הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

4 במאי 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

במאמר זה

סיכום

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

תקציר

ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) היא שיטה רבת עוצמה לאפיון ביופיזי של שינויים קונפורמיים של אנזימים ואינטראקציות בין מצע אנזימים. בין היתרונות הרבים שלה, HDX-MS צורכת רק כמויות קטנות של חומר, יכול להתבצע בתנאים מקומיים קרובים ללא צורך תיוג אנזים / מצע, והוא יכול לספק מידע נפתרה spatially על דינמיקה קונפורמציה אנזים-אפילו עבור אנזימים גדולים קומפלקסים multiprotein. השיטה היא ביוזמת דילול של האנזים של עניין לתוך חוצץ מוכן D2O. זה מפעיל את חילופי פרוטיום ב אמיד אג"ח פפטיד (N-H) עם דיטריום (N-D). בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, אליקוטים תגובה מרווה, האנזים הוא proteolyzed לתוך פפטידים, פפטידים מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC), ואת השינוי במסה של כל פפטיד (עקב חילופי מימן עבור דיטריום) נרשם על ידי טרשת נפוצה. כמות ספיגת הדיאוטריום על ידי כל פפטיד תלויה מאוד בסביבת מליטה מימן המקומית של פפטיד זה. פפטידים נוכחים באזורים דינמיים מאוד של דיטריום חילופי אנזימים במהירות רבה, ואילו פפטידים שמקורם באזורים מסודרים היטב עוברים חילופים הרבה יותר לאט. באופן זה, שיעור HDX מדווח על דינמיקה קונפורמציה אנזים מקומי. לאחר מכן ניתן להשתמש בהפרעות לרמות ספיגת הדיטריום בנוכחות ליגנדים שונים כדי למפות אתרי קשירה ליגנד, לזהות רשתות allosteric, ולהבין את התפקיד של דינמיקה קונפורמית בתפקוד האנזים. כאן, אנו ממחישים כיצד השתמשנו ב- HDX-MS כדי להבין טוב יותר את הביוסינתזה של סוג של מוצרים טבעיים פפטיד הנקרא lanthipeptides. Lanthipeptides הם פפטידים מקודדים גנטית כי הם לאחר תרגום שונה על ידי אנזימים גדולים, רב תכליתיים, דינמי קונפורמי שקשה ללמוד עם גישות ביולוגיה מבנית מסורתית. HDX-MS מספק פלטפורמה אידיאלית ומותאמת לבדיקת התכונות המכניסטיות של אנזימים מסוג זה.

מבוא

חלבונים הם מולקולות דינמיות מבחינה מבנית המדגמות קונפורמציות שונות על סולמות זמן החל רטט קשר בקנה מידה femtosecond כדי סידור מחדש של תחומי חלבון שלמים אשר יכול להתרחש על פני שניות רבות1. תנודות קונפורמיות אלה הן לעתים קרובות היבטים קריטיים של תפקוד האנזים/חלבון. לדוגמה, שינויים קונפורמיים הנגרמים על ידי קשירה ליגנד הם לעתים קרובות חשובים ביותר עבור מידול תפקוד האנזים, או על ידי ארגון שאריות אתר פעיל הדרושות לקטליזה, הגדרת אתרי איגוד מצע במנגנונים קינטיים רציפים, הגנה על ביניים תגובתיים מהסביבה, או על ידי היפוך פונקציית האנזים באמצעות רשתות allosteric. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתן לשמר דינמיקה קונפורמטיבית לאורך האבולוציה וכי הפרעה לתנועות מולקולריות שמורות יכולה להיות מתואמת עם שינויים בספציפיות המצע והופעתם של פונקציות אנזים חדשות2,3.

בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) התפתחה במהירות כטכניקה רבת עוצמה כדי לחקור כיצד נופים קונפורמיים של חלבונים מגיבים להפרעות כגון קשירה ליגנד או mutagenesis4,5,6,7. בניסוי HDX-MS טיפוסי (איור 1), חלבון בעל עניין מוכנן למאגר שהוכן ב- D2O, אשר מפעיל החלפת פרוטונים הניתנים להחלפה בממס עם דוטריה. שער החליפין של ה- amide moiety של איגרות החוב פפטיד תלוי מאוד ב- pH, ברצף חומצות האמינו המקומיות ובסביבה המבנית המקומית של אמיד8. בין אלה העוסקים אינטראקציות מליטה מימן (כגון אלה הנוכחים α-helices ו β-sheets) להחליף לאט יותר מאשר בין באזורים לא מובנים של החלבון החשופים ממס בתפזורת. לכן, היקף ספיגת דיטריום הוא השתקפות של המבנה של האנזים. אנזימים דינמיים קונפורמיים, או העוברים מעברים מבניים על קשירה ליגנד, צפויים להניב תגובת HDX מדידה.

הבסיס המכניסטי לשער החליפין האיטי של אמיד מובנה מוצג באיור 25,8,9. על מנת לעבור HDX, האזור המובנה חייב תחילה לטעום באופן ארעי קונפורמציה נפרשת, כך מולקולות ממס לזרז חילופי HDX באמצעות חומצה ספציפית / מנגנון כימי בסיס, יש גישה אמיד להחלפה. בסופו של דבר, סדרי הגודל היחסיים של שער החליפין הכימי (kchem) ושיעורי הקיפול והקיפול מחדש (kopen ו- kclose) קובעים את שער ה- HDX הנמדד בניסוי5,8. ממודל קינטי פשוט זה, ברור כי היקף ספיגת הדיטריום ישקף את הדינמיקה הקונפורמציונית הבסיסית (כהגדרתה על ידי kopen ו- kclose). רוב הניסויים HDX-MS מבוצעים בזרימת עבודה מלמטה למעלה שבו, בעקבות תגובת ההחלפה, החלבון של עניין מתעכל לתוך פפטידים ואת ספיגת דיטריום על ידי כל פפטיד נמדד כמו עלייה במסה7. בדרך זו, HDX-MS מאפשר הפרעה דינמיקה קונפורמציה אנזים להיות ממופה בסולם המרחבי המקומי של פפטידים, המאפשר לחוקר להעריך כיצד הפרעה משנה את הדינמיקה באזורים שונים של האנזים של עניין.

היתרונות של גישת HDX-MS להבהרת הדינמיקה המבנית של החלבון הם רבים. ראשית, השיטה יכולה להתבצע עם כמויות קטנות של חלבון מקומי או על קומפלקסים חלבון במערכות עם מבנה quaternary10. זה אפילו לא הכרחי עבור הכנת האנזים המשמש ב assay להיות מטוהרים מאוד11,12, כל עוד זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה מספק מספר מספיק של פפטידים מזוהים בביטחון המכסים את רצף החלבון של עניין. יתר על כן, HDX-MS יכול לספק מידע על דינמיקה קונפורמטיבית בתנאים כמעט מקומיים ללא צורך בתיוג חלבון ספציפי לאתר כפי שהיה משמש במחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת13, ואין מגבלת גודל למתחם החלבון או החלבון שניתן לחקור (מה שהופך גישות כגון תהודה מגנטית גרעינית [NMR] ספקטרוסקופיה מאתגרת)7,14. לבסוף, ניתן להציע שיטות HDX-MS שנפתרו בזמן כדי ללמוד חלבונים עם הפרעות מהותיות, שקשה ללמוד עם קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן15,16,17,18. המגבלה העיקרית של HDX-MS היא שהנתונים הם ברזולוציה מבנית נמוכה. נתוני HDX-MS שימושיים לצביעה על המקום שבו הדינמיקה הקונפורמית משתנה ולחשוף שינויים קונפורמיים מצמדים, אך לעתים קרובות הם אינם מספקים תובנה רבה לגבי המנגנון המולקולרי המדויק המניע את השינוי שנצפה. ההתקדמות האחרונה בשילוב של שיטות דיסוציאציה לכידת אלקטרונים עם נתוני HDX-MS חלבון הראו הבטחה למיפוי אתרי חילופי שאריות חומצת אמינו יחיד19, אבל מעקב אחר מחקרים ביוכימיים ומבניים עדיין נדרשים לעתים קרובות כדי לספק בהירות מודלים מבניים שהועברו על ידי נתוני HDX-MS.

להלן, פרוטוקול מפורט לפיתוח של HDX-MS assay מוצג20. פרוטוקולי ההכנה לדוגמה המוצגים להלן צריכים להיות רלוונטיים בדרך כלל לכל חלבון המציג מסיסות טובה במאגרים מימיים. שיטות הכנה מדגם מיוחדות יותר ותהליכי עבודה HDX-MS זמינים עבור חלבונים מאשר צריך להיות assayed בנוכחות חומר ניקוי או פוספוליפידים21,22,23,24. הגדרות אינסטרומנטליות לאיסוף נתונים HDX-MS מתוארות עבור ספקטרומטר מסה מרובע ברזולוציה גבוהה בשילוב למערכת כרומטוגרפיה נוזלית. נתונים של מורכבות ורזולוציה דומים ניתן לאסוף על כל אחד ממספר מערכות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית זמינה מסחרית (LC-MS). היבטים מרכזיים של עיבוד הנתונים באמצעות חבילת תוכנה זמינה מסחרית מסופקים גם כן. כמו כן, אנו מציגים קווים מנחים לאיסוף וניתוח נתונים התואמים להמלצות של קהילת HDX-MS הרחבה יותר12. הפרוטוקול המתואר משמש לחקר המאפיינים המבניים הדינמיים של HalM2, סינתטאז lanthipeptide המזרז את התבגרות רב-שלבי של מוצר טבעי פפטיד מיקרוביאלית20. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ב- HDX-MS כדי לחשוף אתרי איגוד מצע ומאפיינים אלוסטריים שחמקו מאפיון קודם. מספר פרוטוקולים אחרים על חלבון HDX-MS פורסמו בשנים האחרונות25,26. יחד עם העבודה הנוכחית, תרומות קודמות אלה אמורות לספק לקורא גמישות מסוימת בעיצוב ניסיוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים מנווטים ופתרונות מלאי אנזימים

  1. הכן ריאגנטים הדרושים לתגובות HDX (כולל כל מאגרים, מלחים, מצעים, ליגנדים וכו ') כפתרונות מלאי מרוכזים 100-200x ב- D2O (99.9% שבר אטום D). הכן לפחות 50 מ"ל של פתרון מלאי מאגר.
    הערה: לאפיון HalM2, הפתרונות הבאים הוכנו: 500 mM MgCl2, 100 מ"מ טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין (TCEP), 750 מ"מ ATP (במאגר HEPES), 800 מ"מ HEPES pD 7.1, 500 מיקרומטר HalA2 ו 500 mM AMPPNP.
  2. להקפיא ולליופיליז את פתרונות המלאי ליובש.
  3. להתמוסס מחדש ב D2O, ולחזור על מחזור lyophilization לפחות פעם אחת נוספת להחליף כמה שיותר פרוטונים להחלפה עם deuterons ככל האפשר.
  4. התאם את ה- pD של מלאי מאגר HEPES המנוון לערך הרצוי עם NaOD/DCl מרוכז, תוך התחשבות בקשר הגומלין הבא27:
    figure-protocol-1
    הערה: קצב ה-HDX של amide תלוי מאוד ב- pL של הפתרון (pL = pH או pD)5. קבוצות שונות של פתרונות מלאי מאגר צריך להיות מוכן, מאוחסן, ולהשתמש באופן זהה כדי למנוע סחף pL קל בין ניסויים.
  5. לחשב את הכמות של כל מגיב הדרוש עבור 300 μL HDX assay ולאחסן כמו aliquots לשימוש יחיד ב -80 °C (70 °F).
  6. הכינו תמיסת מלאי אנזימים מרוכזת (כ-100-200 מיקרומטר) במאגר אחסון אנזימים פרות באמצעות מסנן צנטריפוגלי(טבלת חומרים)או מכשיר שווה ערך.
    הערה: המאגר המדויק וחיתוך המשקל המולקולרי של המסנן הצנטריפוגלי יהיו תלויים בחלבון/אנזים המעניין. HalM2 מאוחסן 50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCl, ו 10% גליצרול. 10 מסנני kDa שימשו להכנת האנזים המרוכז.
  7. אליעזר את האנזים לחלקים חד פעמיים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: זו יכולה להיות נקודת עצירה. ניתן להכין את כל פתרונות המלאי המתוארים בסעיף 1 לקראת תגובות ה-HDX. אם מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס, רוב האנזימים / פתרונות מלאי מנואים יהיו יציבים במשך חודשים רבים.

2. כיול עוצמת מרווה HDX

  1. הכינו תגובת HDX של 300 μLב-D 2O בעזרת ריאגנטים מרוטשים ומניות אנזימים מרוכזות שהוכנו בסעיף 1.
    1. השתמש בריכוז אנזים סופי של 1-5 מיקרומטר.
    2. השתמש בריכוז מאגר HEPES אחרון של 50-100 מ"מ לפחות.
    3. ודא את הריכוזים של רכיבים אחרים מספיקים כדי לשמור על פעילות /פונקציה האנזים הרצוי.
  2. הכן 1 L של פתרון מרווה HDX (100 מ"מ פוספט, 0.8 M guanidine-HCl, pH 1.9). להקפיא ולאחסן הן מנות 50 מ"ל (עבור מלאי לטווח ארוך) ו 1 מנות מ"ל (עבור aliquots לשימוש יחיד).
    הערה: ההרכב המדויק של מאגר הרווה יהיה תלוי באנזים המשמש בשלב הפרוטאוליזה של זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה (שלב 3.3.3). מאגר הרווה שניתן כאן תואם לפפסין, הפרוטאז הנפוץ ביותר עבור HDX-MS. אם נעשה שימוש בפרוטאז אחר, בדוק עם ספק הפרוטאז כדי להבטיח תאימות מאגר.
  3. כייל את עוצמת הקול של מאגר הרוויה הדרוש כדי להתאים את ה- pL הסופי של תערובת תגובת HDX מרווה לערך קריאה של מד pH של 2.3.
    הערה: שער החליפין של פפטיד אמיד N-H הוא תהליך תלוי pH הכפוף הן לחומצה והן לקטליזה בסיסית. שער החליפין המינימלי מופיע בערך של pH 2.5 (קריאת מד pH = 2.3 עבור תערובת 50:50 H2O:D2O). לכן, ערך pL הסופי ליד 2.5 יהיה למזער חילופי מימן בחזרה המתרחשת במהלך ניתוח LC-MS מלמטה למעלה, ובכך לשמר את תווית דיטריום בפפטידים.
    1. מערבבים 50 μL של תערובת תגובת HDX משלב 2.1 עם 50 μL של חיץ מרווה ולמדוד את ה- pL של התערובת מרווה עם אלקטרודה microtip.
    2. הגדל את עוצמת הפתרון להרוות לפי הצורך כדי להתאים את קריאת מד ה- pH הסופית לערך של 2.3.
    3. לאחר קביעת עוצמת הריוות המתאימה, חזור על תהליך ההתרוממה מספר פעמים באמצעות ציטוטים טריים של 50 μL מתגובת HDX (שלב 2.1) כדי להבטיח ש- pL סופי עקבי יושג עם תוספת של כמות קבועה של מאגר מרווה.

3. הכנת דגימות ייחוס ואופטימיזציה של זרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה

  1. הכינו דגימות ייחוס לא מאויטות לחלבון המעניין בטריפלאט בצינורות של 0.5 מ"ל. ודא שתנאי תערובת התגובה הסופיים זהים לאלה המשמשים בתגובות HDX אותנטיות (שלב 2.1), אלא שהתגובות מוכנות ב- H2O באמצעות פתרונות מלאי ריאגנטיים שהוכנו גם ב- H2O.
  2. מרווה את הדגימות כמו בשלב 2.3 על-ידי הוספת עוצמת הקול המתאימה של מאגר quench כדי להתאים את ה- pH הסופי ל- 2.5. פלאש להקפיא את הדגימות חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד מוכן לניתוח.
  3. נתח את דגימות ההפניה לאנזימים המתוחים באמצעות זרימת עבודה של LC-MS מלמטה למעלה.
    הערה: לפני ביצוע שלבים אלה, יש לכייל כראוי את מערכת LC-MS המשמשת לרכישת נתונים ולהיות מוכנה לשימוש. התזמון והטמפרטורה של כל השלבים בזרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה חייבים להיות נשלטים בקפדנות על מנת למזער את ההבדלים בחילופי הדברים בין הדגימות. עם מכשור MS המשמש בפרוטוקול זה (טבלת חומרים ו מידע תומך), ניתן לשלוט ברוב השלבים באמצעות תוכנת המכשיר. כדי להבטיח איסוף של משכפלים מדויקים, מומלץ להפוך כמה שיותר שלבים בזרימת העבודה לאוטומטיים.
    1. הסר דגימת ייחוס אנזים בודד (מוכן כמו בשלב 3.2) מהמקפיא ולהפשיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות באמבט מים.
    2. בדיוק 2 דקות לאחר הסרת המדגם מהמקפיא והפשרה, להזריק חלק 40 μL של מדגם התייחסות מרווה לתוך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC) עמודה (2.1 x 30 מ"מ, 300 Å, 5 μM) המכיל שלב נייח פונקציונלי עם פפסין (פרוטאז חומצה יציבה).
    3. לעכל את המדגם בקצב זרימה של 100 μL / min במשך 3 דקות ב 15 מעלות צלזיוס באמצעות 0.1% חומצה פורמית ב H2O (pH = 2.5) כמו הממס.
    4. לאסוף את פפטידים פפטי כפי שהם לברוח מעמוד פפסין על עמוד מלכודת C18 שנערך ב 0.4 °C (69 °F) כדי למזער את ההחלפה בחזרה.
    5. מעבירים את הפפטידים הפפטיים המותפלים מעמודת המלכודת לעמודה אנליטית C18 (1 מ"מ x 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, 130 Å) מוחזקים ומופעלים ב-0.4 מעלות צלזיוס להפרדת הפפטידים הפפטיים.
      הערה: מערכות LC-MS מסוימות המשמשות לרכישת נתונים מסוג HDX-MS יכולות להפוך לאוטומטיות בשלבים 3.3.3-3.5. לחלופין, צעדים אלה יכולים להתבצע באופן עצמאי, תוך התחשבות כי התזמון והטמפרטורה של כל צעד צריך להיות נשלט בקפידה כדי להשיג חילופי גב נמוך באופן עקבי.
    6. Elute עמודת C18 עם אצטוניטריל / מים / 0.1% מערכת ממס חומצה פורמית. מטב את שיפוע ה-LC לחלבון המעניין על מנת למקסם את ההפרדה ולשמור על תווית ה deuterium בפפטידים הפפטיים.
      הערה: פרטי ההדרגה של מעבר הצבע מסופקים במידע התומך.
    7. הכפיף את התקציר הפפטי לספקטרומטריית מסה אלקטרוספרית (ESI).
      הערה: תנאי המקור המסופקים במידע התומך יספקו יינון מספיק עבור רוב הפפטידים הפפטיים.
      1. לאחר מיוננת במכשיר MS, לבצע הפרדת ניידות יון שלב גז באמצעות חנקן כמו גז חיץ כדי לשפר את קיבולת השיא של השיטה.
      2. בעקבות הפרדת ניידות היונים, הכפיף את יוני פפטיד מבשר פפטיד לזרימת עבודה MSE מעורבים מחזורים לסירוגין של אנרגיית התנגשות נמוכה (4 V) ואנרגיית התנגשות גבוהה (21-40 V).
        הערה: משטרי האנרגיה של התנגשות נמוכה וגבוהה לסירוגין מאפשרים איסוף של נתוני MS (אנרגיית התנגשות נמוכה) בו-זמנית עם נתוני MSMS (אנרגיית התנגשות גבוהה). זה, בתורו, מאפשר את מתאם הזמן של יונים מבשר עם יונים שבר בהתאמה שלהם. מתאם זה חיוני לזיהוי פפטיד בטוח המתואר בסעיף 4.
      3. לזהות את מבשר פפטיד יונים שבר באמצעות מנתח המוני עם כוח פתרון של לפחות 20,000.
      4. במקביל לרכישת הנתונים, רכוש נתוני MS עבור תקן חיצוני [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        הערה: זרימת העבודה של MS המתוארת בשלב 3.3.7 נקראת פרוטוקול MSE. הגדרות אינסטרומנטליות מלאות עבור פרוטוקול MSE המתאים ל- HDX-MS מלמטה למעלה מסופקות במידע התומך.
    8. הערך את איכות נתוני LC-MS.
      הערה: באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל ואת ההגדרות האינסטרומנטליות המסופקות מידע תומך, דגימות הפניה צריך לייצר כרומטוגרמה יון הכולל עם עוצמת אות מקסימלית של כ 1 x 108. צריך להיות הרבה פפטידים פפטיים שמציקים בין 3-9 דקות(איור 3A-C).
    9. להזריק 40 μL של דגימות ריקות (0.1% חומצה פורמית במים) כדי לנקות את הפפסין ועמודי C18 אנליטיים.
      הערה: באופן כללי, 2-3 ריקים צריכים להספיק.
    10. חזור על שלבים 3.3.1-3.3.9 עבור כל אחת מדגימות חלבון הייחוס המשולשות.

4. עיבוד נתוני הייחוס והגדרת רשימת פפטיד

  1. נתח את נתוני MSE הגולמיים (שלב 3.3.7) באמצעות תוכנת פרוטאומיקה(טבלת חומרים). באמצעות תוכנת הפרוטאומיקס, נווט אל ספריות | Databanks רצף חלבון להגדיר את מסד הנתונים של החלבון על ידי ייבוא רצף חומצות אמינו של החלבון של עניין.
    הערה: מטרת שלב זה היא לחפש את נתוני MS הייחוס עבור פפטידים פפטיים הנגזרים מהחלבון המעניין, ולהשתמש בנתוני MSMS (שנרכשו בו זמנית עם נתוני MS) כדי לאמת כל זיהוי פפטיד פואטי.
  2. תן שם לרצף החלבונים של עניין. יבא את רצף החלבונים (בפורמט FASTA). התוכנה תבצע עיכול silico של חלבון מסד הנתונים כדי ליצור רשימה של פפטידים שישמשו לחיפוש בנתוני LC-MS.
  3. הגדר את פרמטרי העיבוד (הממוקמים תחת תפריט ספריה). בחר אלקטרוספריי MSE כסוג רכישת הנתונים. בשדה נעל מסה עבור טעינה 2, הזן 785.8426 עבור m/z עבור 2+ יון של [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) ולחץ על סיום.
  4. הגדרת הפרמטרים של זרימת עבודה (הממוקמים תחת תפריט ספריה).
    1. בחר אלקטרוספריי MSE עבור סוג החיפוש. תחת | זרימת עבודה כותרת שאילתת חיפוש מסד נתונים, בחר את חלבון מסד הנתונים שנוצר בשלב 4.2 בשדה Databank.
    2. שנה מגיב תקציר ראשי ללא ספציפי, ונקה את השדה Reagent משנה קבוע על ידי החזקת לחצן Ctrl בעת לחיצה על Carbamidomethyl C.
  5. ציין את ספריית הפלט על-ידי ניווט לאפשרויות | | הגדרת אוטומציה זהות E. סמן את התיבות עבור Apex 3D ו- Peptide פלט תלת-ממדי ופלט חשבונאות יון וציין את הספריה הרצויה.
  6. עבד את הנתונים לדוגמה של ההפניה.
    1. בסרגל הכלים השמאלי של סביבת העבודה של פלטפורמת proteomics, ליצור צלחת חדשה על ידי לחיצה ימנית על צלחת Microtiter. הדגש שלוש בארות בצלחת המיקרוטיטר (אחת עבור כל דגימת התייחסות שנאספה בסעיף 3). לחץ שמאלה בבאר אחת, החזק וגרור לשלוש בארות.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הוסף נתונים גולמיים. בחלון שמופיע, נווט אל הספריה המכילה את שלושת קבצי ההפניה ממקטע 3 ובחר אותם בו-זמנית.
    3. לחץ על הבא ובחר את פרמטרי העיבוד המוגדרים בשלב 4.3. לחץ על הבא ובחר את הפרמטרים של זרימת העבודה המוגדרים בשלב 4.4. לאחר מכן לחץ על סיום.
  7. לאחר שהנתונים הגולמיים, פרמטרי העיבוד ופרמטרים של זרימת העבודה הוקצו לכל באר בצלחת, הבארות ייראו כחולות. בחר את הבארות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר תהליך הנתונים הגולמיים העדכניים ביותר. לחץ על הפינה הימנית התחתונה של החלון כדי לעקוב אחר עיבוד הנתונים. לאחר שההודעה לא מופיעה משימה להפעלה, העיבוד מתבצע במלואו.
  8. לאחר עיבוד הנתונים הושלם, בארות בצלחת יהפוך ירוק. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על בארות ובחר הצג תוצאות זרימת עבודה. ייפתח חלון נפרד עבור כל קובץ נתוני הפניה.
  9. בדוק את הנתונים כדי לוודא שרוב אותות MS בנתוני מדגם הייחוס מופו בהצלחה לפפטידים החזויים מעיכול in-silico של החלבון המעניין. פפטידים תואמים יצבעו בכחול בספקטרום הפלט (איור 4). לחץ פעמיים על המסנן אישור ולבדוק כי כיסוי אחוז גדול מ 99%.
    הערה: בעת העיבוד, פלט הנתונים יישמר באופן אוטומטי עם סיומת הקובץ (raw_data_file_name_IA_final_peptide) בספריה שצוינה בשלב 4.5.
  10. יבא את פלט התוכנה proteomics לתוכנת עיבוד HDX (טבלה של חומרים) עבור סף נוסף.
    1. לחץ על נתונים בפינה השמאלית של חלון התוכנה לעיבוד HDX. לחץ על ייבוא תוצאות PLGS ולחץ על סמל הוסף. בחר את קבצי הנתונים המעובדים משלב 4.9 על-ידי ניווט לספריה המתאימה.
    2. לחץ על הבא וציין את הפרמטרים הבאים: יונים רצופים מינימליים ≥ 2, שגיאת מסה = 5 עמודים לדקה, וסף קובץ = 3. לחץ על סיום.
  11. לאחר מרוצה הפרמטרים thresholding, לשמור את הפרויקט HDX. כל נתוני HDX ייובאו לתוך פרוייקט זה לצורך ניתוח ותצוגה.
    הערה: יהיה צורך לעבד את הדגימות שהוחלפו ב- deuterium המתוארות בסעיף הבא עם זרימת עבודה זהה של LC-MS. לכן, לפני שתמשיך עם מבחני HDX (סעיף 5), ודא שהכנת הדגימה (סעיף 2), זרימת העבודה של LC-MS מלמטה למעלה (סעיף 3) ותהליכי עבודה לעיבוד נתונים (סעיף 4) מספקים את השחזור הרצוי ואת כיסוי הרצף של חלבון היעד. אם יש צורך לשנות אחד מתהליכים אלה כדי לשפר את הכיסוי, מומלץ לחזור לשלב 2.1, להכין דגימות ייחוס טריות בשליש ולחזור על סעיפים 2-4 (תוך ביצוע ההתאמות הדרושות לפרוטוקול) כדי להבטיח שניתן יהיה ליצור ולזהות כל פפטיד.

5. ביצוע תגובות HDX

  1. הכן סביבת עבודה לתגובות HDX.
    1. חיץ מרווה טרום אליקוט לצינורות 0.5 מ"ל מסומנים כראוי. הכינו צינור שונה לכל נקודת זמן, לכל שכפול ולכל מצב ביוכימי שיש לנתח. השתמש בנפח המתאים של חיץ מרווה משלב 2.2 הדרוש כדי להתאים את קריאת מד ה- pH הסופית של חלק של 50 μL מתגובת HDX לערך של 2.3.
    2. בקצרה צנטריפוגה אמבטיות 0.5 מ"ל להעביר את כל חיץ להרוות לתחתית הצינור. מניחים את הצינורות על קרח.
    3. ממלאים דיואר קטן בחנקן נוזלי ושומרים צמוד לסביבת העבודה.
  2. הכינו את תגובות ה-HDX. ודא כי יש נפח תגובה מספיק כדי לאסוף את המספר הרצוי של נקודות זמן ההחלפה (אחד 50 μL aliquot עבור כל נקודת זמן רצויה). לאסוף לפחות 4-5 נקודות זמן על פני 3-4 סדרי גודל בסולם הזמן (למשל, להרוות פעמים של 15 s, 60 s, 300 s [5 דקות], 1,800 s [30 דקות], ו 14,400 s [4 h] לספק כיסוי הולם של דינמיקת החליפין עבור רוב האנזימים).
    1. יש לערבב מראש את כל הרכיבים המרוטים (מינוס אנזים) משלב 1.1ב-D 2O.
    2. עבור כל מצב ביוכימי להיבדק (אנזים חינם, אנזים + ligand, אנזים + מעכב, וכו '), להכין תגובות HDX לפחות משולש.
    3. דגירה תערובות התגובה באמבט מים מבוקר טמפרטורה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני תוספת של האנזים.
      הערה: האנזים צריך להיות מוכן כפתרון מלאי מרוכז (~ 100-200 מיקרומטר, שלב 1.6) כדי למזער את התוספת של פרוטיום לתוך HDX assay.
    4. לאחר הוספת האנזים לריכוז סופי של 1-5 מיקרומטר, התחל את שעון העצר. בזהירות ובמהירות לערבב את הפתרון באמצעות פיפטה 200 μL כדי להבטיח כי האנזים מופץ באופן שווה במדגם.
    5. בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, להסיר 50 μL aliquots מתגובת HDX ומערבבים במהירות ובאופן שווה עם חיץ מרווה קר כקרח מראש בצינור 0.5 מ"ל.
      הערה: נפחי הערבוב והליך הערבוב חייבים להיות מדויקים וניתן לשחזור ככל האפשר כדי להבטיח שה- pL של מרווה סופית רצויה של 2.3 מושגת במהירות בכל הדגימות. שמירה על קרח חיץ מרווה קר יעזור למזער את ההחלפה בחזרה על denaturation של אנזים.
    6. מיד לאחר מרווה את מדגם HDX, כובע הצינור פלאש להקפיא חנקן נוזלי.
    7. המשך לאסוף נקודות זמן עד להשלמת כל מבחני ההכנה ולאחר מכן העבר דגימות למקפיא -80 °C (60 °F) לאחסון.
      הערה: זו יכולה להיות נקודת עצירה. לאחר איסוף כל נקודות הזמן HDX, ניתן לאחסן את הדגימות ב -80 °C (70 °F) עד מוכן לניתוח LC-MS. באופן אידיאלי, תגובות HDX משולש צריך להתבצע עבור כל מצבי עניין ביוכימיים באותו יום. לכל הפחות, כל תגובות HDX לשכפל עבור מצב ביוכימי נתון צריך להיות לרוץ במקביל באותו יום.
  3. לאחר איסוף כל נקודות הזמן של HDX מרווה, לחשוף את הדגימות לזרימת העבודה LC-MS ממוטבת מלמטה למעלה שפותחה כמתואר בשלב 3.3. הזרק דגימות HDX בסדר אקראי עם מספר מתאים של ריקים בין דגימות כדי להבטיח כי כל פפטיד לשאת מעל הוא מינימלי.
    הערה: אין צורך לאסוף נתוני HDX במצב MSE. לפיכך, יש להסיר את מקטע האנרגיה של התנגשות גבוהה (שלב 3.3.7.2) ממחזור החובה של MS. זה צריך להיות השינוי היחיד שנעשה בזרימת העבודה המתוארת בשלב 3.3.
  4. להעריך את האיכות של נתוני HDX כפי שהוא נאסף.
    1. ודאו שהפסגות הכרומטוגרפיות הקיימות בכרומטוגרמה הכוללת של היונים של דגימות הייחוס הבלתי מוגדרות יופיעו באותו זמן שמירה בדגימות המרוטשות (כמו באיור 3D-F).
    2. ודא שספקטרום מסה שסוכם על פני מרווחי זמן ספציפיים מהפניות ודגימות מנוטרלות מראה ראיות לניתוק (כלומר, הסטה במעטפה האיזוטופית של פפטידים בודדים לערכי m/z גבוהים יותר בדגימות המנוטרלות [איור 6]).

6. עיבוד נתוני HDX

  1. יבא את נתוני HDX לפרויקט HDX שנוצר בשלב 4.11 על ידי לחיצה על נתונים | קבצי MS בסרגל הכלים העליון.
    1. לחץ על מצב חדש וחשיפה חדשה לפי הצורך כדי להגדיר את המצבים הביוכימיים (למשל, אנזים חופשי, אנזים + ליגנד וכו ') וזמני חשיפה דיטריום, בהתאמה, הרלוונטיים לניתוח.
    2. לחץ על Raw חדש כדי לבחור את קבצי הנתונים HDX שיש לנתח. הקצה את זמני ההחלפה המתאימים ואת המצב הביוכימי לכל קובץ נתונים גולמי המיובא.
      הערה: ניתן לייבא ולעבד את הנתונים באצוות, או בבת אחת. הוספת נתונים לפרוייקט לא תבטל ניתוח שבוצע בעבר בתוך פרוייקט זה.
  2. לאחר הוספת קבצי הנתונים, לחץ על סיום כדי להתחיל בעיבוד הנתונים. לאחר השהיה קצרה, התוכנה תשאל אם המשתמש רוצה לשמור את הנתונים לפני שתמשיך. לחץ על כן.
    הערה: העיבוד הראשוני יכול להימשך עד מספר שעות, תלוי כמה דגימות מנותחות, כמה פפטידים נמצאים ברשימת הפפטיד הסופית (שלב 4.10), גודל החלון הכרומטוגרפי ותדירות הרכישה הספקטרלית.
  3. אם תרצה, שנה את פרמטרי העיבוד בתפריט תצורה כדי לשנות את פרמטרי החיפוש של היונים. הקפד להשתמש באותם פרמטרי חיפוש ion עבור כל הנתונים בפרוייקט נתון.

7. ניתוח והדמיה של נתוני HDX

הערה: לאחר השלמת העיבוד הראשוני של הנתונים הגולמיים (שלב 6.2), תוכנת עיבוד ה- HDX תמוקם פפטידים מרשימת הפפטיד (הנוצרת בשלב 4.10) בכל אחד מקבצי הנתונים הגולמיים שנותחו. לאחר שהתפלגות האיזוטופים עבור פפטיד ברשימה ממוקמת בקובץ נתונים גולמי, תוכנת עיבוד HDX מייצגת כל איזוטופ עם "מקל" (כמו באיור 6C-E). העוצמות היחסיות של המקלות לפפטיד נתון משמשות לאחר מכן לחישוב ספיגת הדיאוטריום ביחס לספקטרום הייחוס. בעוד תוכנת עיבוד HDX עושה עבודה ראויה להערצה של הקצאת כראוי "מקלות" לרוב הפפטידים, אוצרות ידנית משמעותית של ערכי ספיגת deuterium עדיין יידרש.

  1. ניתוח ערכי ספיגת דיטריום פפטיד
    1. בחרו בפפטיד הראשון ברשימת הפפטיד ופתחו את העלילה הספקטרלית המוערמת מתפריט 'תצוגות'. גללו למעלה ולמטה בחלון התוויית הספקטרום המוערם כדי לראות את ספקטרום המסה של הפפטיד שנבחר כפונקציה של זמן חילופי דיטריום (איור 7D,E).
    2. הקצאה ו ביטול הקצאה של מקלות לפי הצורך באמצעות לחיצות עכבר כדי להבטיח שהתפלגות האיזוטופים המתאימה אותרה בנתונים ושכל פסגות איזוטופ הוקצו (מקלות שהוקצו יופיעו כחולים). לחיצה על כל אחד מהספקטרום בעלילה הספקטרלית המוערמת (איור 7D,E)תאפשר למשתמש להקצות/לבטל הקצאה של מקלות בחלון מציג הנתונים הפעיל (איור 7C).
    3. בדוק את הקצאות המקל עבור כל מצב טעינה על-ידי החלפת מצב הטעינה בחלק העליון של חלון ההתוויה הספקטרלי המוערם.
    4. חזור על שלבים 7.1.1-7.1.3 עבור כל מצב ביוכימי של עניין. ניתן גם לעבור את המצב הביוכימי בחלק העליון של חלון העלילה הספקטרלי המוערם. למדידות מדויקות ביותר של הפרשי ספיגת דיטריום, ודאו שמקלות מוקצים עבור אותה קבוצת מצבי טעינה עבור כל מצב ביוכימי.
    5. חזור על שלבים 7.1.1-7.1.4 עבור כל פפטיד ברשימת הפפטיד.
    6. בדוק את סטיית התקן של ערכי ספיגת דיטריום פפטיד באמצעות מפת הכיסוי.
      1. גש למפת הכיסוי מתפריט 'תצוגות', המציג כל פפטיד ברשימת הפפטיד הממופה לאורך רצף חומצות האמינו של חלבון העניין(איור 8C). צבע את הפפטידים לפי סטיית תקן יחסית (יחידות Da).
      2. חפשו במפה פפטידים חריגים עם סטיית תקן יחסית גבוהה. לחצו על הפפטידים החריגים במפת הכיסוי כדי לאכלס את החלקות הספקטרליות המוערמות (איור 8B)ואת חלון מציג הנתונים (איור 8A)בפפטיד היעד.
      3. באמצעות העלילה הספקטרלית המוערמת, בדוק היטב שכל מצבי הטעינה וכל נקודות הזמן של הפפטיד החריג הקצו מקלות כראוי.
        הערה: לרוב, פפטידים עם סטיות תקן גדולות (>0.3 Da) כוללים פסגות איזוטופיות שלא הוקצו כראוי על ידי התוכנה (כפי שצוין באיור 8B). הקצאת מקלות חסרים תאפשר בדרך כלל להפחית את סטיית התקן היחסית של פפטיד ל- <0.3 Da.
      4. הסתר את הפפטיד מהרשימה אם לא ניתן להפחית את סטיית התקן היחסית לפחות מ- 0.3 Da.
  2. ייצוא נתוני הפרש HDX בין שני מצבים ביוכימיים למיפוי על מודל מבני של החלבון של עניין.
    1. הצג את הפרשי העניין במפת הכיסוי. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מפת העיתוד כדי לייצא את נתוני ההפרש לקובץ .csv. יצא את נתוני המצב (בתבנית .csv) על-ידי ניווט אל נתונים | יצא נתוני מצב בסרגל הכלים הראשי.
      הערה: עיצוב מתאים של נתוני ההפרש וקבצי נתוני המצב מסופק במידע התומך.
    2. יבא את נתוני ההפרש, את נתוני המצב ואת קובץ ה- pdb של החלבון המעניין לתוך Deuteros28. בחר את הרווח בר-הסמך של 99%, בחר הפוך סכום לזמיןועיבד את הנתונים.
      הערה: יש להתקין את MATLAB במחשב כדי להפעיל את Deuteros. Deuteros ישתמש במדידות השכפול בערכת הנתונים כדי לחשב את סטיית התקן של נתוני הספיגה עבור כל פפטיד. סטיית תקן זו תשמש להגדרת הרווח בר-הסמך עבור החלפה משמעותית, שתוצג על ההתוויות.
    3. תחת אפשרויות PyMOL, בחר ספיגת ייצוא | לייצא כדי ליצור סקריפט Pymol למפות אזורים של הבדל חילופי משמעותי על מבנה pdb של החלבון של עניין באמצעות תוכנת PyMOL.
      הערה: באמצעות זרימת העבודה המתוארת בפרוטוקול זה, מרווח הביטחון של 99% עבור הפרש משמעותי של ספיגת דיטריום עבור פפטיד נתון בנקודת זמן אחת הוא בדרך כלל 0.3-0.5 Da. מרווח הביטחון של 99% עבור ההפרש המסוכם על פני כל נקודות זמן ההחלפה הוא בדרך כלל 0.7-1.0 Da.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יש צורך להעריך את איכות העיכול הפרוטאוליטי ואת הרבייה של זרימת העבודה עבור כל קבוצה של זריקות מדגם. לכן, לפני ביצוע מבחני HDX-MS, חיוני לקבוע תנאים יעילים לפרוטאואליזה של החלבון המעניין, להפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית פאזה הפוכה וניידות שלב גז יון, ולגילוי פפטידים באמצעות טרשת נפוצה. לשם כך, יש לחקור תחילה את דגימות הייחוס לחלבון המעניין (שנאסף בהיעדר דיטריום) (סעיף 3). הנתונים הכרומטוגרפיים באיור 3A-C מראים את סך כרומטוגרמות היונים (TICs) עבור שלוש דגימות ייחוס ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זרימת העבודה HDX-MS המוצגת בפרוטוקול זה מספקת פלטפורמה איתנה להפליא למיפוי ההתפלגות המרחבית של אלמנטים דינמיים מבנית בחלבונים ולחקור כיצד דינמיקות אלה משתנות בתגובה לטריאבינציה (קשירה ליגנד, מוטגנזיס אנזים וכו '). HDX-MS מחזיק במספר יתרונות ברורים על פני גישות ביולוגיות מבניות אחרות המשמשות בדרך כלל לחקר הדינמיקה הקונפורמית. בעיקר, רק כמויות קטנות של חלבון נדרשים. באמצעות זרימת העבודה המתוארת במסמך זה, מדגם של 1 מ"ל של חלבון μM אחד מספק מספיק חומר לתגובות HDX משולשות שכל אחת מהן מכילה 5 נקודות זמן החלפה. יתר על כן, אין כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה, פונדס דה Recherche du Quebec Nature et Technologie, הקרן הקנדית לחדשנות, וקרנות הזימון של אוניברסיטת מקגיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
[glu-1]-פיברינופפטיד B (Glu-Fib)BioBasicNA
0.5 מ"ל Amicon Ultracel 10k מכשיר סינון צנטריפוגלי (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
אצטוניטרילפישרA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
חומצה פורמיתתרמו פישר28905
גואנידין-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
מגנזיום כלורידSiGMA-Aldrich63068-250G
אשלגן כלוריBioBasicPB0440
אשלגן פוספטBioBasicPB0445
TCEP הידרוכלורידTRC קנדהT012500פפטיד סונתז על פי בקשה
שם החומר/ציודחברהמספר קטלוגיComments/Description
software
DeuterosAndy M C Lau, et alגרסה 1.08
DynamXWatersגרסה 3.0
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersגרסה 3.0.3
PyMOLSchrö דינגרגרסה 2.2.2
<חזק>שם החומר/ציוד<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות/תיאור/תיאור
><חזק>מכשיר וציוד
ACQUITY UPLC BEH C18 אנליטי טורמים186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard טרום טורמים186003978
ACQUITY UPLC M-CLASS HDX מערכתמים
HDX מנהלמים
מיקרוטיפ pH אלקטרודהתרמו פישר13-620-291
מים Enzymate BEH עמוד או פפסין סולומןמים186007233
מים סינפט מי
MassLynx Waters גרסה 4.1 G2-Si

מקורות

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דינמיקה קונפורמציונלית של חלבוניםאינטראקציות בין אנזים לסובסטרטכרומטוגרפיה נוזלית בעילת ביצועים (UPLC)אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסותמדידת ספיגת דאוטריוםביוסינתזה של לנתיפפטידיםאפיון מבני של חלבונים
פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.