שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2
במאמר זה
סיכום
תקציר
ECLIA היא שיטה רב-תכליתית אשר מסוגל לכמת אנדוגני וכמויות חלבון רקומביננטי בפורמט 96. כדי להדגים את היעילות ECLIA, השימוש באותה שימוש כדי לנתח רמות פנימיות של MeCP2 ברקמת המוח של העכבר ואת ספיגת של תאת-MeCP2 בתוך העור האדם פיברופיצוצים. MeCP2-ECLIA מייצרת מדידות מדויקות ומובנות עם שגיאה נמוכה בתוך ובין-שיטת הספק. לסיכום, פיתחנו שיטה כמותית להערכת משתני חלבון MeCP2 שניתן לעשות בהם שימוש במסכי תפוקה גבוהה.
מבוא
הטיפול החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) מבוסס על תהליך העושה שהוא משתמש בתוויות המיועדות לפלוט לומיאוציה כאשר מגורה באמצעות אלקטרוכימית. זוהי טכניקה הישימה באופן כללי עבור גילוי כמותי של אנליטים ביולוגיים בתעשייה בסיסית ומחקר אקדמי, תעשיית המזון, כמו גם באבחון קליני1. בדרך כלל, 96 חד פעמי עם אלקטרודות לדיו פחמן משמש. אלקטרודות אלה משמשים כמוביל בשלב מוצק עבור שיטת החיסוני. נוגדן משני מצומת לתווית אלקטרוכימית וכאשר החשמל מוחל על המערכת, פליטת האור של התווית הכימית מופעלת. אולטרה נמוך במיוחד המטען מצמידים מכשיר (CCD) רשומות את עוצמת האור אשר פרופורציונלי באופן ישיר אנטיגן מאוגד לנוגדן לכידת וכתוצאה מכך את הכמת של המטרה של המדגם2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אישור לרכישת ביופסיה לעור לצורכי מחקר התקבל מוועדת האתיקה של מחקר האדם בבית החולים לילדים בווסטמיד, אוסטרליה. הסכמה לניסויים בבעלי חיים הושגה מהמשרד הפדרלי האוסטרי של מדע, מחקר וכלכלה, אשר בוצעו בהתאם לתקנות בעלי חיים מקומיים לרווחת (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
הערה: העיקרון של מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1.
1. בחירת נוגדנים
- הערכת יחס אות לרעש עבור מגוון של נוגדנים MeCP2 שונים ולזהות את עוצמת האות הטובה ביותר ואת הספציפיות ביותר בתוך שילוב של MeCP2 נוגדן העכבר העיקרי (שיבוט Mec-168) ו הארנב polyclonal בטים MeCP2 נוגדן זיהוי (נעשה בהתאמה אישית). עבור הנוגדן המשני, השתמש בנוגד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עקרון מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1. עקומות סטנדרטיות לשתי משתני MeCP2 מוצגות באיור 2. הקוונפיקציה מדויקת היתה אפשרית מעל מגוון רחב של ריכוזים (1-1800 ng/mL). באיור 3, רמות MeCP2 של lysates נגזר ממוח העכבר ו-hdfs נותחו. MeCP2 ביטוי של lysates גרעינית המוח מ heterozygous, ומסוג wildtype עכברים הושוו באיור 3A, בעוד באיור 3A no MeCP2 חלבון זוהה ב-MeCP2 לקויה האדם בפיברוטים (c. 8.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי למדוד MeCP2 אנדודוגני, רקומביננטי MeCP2 ו-תאת-MeCP2 רמות, הצלחת 96-באר ECLIA פותחה. זה הוכח כי אובדן של פונקציית חלבון MeCP2 מוביל לתסמונת RTT6, עבור איזה טיפול מוגבל כעת ניהול סימפטום ופיזיותרפיה. אחד שדרת טיפול מבטיח הוא טיפול החלפת חלבון כביכול, שם רמות MeCP2 יכול להיות טיטרציה עד הריכוז הדרוש שלהם12,13,14,15. הפוטנציאל של החלבונים תאת-fusion לחצות את מכשול המוח ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו אסירי תודה לד ר בריג סער לתמיכתה בכלי ECLIA.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי |
| בדיקת חלבון Bio-Rad תרכיז ריאגנט צבע | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | הכנה לדוגמא |
| AB SULFO-TAG תווית אנטי-ארנב | אבחון סולם מזו | R32AB-1 | |
| עבודה לגילוי נוגדנים 4.0 | תוכנת | גילוי | |
| מזו DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | הכנת דגימה |
| Dulbecco' s PBS (סטרילי) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | הכנת דגימה, תמיסת כביסה, תמיסת ציפוי |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | מאגר מיצוי |
| סרום בקר עוברי | Sigma-Aldrich | F9665 | הכנת דגימה |
| גליצרול | Sigma-Aldrich | G2025 | מאגר מיצוי |
| מאגר קריאת זהב T (1x) עם סולם מזו פעילי שטח | אבחון | R92TG | MeCP2 פרוטוקול ECLIA |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי |
| סט מטחנת רקמות KIMBLE Dounce | Sigma-Aldrich | D8938 | הכנת דגימה |
| שייקר מעבדה, תנועת נדנדה (מהירות נמוכה) | GFL | 3014 | MeCP2 פרוטוקול ECLIA |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי |
| MeCP2 (אנושי) חלבון רקומביננטי (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | טיפול בתאים |
| Microseal B חותם | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | לאיטום צלחות |
| מונוקלונלי אנטי-MeCP2, מיוצר בעכבר, שיבוט Mec-168, אימונוגלובולין מטוהר | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | נוגדן, תמיסת ציפוי |
| MSD חוסם A | אבחון בקנה מידה מזו | R93BA-4 | חוסם |
| MSD SECTOR Imager 2400 | אבחון בקנה מידה Meso | I30AA-0 | MeCP2 פרוטוקול ECLIA |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA פרוטוקול |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ג'יבקו מאת Life Technologies | 15140122 | הכנת דגימה |
| Polyclonal Anti-MeCP2, המיוצר בארנב | Eurogentec S.A. | נוגדן | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | מגיב ליזה היפוטוני |
| עכבר AB ראשי, אנטי-MeCP2 (1B11) | סיגמא-אולדריץ' | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | נוגדנים |
| ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | נוגדנים |
| ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | נוגדן |
| ראשוני AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | נוגדן |
| ראשוני AB ארנב, אנטי-MeCP2 (D4F3) | טכנולוגיית איתות תאים | 3456S; RRID:AB_2143849 | |
| נוגדנים קוקטייל מעכב פרוטאז (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי |
| AB משני, ארנב, אנטי-MeCP2 | Eurogentec SA | נוגדן מותאם אישית | |
| משני AB, ארנב, אנטי-MeCP2 | Merck | 07-013 | נוגדן |
| נתרן כלורי (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | מאגר מיצוי |
| SULFO-TAG תויג נוגדן נגד ארנב (עז) | אבחון סולם מזו | W0015528S | נוגדן |
| TAT-MeCP2 חלבון היתוך | פנימי | טיפול בתאים | |
| טריפסין EDTA 0.25% (1X) | gibco של Life Technologies | 25200-056 | טיפול בתאים |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | תמיסת כביסה |
מקורות
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
