה יעיל מאוד במניעת שידור של כלבת sylvatic באירופה¹ ואת ארצות הברית². לאחרונה, רקומביננטי poxviruses ביטוי מגוון של מולקולות נגד הגידול (g., שרשרת יחיד נוגדנים או אריתרופויאטין האדם) ראו לעודד הצלחה כסוכני oncolytic^3,4,5. Vacv הוא אטרקטיבי במיוחד כמו וקטור כי זה קל מאוד מניפולציה גנטית, בעל טווח מארח רחב, והוא יציב תחת מגוון של תנאים, המאפשר הובלה קלה וכדאיות החיסון בשדה^6,7. בעוד טכניקות מרובות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV עבור ניסויים במעבדה הדור חיסון, אסטרטגיות נוכחיות להפקת וירוסים אלה יש מגבלות הבולטים.

בגלל השירות של VACV, אסטרטגיות מרובות כדי ליצור וירוסים רקומביננטי פותחו. האסטרטגיה הראשונה מעסיקה מחדש הומולוגי להציג קלטת כולל את הטרנסגנים ואת גן סמן לבחירה כגון גן עמידות לאנטיביוטיקה. הקלטת מוקף על ידי שני ~ 500 נוקלאוטידים (nt) או זרועות גדולות יותר הנחיית הגן לאתר מסוים בגנום ויראלי, אשר משולבים אז באופן מיוחד על ידי אירועים מוצלב כפול^8,9,10. אסטרטגיה זו היא מהירה ויעילה; עם זאת, זה התוצאה חומר גנטי נוסף בצורה של הגן סמן שעשוי לייצר אפקטים בלתי צפויים. יתר על כן, יש מגבלה עליונה מעשית מספר הטרנסגנים שניתן להציג מוגבל על ידי מספר סמנים ייחודיים לבחירה זמין. אסטרטגיות בחירה שולטת (TDS) זמניות התייחסו לבעיה זו על ידי הקלה על הדור של "להוריד" רקומביננטי וירוסים¹¹. באמצעות אסטרטגיה זו, פלסטלינה המכיל גן VACV מוטציה ו גן סמן לבחירה משולבים הגנום הנגיפי, אך ללא תוספת של ה-DNA VACV האגף. גישה זו מהווה שילוב ארעי של הפלסטיות כולו והשכפול של הגן VACV כתוצאה של שילוב של אירוע מוצלב אחד. ביניים זו יציבה כל עוד היא נשמרת תחת לחץ בחירה, תוך התרת העשרת המבנה. כאשר הבחירה מוסרת, שכפול VACV מאפשר אירוע מוצלב השני שתוצאתו הסרת הפלסמיד והיווצרות הבאים של סוג פראי (wt) או רקומביננטי וירוס ביחס 50:50 משוער. בעוד TDS מייצרת וירוסים רקומביננטי ללא צורך הקדמה יציבה של DNA זר, שיבוטים וירוסים מרובים חייב להיות מוקרן עבור מוטציה צפויה על ידי ניתוח רצף, שלב פוטנציאלי ארוך ויקר.

כאן, אנו מציגים גישה ליצירת רקומביננטי poxviruses המשלב את ההיבטים הטובים ביותר של כל אחת מגישות אלה, בדומה לגישה שתוארה עבור השכפול שונה vaccinia אנקרה^12,13,14. אסטרטגיה זו משלבת טווח חזותי ומארח בחירה כדי ליצור במהירות רקומביננטי וירוסים על-ידי מוצלב אירועים כפולים, ולאחר מכן לחסל את הגן סמן לבחירה על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי. גישה זו מאפשרת את הדור המהיר של מוטציות מתווכת על ידי שילוב הומוולוגי, עם הטבע "ללא צלקות" של גישות TDS, בעוד שאינו דורש צעד ההקרנה הבאים כדי להבחין סוג פראי ווירוסים מוטציה. השיטה שלנו גם משתמשת בבחירת טווח המארח במקום של בחירה אנטיביוטית, ביטול הסיכון של שינויי פנופאיות המושרה כימית בקו התא. עבור גישה זו, בחרנו להשתמש מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) כמו סוכן סלקטיבי כדי ליצור רקומביננטי VACV. PKR מבוטא כמונומר לא פעיל ברוב סוגי התאים¹⁵. באמצעות כריכה כפולה של רנ א (dsRNA) ב-N-terminal dsRNA-מתחם הכריכה, PKR והוא בתצוגה מקדימה של¹⁶. זו צורה פעילה של pkr זרחנית אלפא יחידת המשנה של הגורם החניכה איקריוטית 2 (eIF2), בסופו של דבר עיכוב מסירת מתיונין היוזם-trna ל ריבוחלק, ובכך מניעת תרגום תאיים ומעכב באופן נרחב את השכפול של משפחות וירוסים רבים^17,18.

בתגובה לפעילות האנטי-ויראלית הרחבה והחזקה של PKR, וירוסים רבים התפתחו לפחות אסטרטגיה אחת כדי למנוע הפעלת PKR. רוב poxviruses לבטא שני האנטוניסטים PKR, מקודד על ידי E3L ו K3L גנים ב VACV, אשר מרגיז PKR באמצעות שני מנגנונים נפרדים¹⁹. E3 מונע pkr הומומיזציה על ידי מחייב כפול תקוע RNA^20,21, בעוד K3 משמש מעכבי מדומה במצע על ידי קשירה ישירות pkr מופעל ובכך מעכב אינטראקציה עם המצע שלה eIF2α²². הדבר החשוב ביותר הוא ששני האנטניסטים האלה אינם מעכבים בהכרח את PKR מכל המינים. לדוגמה, הK3 הומולוג מנגיף הטיח מעכבות מאוד את הצאן מכבשים, ואילו הוולוג באמצעות הפלאפון E3 הומולוג לא הראה באופן משמעותי את העיכוב pkr^23,24. במחקר זה, אנו מציגים שיטה להשתמש PKR-תיווך בלחץ סלקטיבי בשילוב עם בחירת הזריחה כדי ליצור רקומביננטי VACV נמחק עבור E3L ו K3L (VC-4), אשר לא יכול לשכפל בתאים המוסמכים PKR נגזר ממינים שונים. וירוס רקומביננטי זה מספק רקע מצוין עבור הדור המהיר של וירוסים רקומביננטי ביטוי גנים תחת שליטה של מקדם E3L מקורי.

Protocol

1. יצירת וקטור שילוב מחדש

1. עיצוב התחל כדי ליצור את קלטת הבחירה. עיצוב כל בודד אמפליקון עם רצפים חופפים עם הגברה השכנה וקטור כדי להקל על הרכבה אנזימטית איזותרמי של מולקולות DNA, נקרא גם האסיפה גיבסון, באמצעות כל אחד מספר כלים באינטרנט פריימר עיצוב.
   הערה: ניתן להשלים פרוטוקול זה גם באמצעות שיטות שכפול המבוססות על הגבלה מסורתית endonuclease. במקרה כזה, עיצוב התחל עם אתרי ההגבלה המתאימים ולא עם רצפים חופפים.
2. באמצעות התחל שתוכנן בשלב 1.1, PCR להגביר את האלמנטים הבאים על מנת 5 ' עד 3 ' (איור 1): ~ 500 נוקלאוטידים של אזור גנומית של vacv 5 ' של E3L (5 ' זרוע), egfp או הגן של עניין, ~ 150 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv מיד 3 ' של E3L (קצר 3 ' זרוע), מוקדם סינתטי/מאוחר מיזם poxvirus²⁵, גן היתוך mcherry-E3L, ו ~ 500 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv 3 ' של E3L כולל קצר 3 ' זרוע (ארוך 3 ' זרוע
   1. בצינור PCR, להוסיף את הריאגנטים בסדר הבא עבור כל amplicon: 17 μL של DNase מים חינם, 1.2 μL של כל פריימר (ריכוז ראשוני = 10 μM, הריכוז הסופי = 0.5 μM), 5 μL של מאגר התגובה של ה-PCR 5x, תבנית DNA (10 ng עבור הגברה המוגברת מ פלמידים: egfp ו-E/L יזם-mCherry-E3L הקלטת; 100 ng עבור הגברה המוגברת של dna גנומית ויראלי: 5 ' ו-3 זרועות), 0.5 כוונן את נפח המים הנוספים עבור נפח התגובה הסופי של 50 μL.
      הערה: הריכוז של ה-DNA תבנית יש לקבוע באופן אמפירי, אבל אנחנו בדרך כלל מתחילים עם 10 ng/התגובה.
   2. מניחים את הצינור (s) בתוך הצנטרזה, ולהמיס את ה-DNA ב 98 ° c עבור 30, ולאחר מכן להשתמש 25 סיבובים של פרוטוקול PCR שלושה צעדים: 98 ° צ' עבור 5 s, 55 ° צ' עבור 10 s, ו 72 ° c עבור 1 דקות.
      הערה: לקבוע את טמפרטורת ההיתוך בהתבסס על היצרן של הציע Tm עבור כל מערכת תחל. קבע את זמן ההרחבה המתאים בהתאם לאורך של כל אמפליקון (1 דקה/kb).
3. המחש את מוצרי הגברה על 1% ג'ל. הוסף 10 μL של כל מוצר DNA ו 2 μL של טעינת מאגר כל טוב, ולרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h.
4. ג'ל לטהר כל אמפליקון באמצעות ערכת החילוץ ג'ל DNA ופרוטוקול של היצרן. Elute הגברה מן העמודה על ידי הוספת 50 μL של DNase מים בחינם ומיד תפרידו.
5. Linearize pUC19 שיבוט וקטור שימוש בעיכול Ecori endonuclease. לצינור, להוסיף 1 μg של pUC19, מים לנפח של 17 μL, 2 L של מאגר התגובה, ו 1 μL (20 יחידות) של Ecori. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.
   1. המחש את מוצרי הגברה על 1% צמח ג'ל לרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h. בלו את הלהקה מן הג, ולטהר את המוצר באמצעות ערכת החילוץ ג'ל ה-DNA כמתואר בשלב 1.4.
6. ליגייט כל הפרט, ג'ל מטוהרים הגברה וקטור ליניאריות באמצעות ערכת ערבוב הורים.
   1. לצינור ה-PCR, להוסיף 0.2 pmol של לינpUC19 ו כל אמפליקון (5 ' זרוע, egfp, קצר 3 ' זרוע, E/L יזם-mcherry-E3L הקלטת, 3 ' זרוע). הוסף DNase מים ללא תשלום לנפח הסופי של 10 μL, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של מיקס בסיס להרכבת DNA. מודטה דגימות ב 50 ° c בשביל 1 h.
7. שינוי כימית המוסמכת E. coli עם 2 μl של המוצר המורכב משלב 1.6 כפי שמתואר בעבר^26,27. צלחת 100 μL של תאים שעברו שינוי בלוחות LB agarose המכילים 100 μg/mL אמפיצילין. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c
8. בחרו מושבות מבודדות והעבירו מושבות בודדות לצינורות המכילים ציר לוריא עם 100 μg/mL אמפיצילין. מודטה את הצינורות לילה ב 37 ° צ' בעת טלטול ב 225 סל ד.
9. לבודד את הפלסטלינה מן התרבות הלילה באמצעות ערכת המיכין פלמיד. בדוק את הריכוז והטוהר של הדנ א באמצעות ספקטרוסקופיה. יחס A260/A280 בין 1.8 ו-2.0 מקובל.
10. הגישו את הפלמידים לרצף של סאנגר כדי לקבוע אם מוצר השכפול הרצוי נכון. אחסן את הדנ א ב-20 ° c.

2. יצירת הווירוס הרקומביננטי

1. להדביק מונאולייר שוטפת של תאים מתאימים עם הווירוס להיות משולב מחדש בריבוי של זיהום של 1.0 (משרד הבית = 1.0) בצלחת 6-היטב. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 1 h. ואז לאכול את המדיום ולהחליף אותו עם DMEM טרי. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   הערה: עבור וירוסים מוכשרים לשכפול כגון וירוס vaccinia חסר K3L²², קו תא כגון קו כליות הארנב האירופי RK13 (atcc #CCL-37) או תואר ראשון-40 מתאים. עם זאת, עבור וירוסים לקוי השכפול, כגון וירוס המתואר בנייר זה חסר גם PKR האנטוניסטים E3L ו K3L, קו תא משלימים המבטא שני גנים אלה טרנס או pkr להפיל או להפיל תאים נדרשים.
2. מעבר לתאים הנגועים עם 500 ng של הווקטור שנוצר ומאומת בשלב 1.10 באמצעות מסחרי הזיהום זמין מסחרית לאחר פרוטוקול של היצרן. מודטה את התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 48 h.
   הערה: אם באמצעות וירוס vaccinia חסרים הן E3L ו K3L, לחץ סלקטיבי PKR-תיווך יהיה לנהוג בחירה של וירוסים משולבים מחדש ולשמור על ביטוי של חלבון היתוך mCherry-E3L בתאים אלה. במידת הצורך, יש לאפשר גם ל-PCR להגביר רק את התוספת לשימוש לצורך העברה במקום את כל הפלפסנה.
3. 48 שעות לאחר זיהום, לקצור את המונאולייר הנגוע. במקרים מסוימים, התאים ניתן לקצור על ידי ליטוף, אבל אם הם עדיין חזק היטב, לקצור אותם עם מגרד התא. להקפיא את התאים שלוש פעמים, ולאחר מכן sonicate lysates עבור 15 s ב 50% משרעת. אחסן את זה ב-80 ° צ' עד מוכן לשימוש.
4. סרילי 10-קיפול לדלל את ליפוסט שנקטפו בשלב 2.3 מ 10-1 עד 10^-6 על ידי הוספת 120 μl של^lysate כדי 1080 ΜL של dmem (10^-1), ולאחר מכן הוספת 120 μl של דילול זה כדי 1080 μl של dmem (10^-2), וחוזר על תהליך זה ארבע פעמים נוספות הוסף 1 מ ל של כל דילול לאדם, היטב שוטפת של קו תא מוסמך PKR, במקרה זה RK13 תאים.
   1. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 1 h. לאחר מכן ומכה את המדיום ולהחליף אותו עם מחדש DMEM התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
5. 24 עד 48 שעות לאחר זיהום, לזהות וירוסים רקומביננטי על ידי המיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלטי רקומביננטי וירוסים לבטא פלואורסצנטית אדום בשל אינטגרציה של mCherry-E3L גן היתוך (איור 2). אם וירוס נטול מעכבי PKR נעשה שימוש בתחילה, כל הפלאק יכיל וירוס רקומביננטי.
6. פלאק לטהר רקומביננטי וירוסים שלוש פעמים על RK13 תאים. לאחר הסיבוב האחרון של טיהור פלאק, כל הפלאק צריך לבטא את הזריחה האדומה.
7. הדביקו את הצלחת 6-באר של תאים RK13 לבטא את מעכבי pkr E3L ו K3L (RK13 + E3L + K3L תאים²⁸) עם מטוהרים מטוהר אדום רואה וירוס משלב 2.6. המטרה עבור כ 50-100 שלטים לכל טוב.
   הערה: תאים אלה מספקים את היריבים VACV PKR בטרנס ולהקל על הלחץ הסלקטיבי PKR-תיווך כדי לשמור על גן היתוך mCherry-E3L, ובכך לקדם את "להוריד" הדור של הנגיף רקומביננטי.
8. זיהוי וירוסים מכווצים על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ EVOS2, וקוביית מסנן GFP (עירור: 470/22, פליטה: 525/50) ו קוביית מסנן RFP (עירור: 531/40, פליטה: 593/40).
   הערה: התדירות שבה הגן היתוך mCherry-E3L לאיבוד הוא כ 2.5% (טבלה 2). אם EGFP אינו כלול כמו גן סמן, לוחיות של וירוסים מוטציה כי איבדו את גן ההיתוך mCherry-E3L יהיה חסר צבע.
9. פלאק לטהר ירוק בלבד (VC-4) או לוחיות צבע (E3L) שלוש פעמים על RK13 + E3L + K3L תאים. ודא שאין לוחיות שלטים אדומות.
10. אשר את ההפסד של מE3L ונוכחותו של המוטציה הצפויה על ידי הרצף PCR ו-Sanger.
    הערה: אם הגן או מוטציה של עניין אין פעילות מעכבות PKR, רקומביננטי וירוסים יש לגדל על RK13 + E3L + K3L תאים או שווה ערך PKR-עכבות או קו תא לקוי PKR (איור 3).

Results

השתמשנו בתרשים ההליך באיור 1 כדי ליצור vacv חסרים גם pkr האנטוניסטים E3L ו K3L, על ידי החלפת E3L עם egfp בווירוס נמחק כבר עבור K3L (vP872). איור 2 מראה שלטי פלורסנט אדום ב-pkr תאים RK13 המוסמכים מעיד על ביטוי נגיפי של mcherry-E3L, כמו גם egfp הביע בRK13 + E3L + K3L תאים המאשרים אובדן של E3L והתמוטטות של סמן הבחירה mcherry-E3L. איור 3 מאשרת כי זה וירוס רקומביננטי, VC-4, חסר שני היריבים pkr לא יכול לשכפל בתאי RK13 המוסמכת pkr, בעוד וי...

Discussion

כאן אנו מציגים וריאציה של אסטרטגיה בחירת סמן ארעי ³² כדי ליצור וירוסים רקומביננטי vaccinia ללא שמירה על DNA זר בווירוס רקומביננטי הסופי. האסטרטגיה שלנו עושה שימוש בלחץ סלקטיבי בתיווך על ידי המארחים אנטי חלבון PKR ולא צורות אחרות של לחץ סלקטיבי כגון אנטיביוטיקה. השימוש של גנים ויראליים מארחים מבטלת את האפשרות של שינויים המושרה באמצעות כימית בתאים, או סיכון מוגבר של מוטציה בשל תרופות בחירה. יתר על כן, בניגוד לבחירת סמים, אין שלב השהיה עבור הגישה שלנו, כי PKR מתבטא באופן מכונן בכל התאים. מבחר חזותי מ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	פולימראז בנאמנות גבוהה המשמש ב-PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	חומר סלקטיבי חיידקי
מגרדי תאים חד פעמיים	ThermoFisher Scientific	08-100-242	מגרד תאים לקצירת תאים נגועים
EVOS FL Auto 2 מערכת הדמיה תאים	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	מיקרוסקופ פלואורסצנטי
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	מגיב טרנספקציה
Luria Bertani (LB) מרק	Gibco	10855021	מדיום גידול חיידקים
ערכת	מיצוי ג'ל DNA Monarchערכת	T1020L	המשמשת לטיהור אמפליקונים ווקטורים ליניאריים
ערכת Monarch Plasmid Miniprep ערכת	NEB	T1010L	Miniprep המיועדת לטיהור פלסמידים
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	המשמש למדידת ריכוז RNA ו-DNA
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	ערכת הרכבה אנזימטית איזותרמית המשמשת ליצירת וקטור הרקומבינציה
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator לליזטים של וירוסים
תאי RK13	ATCC	CCL-37	תאי כליה של ארנב
VWR צלחות תרבית תאים Multiwell	VWR	10062-892	צלחות תרבית תאים