הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

28K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61054

⸱

22 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

תקציר

ECLIA היא שיטה רב-תכליתית אשר מסוגל לכמת אנדוגני וכמויות חלבון רקומביננטי בפורמט 96. כדי להדגים את היעילות ECLIA, השימוש באותה שימוש כדי לנתח רמות פנימיות של MeCP2 ברקמת המוח של העכבר ואת ספיגת של תאת-MeCP2 בתוך העור האדם פיברופיצוצים. MeCP2-ECLIA מייצרת מדידות מדויקות ומובנות עם שגיאה נמוכה בתוך ובין-שיטת הספק. לסיכום, פיתחנו שיטה כמותית להערכת משתני חלבון MeCP2 שניתן לעשות בהם שימוש במסכי תפוקה גבוהה.

מבוא

הטיפול החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) מבוסס על תהליך העושה שהוא משתמש בתוויות המיועדות לפלוט לומיאוציה כאשר מגורה באמצעות אלקטרוכימית. זוהי טכניקה הישימה באופן כללי עבור גילוי כמותי של אנליטים ביולוגיים בתעשייה בסיסית ומחקר אקדמי, תעשיית המזון, כמו גם באבחון קליני1. בדרך כלל, 96 חד פעמי עם אלקטרודות לדיו פחמן משמש. אלקטרודות אלה משמשים כמוביל בשלב מוצק עבור שיטת החיסוני. נוגדן משני מצומת לתווית אלקטרוכימית וכאשר החשמל מוחל על המערכת, פליטת האור של התווית הכימית מופעלת. אולטרה נמוך במיוחד המטען מצמידים מכשיר (CCD) רשומות את עוצמת האור אשר פרופורציונלי באופן ישיר אנטיגן מאוגד לנוגדן לכידת וכתוצאה מכך את הכמת של המטרה של המדגם2. לעומת שיטת החיסוני הקשורה באנזימים (אליסה), ECLIA נחשבת ליתרון כפי שהוא מציע רגישות גבוהה יותר, מיוציציה, כמו גם אוטומציה טובה יותר ועקביות3.

כאן ניתחנו את החלבון כריכת מתיל-CpG 2 (MeCP2) רמות בדגימות של מקור אנושי מורמי, כמו גם גרסאות שונות של החלבון רקומביננטי באמצעות מערכת ECLIA שפותחה לאחרונה. MecP2 הוא מקושר X הגרעין חומצה מחייב חלבון ידוע לקיים אינטראקציה עם רצפי DNA ממתיל. החלבון הזה היה מעורב בוויסות. הביטוי הגנטי4,5 אובדן הפונקציה של מוטציות בגן אשר מקודד חלבון זה הם הפושעים העיקריים גורם Rett תסמונת (RTT), הפרעה חמורה התפתחותית הנוירולוגית6. עוד הפרעה MeCP2 הקשורות, תסמונת שכפול MeCP2 , גם מוביל סימפטומים נוירולוגיים שיכולים חופפים עם אלה של rtt7. בעיקר, הנקבות מושפעות בעיקר על ידי rtt בעוד הזכרים הם6נגועים בעיקר על ידי תסמונת MECP2 שכפול 6,7.

הפרעות אלה משויכות לרמות MeCP2 לא מספיקות או עודפות בהתאמה במערכת העצבים המרכזית (CN). מכאן, אפשרויות טיפול RTT המערבות הגדלת רמות MeCP2 ב-CN צריך למנוע את ההשפעות מזיקים הקשורים עם עודף של MeCP27. בשל עובדה זו, ככמת מאוד רגיש ומדויק של רמות החלבון MeCP2, כפי שסופקו על ידי מערכת ECLIA, היא חיונית לקידום RTT כמו גם MeCP2 מחקר תסמונת שכפול. המדידות המדויקות של רמות אנדודוגני ואקסודוגני MeCP2 מקווי התאים האנושיים ודגימות רקמות העכבר, כמו גם חלבון רקומביננטי המורכב של האדם MeCP2 isoform B (הידוע גם בשם isoform e1), ו מינימלי N-מסוף התמרה התחום HIV-תאת (תאת-MeCP2) כי יש8את הפוטנציאל לחצות את מוח הדם-מחסום 8,9 מוצגים בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אישור לרכישת ביופסיה לעור לצורכי מחקר התקבל מוועדת האתיקה של מחקר האדם בבית החולים לילדים בווסטמיד, אוסטרליה. הסכמה לניסויים בבעלי חיים הושגה מהמשרד הפדרלי האוסטרי של מדע, מחקר וכלכלה, אשר בוצעו בהתאם לתקנות בעלי חיים מקומיים לרווחת (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

הערה: העיקרון של מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1.

1. בחירת נוגדנים

  1. הערכת יחס אות לרעש עבור מגוון של נוגדנים MeCP2 שונים ולזהות את עוצמת האות הטובה ביותר ואת הספציפיות ביותר בתוך שילוב של MeCP2 נוגדן העכבר העיקרי (שיבוט Mec-168) ו הארנב polyclonal בטים MeCP2 נוגדן זיהוי (נעשה בהתאמה אישית). עבור הנוגדן המשני, השתמש בנוגדן ספציפי למערכת (טבלת חומרים), שהיה גם מאומת.
    הערה: טבלה 1 מעניקה סקירה של כל הנוגדנים האומתו במהלך פיתוח MECP2-eclia וטווחי הדילול שלהם נבדק.
פונקציהשםשיבוטדילול
ראשיעכבר, אנטי MeCP2Mec-1681:500 לאחד: 10000
ראשיעכבר, אנטי MeCP2מיכל כהן1:250-1:4000
ראשיעכבר, אנטי MeCP2גברים-81:500-1:4000
ראשיעכבר, אנטי MeCP2מיכל בייס1:500-1:4000
ראשיארנב, אנטי MeCP2D4F31:500-1:4000
שניארנב, אנטי MeCP2פוליבטיים1:2000-1:20000
שניארנב, אנטי MeCP2פוליבטיים1:2000-1:20000
זיהויSULFO-תג מתויג אנטי ארנבפוליבטיים1:500-1:1000

שולחן 1-רשימת נוגדנים ומדלל עבודה משומשים.

  1. לחלופין, השתמש בכל זוג של MeCP2-נוגדנים הפועלים היטב עם אליסה המקובלת.

2. טיפול HDFs עם היתוך תאת-MeCP2 חלבון

הערה: תאת-MeCP2 היה recombinantly ביטא es, coli ומטוהר באמצעות טכניקות כרומוגרפיות סטנדרטיות כפי שתוארה בעבר8 ומאוחסן ב-80 ° c.

  1. צלחת 1 x 106 בתאי הגוף האנושי (hdf) תאים ב 100 מ"מ מנות ולגדול את התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עד שהם מגיעים על 90% שליטה.
  2. תוציא בקבוקון אחד. מחלבון ההיתוך תאת-MeCP2 . להפשיר על קרח ולערבב בעדינות
  3. לדלל תאת-MeCP2 לריכוז הסופי של 500 nM ב 50 mL של מדיה תרבות HDF.
  4. להסיר את המדיה מתוך 100 מ"מ מנות ו-דגירה את התאים עם 500 ננומטר תאת-MeCP2 ב 37 ° צ' לתקופות דגירה שונות עד 24 h.
  5. הסר את הפתרון תאת-MeCP2 מהתאים. לשטוף את התאים 2x עם תמיסת מלח פוספט מחומם מראש של Dulbecco (DPBS).
  6. פנקו את התאים בעלי 2 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c10.
  7. הוסיפו 6 מ ל של מדיית תרבות HDF כדי להשבית את טריפסין ולאסוף את התאים בצינורות של 15 מ"ל.
  8. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים 2x עם DPBS קר קרח. לאחסן את הגלולה על הקרח ולהמשיך עם ההכנה לדוגמא.

3. הכנה לדוגמא

  1. ליטים HDF
    1. לקבוע את רמות החלבון הגבוה ביותר של MeCP2 באמצעות שיטת הקצירה לשבר הסלולר לתוך התאים הגרעיניים cytoplasmic והגרעין על פי סוזוקי et al.11. הגבל שבירה ליותר משישה דגימות לכל ניסוי.
  2. המוח העכבר ליסוטים
    1. הכינו 100 mL של כל לפירוק ההיפוטוניקה מגיב ומאגר החילוץ.
      1. עבור לפירוק ההיפוטוניקה מגיב, מערבבים היטב 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד ו 10 מ"מ אשלגן כלוריד.
      2. עבור מאגר החילוץ, מערבבים היטב 20 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 0.42 M נתרן כלוריד, 0.2 mM EDTA, ו -25% (v/v) גליצרול.
      3. כוונן את ה-pH של שני המאגרים ל-7.9.
      4. הוסף 1 מילימטר ממדי dithioitol (DTT) ו-1x מעכב פרוטאז קוקטייל שני מאגרים טרי. הירגע על הקרח לפני השימוש.
    2. להשעות 100 מ"ג של המוח הכללי של העכבר (זן: C57BL/6J, wildtype זכר ונקבה ו B 6.129 P2 (C)-Mecp2tm 1.1 bird/j, hemizygous זכר וheterozygous נקבה; גיל: 4-8 שבועות הישן) ב 1 מ ל של הקרח קר לפירוק ההיפוטון מגיב.
    3. המגון לסדר את המוח עם מקורר לפני כל זכוכית הומוגנידצר רקמות על ידי 15 משיכות של הומוגניצר A (רופף, עבור הרשאה גדולה) ו-B (הדוק, עבור הרשאה קטנה), בהתאמה.
    4. העבר את התאים המהומוגניים לצינור נקי וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. התעלם מהסופרנטנט (או שמור אותו כשבר cytoplasmatic לשימוש נוסף).
    5. השהה מחדש את הגלולה ב-140 μL של מאגר החילוץ לכל 100 מ"ג של חומר התחלתי. הניחו את הצינור בבלוק תרמותרמי מראש וערבבו בעדינות במשך 30 דקות ב -4 ° c.
    6. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט (כלומר, השבר הגרעיני) לצינור מקורר חדש ולחנות ב-80 ° c עד השימוש.
      הערה: ריכוז החלבון של lysates נגזר ממוח העכבר ו-HDFs ניתן להעריך על ידי שיטת החלבון BCA.

4. MeCP2-פרוטוקול ECLIA

  1. הכנת פתרון כביסה, חסימת פתרון מאגר ושיטת מדלל (יום 1)
    1. הוסף 500 μL של רצף של 20 אל 1 L של PBS כדי להכין 0.05% רצף 20 בפתרון PBS, לערבב במרץ ותווית כמו "פתרון כביסה".
      הערה: ודא שנעשה שימוש רק במאגר הכביסה המוכן לשימוש.
    2. הכנת פתרון חסימה של 3% חוסם A (טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסנן לעקר ולשמור אותם במקרר עד לשימוש עבור שבועיים לכל היותר.
    3. הוסף 5 מ ל של פתרון חסימה ל 10 מ ל של PBS כדי להכין את הפתרון שיטת הפעולה (1% חוסם A ב PBS).
  2. ציפוי לוחות מאגד גבוה
    1. קח את 96-היטב multi-מערך בודד במקום יחיד לאגד לוחית גבוהה.
      הערה: לוחיות האיגוד הגבוהות כוללים קיבולת מחייבת גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מלוחות סטנדרטיים עם משטחי הידרופובי.
    2. הפשרת העכבר מונוקובטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח ולערבב 0.67 μL של הנוגדן עם 4 מ ל של PBS (1:6000 נוגדן דילול ב-PBS). מערבולת פתרון הנוגדן לערבב היטב ולתייג את הצינור כמו "פתרון ציפוי".
    3. בזהירות לוותר על 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל טוב באמצעות מצנפיאור רב-ערוצי; הדבר נקרא שיטת ציפוי הפתרון. הקש על צלחת ה-96 בעדינות על כל צד כדי לוודא שפתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר.
    4. אטום את הצלחת בנייר דבק והטה את הצלחת במקרר ב -4 ° c ללילה (12-16 שעות).
  3. חסימה (יום 2)
    1. הוציאו את הצלחת מהמקרר והסירו את נייר הכסף.
    2. הסר את הפתרון ציפוי נוגדן על ידי מצליף אותו לסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון ציפוי מן הבארות.
    3. הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל טוב. לאטום את הצלחת שוב ולמקם אותו על שייקר מיקרולוח מסלולית.
    4. מודטה את הצלחת עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
  4. הכנות של תקנים ודוגמאות
    1. בזמן הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או תאת-MeCP2 ודגימות שונות.
      הערה: מאגר לייליזה המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה שנעשה בו שימוש בדגימות שנותחו.
    2. להוציא בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תאת-MeCP2 מלאי חלבון פתרון (250 μg/mL), המוח העכבר lysates ו HDF lysates מ-80 ° c. . להפשיר אותם על קרח
    3. דלל את פתרון המניה הסטנדרטית (MeCP2 ו/או תאת-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 2.
    4. לדלל את הדגימות במאגר לפירוק כדלקמן: 1-20 μg של המוח העכבר ליפוסט לכל 25 μL של מאגר לפירוק, ו 0.25-1 μg של HDF ליפוסט 25 μL של מאגר לפירוק. הכן מספיק נפח של כל מדגם כדי לבצע ניתוח בטרילקאט.
רגילריכוזדילול
תקן 11,800 ng/mL1.08 μL רגיל פתרון מניות + 148.92 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 2600 ng/mL50 μL סטנדרטי 1 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 3200 ng/mL50 μL סטנדרטי 2 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 466.67 ng/mL50 μL סטנדרטי 3 + 100 μL לוליזיס מאגר
חדר סטנדרט 522.22 ng/mL50 μL סטנדרטי 4 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 67.41 ng/mL50 μL רגיל 5 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 72.47 ng/mL50 μL רגיל 6 + 100 μL מאגר לוליזיס
רגיל 80.82 ng/mL50 μL סטנדרטי 7 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 90.27 ng/mL50 μL סטנדרטית 8 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 100 ng/mLמאגר הליזה 150 μL

טבלה 2: סדרות סטנדרטיות בין 0 ל-1,800 ng/mL.

  1. הוספת דגימות ופתרונות סטנדרטיים
    1. הסר את פתרון חסימת ידי מצליף אותו לסל הפסולת ולהקיש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון חסימת מבארות.
    2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    3. הוסף 25 ul של תקנים ודגימות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות צינור בודד בערוץ.
    4. חותם את הצלחת ו מודקת את הצלחת עבור 4 h בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
  2. נוגדן זיהוי ללא תווית
    1. להפשיר את הארנב רב שבטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:6000 בתוך שיטת הפתרון.
    2. הסר את הסטנדרטים והדגימות על-ידי הצליף בו לסל הפסולת והקש על הצלחת על מגבת נייר.
    3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    4. הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי ללא תווית לכל טוב עם הצינורות הרב-ערוצי. חותם את הצלחת ו מודקת אותו עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
  3. נוגדן ספציפי
    1. קחו את הנוגדן המשני המסוים (טבלת חומרים) מהמקרר והניחו אותו על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתוך הפתרון בסדר ומערבבים בעדינות.
    2. להסיר את הנוגדן ללא תווית משנית על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
    3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    4. הוסף 25 μL של נוגדן ספציפי (טבלת חומרים) לכל טוב עם הצינורות הרב רב-ערוצי. חותם את הצלחת ואת הדגירה עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
  4. קריאת הלוחית
    1. הסר את הנוגדן בחינם המגודרת (טבלה של חומרים) על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
    2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של פתרון כביסה.
    3. הוסף 150 μL של 1 x טריס מבוססי זהב לקרוא מאגר (טבלה של חומרים) עם החומרים המכילים triפרופיאמין כשותף מגיב עבור דור האור לצלחת. להימנע בועות אוויר על ידי שימוש הפוך טכניקות ליטוף.
    4. מניחים את הצלחת על פלטפורמת זיהוי אימונולוגיה (לוח חומרים) ולהתחיל את המדידה מיד. השתמש בהגדרות של 96-ובכן רכישת צלחת.
    5. ללכוד את האותות אלקטרוכימי על ידי מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוככימי (טבלת חומרים) ולהקליט את ספירות האות, אשר מתאים יחידות אור יחסית (rlu) והם יחסיים ישירות לעוצמת האור.
      הערה: על ידי גירוי אלקטרוכימי, התווית הרותניום המאוגדת לאלקטרודה הפחמן מקרינה אור מואר ב620 ננומטר. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה המלווה במכשירים (טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עקרון מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1. עקומות סטנדרטיות לשתי משתני MeCP2 מוצגות באיור 2. הקוונפיקציה מדויקת היתה אפשרית מעל מגוון רחב של ריכוזים (1-1800 ng/mL). באיור 3, רמות MeCP2 של lysates נגזר ממוח העכבר ו-hdfs נותחו. MeCP2 ביטוי של lysates גרעינית המוח מ heterozygous, ומסוג wildtype עכברים הושוו באיור 3A, בעוד באיור 3A no MeCP2 חלבון זוהה ב-MeCP2 לקויה האדם בפיברוטים (c. 8...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי למדוד MeCP2 אנדודוגני, רקומביננטי MeCP2 ו-תאת-MeCP2 רמות, הצלחת 96-באר ECLIA פותחה. זה הוכח כי אובדן של פונקציית חלבון MeCP2 מוביל לתסמונת RTT6, עבור איזה טיפול מוגבל כעת ניהול סימפטום ופיזיותרפיה. אחד שדרת טיפול מבטיח הוא טיפול החלפת חלבון כביכול, שם רמות MeCP2 יכול להיות טיטרציה עד הריכוז הדרוש שלהם12,13,14,15. הפוטנציאל של החלבונים תאת-fusion לחצות את מכשול המוח ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו אסירי תודה לד ר בריג סער לתמיכתה בכלי ECLIA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי
בדיקת חלבון Bio-Rad תרכיז ריאגנט צבעBio-Rad Laboratories Inc.500-0006הכנה לדוגמא
AB SULFO-TAG תווית אנטי-ארנבאבחון סולם מזוR32AB-1
עבודה לגילוי נוגדנים 4.0תוכנתגילוי
מזו DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029הכנת דגימה
Dulbecco' s PBS (סטרילי)Sigma-AldrichD8537-500MLהכנת דגימה, תמיסת כביסה, תמיסת ציפוי
EDTASigma-AldrichEDSמאגר מיצוי
סרום בקר עובריSigma-AldrichF9665הכנת דגימה
גליצרולSigma-AldrichG2025מאגר מיצוי
מאגר קריאת זהב T (1x) עם סולם מזו פעילי שטח אבחוןR92TGMeCP2 פרוטוקול ECLIA
HEPESSigma-AldrichH3375מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי
סט מטחנת רקמות KIMBLE DounceSigma-AldrichD8938הכנת דגימה
שייקר מעבדה, תנועת נדנדה (מהירות נמוכה)GFL3014MeCP2 פרוטוקול ECLIA
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי
MeCP2 (אנושי) חלבון רקומביננטי (P01)Abnova CorporationH00004204-P01טיפול בתאים
Microseal B חותםBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001לאיטום צלחות
מונוקלונלי אנטי-MeCP2, מיוצר בעכבר, שיבוט Mec-168, אימונוגלובולין מטוהרSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075נוגדן, תמיסת ציפוי
MSD חוסם Aאבחון בקנה מידה מזוR93BA-4חוסם
MSD SECTOR Imager 2400אבחון בקנה מידה MesoI30AA-0MeCP2 פרוטוקול ECLIA
Multi-Array 96-well PlateMeso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA פרוטוקול
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקו מאת Life Technologies15140122הכנת דגימה
Polyclonal Anti-MeCP2, המיוצר בארנבEurogentec S.A.נוגדן
אשלגן כלורי (KCl)Merck KGaA1049361000מגיב ליזה היפוטוני
עכבר AB ראשי, אנטי-MeCP2 (1B11)סיגמא-אולדריץ'SAB1404063; RRID:AB_10737296נוגדנים
ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411נוגדנים
ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075נוגדן
ראשוני AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235נוגדן
ראשוני AB ארנב, אנטי-MeCP2 (D4F3)טכנולוגיית איתות תאים3456S; RRID:AB_2143849
נוגדנים קוקטייל מעכב פרוטאז (100X)Sigma-Aldrich8340מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי
AB משני, ארנב, אנטי-MeCP2Eurogentec SAנוגדן מותאם אישית
משני AB, ארנב, אנטי-MeCP2Merck07-013נוגדן
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS3014מאגר מיצוי
SULFO-TAG תויג נוגדן נגד ארנב (עז)אבחון סולם מזוW0015528Sנוגדן
TAT-MeCP2 חלבון היתוךפנימיטיפול בתאים
טריפסין EDTA 0.25% (1X)gibco של Life Technologies25200-056טיפול בתאים
Tween 20Sigma-AldrichP9416תמיסת כביסה
זיהוי שולחן קנה מידה ייצור

מקורות

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MeCP296Western BlotELISATween 20Blocker AMeCP2Tris Base Gold Read Buffer
בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.