כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרבות החיים לשעבר של קרדיומיוציטים יונקים בוגרים (CMs) מציגה את המערכת הניסיונית הרלוונטית ביותר למחקר במבחנה של ביולוגיה לבבית. CMs יונקים בוגרים הם תאים מובדילים סופנית עם קיבולת התפשטות מינימלית. המצב שלאחר המיטוטיקה של CMs למבוגרים לא רק מגביל את התקדמות מחזור תא cardiomyocyte, אלא גם מגביל את התרבות היעילה של CMs. יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים היא הכרחית עבור מחקרים רבים, כגון התפשטות CM וניתוח של ביטוי גנים.
העכבר והעכברוש הם שתי חיות המעבדה המועדפות ביותר שישמשו לבידוד קרדיומיוציט. בעוד התרבות ארוכת הטווח של CMs חולדה אפשרית, CMs עכבר מבוגר רגישים למוות ולא ניתן לתרע יותר מחמישה ימים בתנאים נורמליים. לכן, יש צורך קריטי לייעל את בידוד התא ואת פרוטוקול תרבות לטווח ארוך עבור CMs murine למבוגרים. עם פרוטוקול זה שונה, ניתן לבודד בהצלחה ותרבות הן עכבר בוגר ועכברוש CMs במשך יותר מ 20 ימים. יתר על כן, יעילות הטרנס-תום-רוחב של סי.אם מבודד גדלה באופן משמעותי בהשוואה לדוחות קודמים. עבור בידוד CM עכבר מבוגר, שיטת perfusion Langendorff מנוצל עם פתרון אנזים אופטימלי ומספיק זמן עבור דיסוציאציה מטריצה extracellular מלא. על מנת להשיג CMs חדרי טהור, שני atria נותקו והושלכו לפני שהמשיך עם ההתנתקות והציפוי. התאים פוזרו על צלחת מצופה למימינין, מה שאפשר חיבור יעיל ומהיר. CMs הורשו להסתפק 4-6 שעות לפני תירגם siRNA. מדיה תרבות היה רענן כל 24 שעות במשך 20 ימים, ולאחר מכן, CMs היו קבועים ומוכתמים עבור סמנים ספציפיים לב כגון טרופונין סמנים של מחזור תא כגון KI67.
מבוא
מחלות לב הן אחת הסיבות המובילות למוות ברחבי העולם. כמעט כל סוגי פגיעת לב לגרום לאובדן משמעותי של cardiomyocytes למבוגרים (CMs). לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים לתקן את פציעת הלב שלהם בשל אופיו הרגיש של CM1 הבוגר. לכן, כל עלבון ללב היונקים הבוגרים גורם לאובדן קבוע של CMs, המוביל לתפקוד לב מופחת ואי ספיקת לב. שלא כמו יונקים בוגרים, בעלי חיים קטנים כמו דגי זברה ולבבות ניוט יכולים לחדש את פגיעת הלב שלהםבאמצעות התפשטותCM קיימת 2,3,4. מאמץ עולמי הוא מתמשך למצוא התערבות טיפולית חדשנית עבור פגיעה לב באמצעות גישות הן proliferative ולא התפשטות. בעשורים האחרונים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). כל הפרוטוקולים המוצגים בסרטון אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה.
1. הכנה לפני חילוץ לב מעכברים בוגרים (וחולדות)
- הכינו את הפתרונות המתאימים, האנזימים והפסקת הפתרונות, בהתאם למתכונים שניתנו בטבלה 1 ובטבלה 2, לבידוד חולדות ועכברים, בהתאמה. לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm כדי להסיר כל זיהום או חלקיקים לא פתורים.
- נקה וחטא את כלי הניתוח על ידי השריה ב-70% אלכוהול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול הנוכחי שונה מאפשר בידוד יעיל ותרבות של חולדות ועכברים CMs במבחנה. עבור חולדה CM בידוד, בסך הכל 3 מבוגר (12 שבועות) זכר פישר 344 חולדות שימשו בהליך. איור 1 מציג את הגדרות הציוד הכירורגי והבידוד הנדרשות בהליך; כל חלק סומן ותואר במקרא הדמות. קולגנס סוג 2 שימש לעיכול, אשר מניב כמות גבוהה של CMs באיכות גבוהה מבידוד מוצלח (איור 2A). 24 שעות לאחר הבידוד, תאים אלה היו טרנסגאד עם מחזור תאים וגורם siRNAs ספציפי נגד Rb1 ו Meis2, ואילו, cel-miR-6.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש צורך קריטי להקים פרוטוקול לבידוד cardiomyocyte למבוגרים ותרבות לטווח ארוך כדי לבצע מחקרים מכניים ספציפיים לתא. יש רק כמה דיווחים דנים פרוטוקולי בידוד CM למבוגרים, ואפילו פחות מהם משמשים לתרבות ארוכת טווח של עכברים בוגרים CM15,16,17. זה הראו כי CM חולדה למבוגרים יש סובלנות גבוהה יותר בתרבות המבחנה מאשר העכברים הבוגרים CM10,11,12. בדו".......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמחלקה לפתולוגיה ורפואה במעבדה, אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה, לד"ר אונור קניסיסק; מענק מהכונים הלאומיים לבריאות (R01HL148598) לד"ר אונור קניסיקאק. ד"ר אונור קניסיקק נתמך על ידי פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי (18CDA34110117). ד"ר Perwez עלאם נתמך על ידי מענק פוסט-ת"ר של איגוד הלב האמריקאי (AHA_20POST35200267). ד"ר מלינה J. Ivey נתמך על ידי מענק NIH T32 (HL 125204-06A1).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2,3-בוטאן דיון מונוקסיים | סיגמא-אולדריץ' | B-0753 | |
| בלביסטטין | APExBIO | B1387 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| צלחת תרבית תאים | קורנינג קוסטאר | 3526 | |
| מסננת | תאיםBD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| קולגנאז type2 | וורת'ינגטון | LS004177 | |
| פיפטות חד פעמיות להעברה מדורגת | פישרברנד | 13-711-20 | |
| כלי שקילה חד פעמיים מפוליסטירן | סיגמא-אולדריץ' | Z154881-500EA | |
| הנשר השונה של דולבקו's | medium Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| סרום בקר | עוברי קורנינג | 35-015-CV | |
| Fine Point מלקחיים דיוק גבוה | Fisherbrand | 22-327379 | |
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G-5400 | |
| המוציטומטר | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| דיוק גבוה ישר רחב נקודה חזקה פינצטה/מלקחיים | פישרברנד | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| אינסולין | סיגמא-אולדריץ' | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| מיקרוסקופ אור | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| למינין עכבר טבעי | Invitrogen | 23017-015 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | קורנינג | 30-002-CI | |
| פנטוברביטל | הנרי שיין | 24352 | |
| פוספט חוצץ | מלח Life Technologies | 20012-027 | |
| פרוטאז XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| סלניום | סיגמא-אולדריץ' | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| ישר קהה / חד מספריים חיתוך | פישר מדעי | 28252 | |
| ישר דק מאוד דיוק קצה מלקחיים | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| טאורין | סיגמא-אולדריץ' | T0625 | |
| טרנספרין | סיגמא-אולדריץ' | T8158-100MG | |
| מספריים חלקים במיוחד בגימור משופע | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| אמבט מים | פישר סיינטיפיק | 3006S |
מקורות
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxyge....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
