בדיקה מבוססת שטף לזיהוי מודולטורים של אוטופגיה לדלקת מפרקים ניוונית

Uxía Nogueira-Recalde; Irene Lorenzo-Gómez; María I. Loza; Eduardo Domínguez; Beatriz Caramés

doi:10.3791/61078

מאמר שיטה

בדיקה מבוססת שטף לזיהוי מודולטורים של אוטופגיה לדלקת מפרקים ניוונית

DOI:

10.3791/61078

⸱

8 ביולי 2020

Uxía Nogueira-Recalde¹ , Irene Lorenzo-Gómez¹ , María I. Loza² , Eduardo Domínguez² , Beatriz Caramés¹

¹Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, ²Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מפרט ניטור שטף אוטופגיה לזיהוי מולקולות חדשות על ידי סינון הדמיה מבוסס תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטופגיה היא מנגנון מרכזי לוויסות הומאוסטזיס. שינויים באוטופגיה תורמים למחלות הקשורות להזדקנות. שיטות פנוטיפיות לזיהוי מווסתים של אוטופגיה יכולות לשמש לזיהוי טיפולים חדשים. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של סינון הדמיה מבוססת תאים שפותחה כדי לנטר שטף אוטופאגי באמצעות LC3 כמדווח על שטף אוטופאגי (mCherry-EGFP-LC3B) בכונדרוציטים אנושיים. איסוף הנתונים מתבצע באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי של מערכת סינון הדמיה בתוכן גבוה. פרוטוקול ניתוח תמונה אוטומטי מבוסס אלגוריתם פותח ואומת לזיהוי מולקולות המפעילות שטף אוטופגי. מדווחים על צעדים קריטיים, הערות הסבר ושיפורים לעומת פרוטוקולי ניטור האוטופגיה הנוכחיים. גישות סינון פנוטיפיות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית למיקוד סימני היכר של הזדקנות יכולות להקל על אסטרטגיות יעילות יותר לגילוי תרופות למחלות שרירים ושלד הקשורות לגיל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות כרוניות רבות קשורות לסימני ההיכר של ההזדקנות, כולל אוטופגיה פגומה¹. דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת המפרקים הנפוצה ביותר ויש לה השפעה רבה על הגבלת הפעילויות היומיומיות באוכלוסייה המזדקנת, אך עדיין אין אמצעי מניעה או טיפולים משני מחלה^{זמינים 2}.

הזדקנות מפרקים ודלקת מפרקים ניוונית קשורים לסימני היכר המגדירים את התקדמות ניוון הסחוס, כולל אוטופגיה פגומה והזדקנות ^3,4. התמקדות באוטופגיה ברקמות שריר ושלד יכולה לסייע במציאת חידושים טיפוליים למחלות ראומטולוגיות ^5,6. אפנון פרמקולוגי של אוטופגיה הוא מנגנון מבטיח ורלוונטי להתערבות במודלים של מחלות פרה-קליניות⁷. בדלקת מפרקים ניוונית נעשה שימוש בהפעלת אוטופגיה למניעת תפקוד לקוי של המפרקים⁸. ניתן להשתמש בשיטות לניטור אוטופגיה המבוססות על פרוטוקולים חזקים וניתנים לשחזור המאפשרים ניתוח כמותי כדי לזהות גורמים חדשים ולהקל על מיקוד פרמקולוגי של סימני היכר רלוונטיים למחלה של הזדקנות.

שטף אוטופגיה משקף פעילות פירוק ומהווה מדד רלוונטי לזיהוי מולקולות חדשות המפעילות אוטופגיה⁹. מחקר זה מתאר שיטה שפותחה לקביעת שטף אוטופאגי על ידי מדידת פעילות פירוק אוטופאגי באמצעות קו תאים מדווח אוטופגיה בכונדרוציטים אנושיים (TC28a2). ביטוי חולף mCherry-EGFP-LC3 מאפשר ניטור בו זמנית של אירועי היווצרות ופירוק אוטוליזוזומים על ידי כימות ההבדלים ברגישות ה-pH בין אותות GFP ו-mCherry LC3 בליזוזומים של תאים חיים¹⁰.

התאמת שיטה זו המדווחת על זרימה ציטומטרית למערכת ניטור הדמיית ביטוי יציבה בכונדרוציטים חיים עשויה לאפשר זיהוי של מולקולות המפעילות שטף אוטופאגי בהקשר של ביולוגיה של סחוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת קו תאים מדווח אוטופגיה של כונדרוציטים אנושיים אימורטליים

הערה: יצירת קו תאים מדווח אוטופגיה על ידי טרנספקציה יציבה של pBABE-mCherry-GFP-LC3 על ידי הקמת קריאה כמותית של ציטומטריית זרימה תוארה בעבר¹¹. שני קווי תאים שימשו בטרנספקציה הרטרו-ויראלית: HEK 293-T17 במהלך תהליך הקוטרנספקציה ו-T/C28a2 בשלב ההדבקה.

תהליך קוטרנספקציה
1. הכן את מצע הגידול לתאי HEK 293-T17: 500 מ"ל של המדיום החיוני המינימלי של נשר (EMEM), 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). אחסן את מצע הגידול ב-4 מעלות צלזיוס וחמם ל-37 מעלות צלזיוס לפני כל שימוש.
2. זרע 1 x 10⁶ תאי HEK 293-T17 לבאר לתוך צלחות תרבית תאים של 100 מ"מ, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, וודא שהם נמצאים במפגש ~75% לפני תחילת תהליך הטרנספקציה.
3. הסר את מצע התרבית, שטוף בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), והוסף 8 מ"ל EMEM עם 2% FBS ו-1% P/S.
4. בצינור חרוטי, הוסף 10 מיקרוגרם, 3 מיקרוגרם ו-7 מיקרוגרם של pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. פלסמידים G ו- pCL-Eco, בהתאמה. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת פי 1 (טבלת חומרים). הוסף מגיב טרנספקציה (טבלת חומרים) כתערובת לא ליפוזומלית של ליפידים כדי לקבל יחס של 1:3 (1 מיקרוגרם DNA: 3 מיקרוגרם מגיב טרנספקציה; נפח סופי = 60 מיקרוליטר).
  הערה: מכינים בסך הכל 20 מיקרוגרם תערובת עבור כל לוחית תא בגודל 10 ס"מ שיש להעביר.
5. דוגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו בזהירות את תערובת הטרנספקציה טיפתית לתאי האריזה של HEK 293-T17. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לפחות 48 שעות לפני בדיקת ביטוי חלבון ירוק ואדום במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
  הערה: בתנאים אלה, יותר מ-75% מהתאים אמורים להיות חיוביים לפלואורסצנטיות. ודא שיעילות הטרנספקציה גבוהה (למשל, יותר מ-75% מהתאים חיוביים). השתמש ב- DNA פלסמיד איכותי (למשל, בעיקר מפותל וללא DNA גנומי, RNA וחלבון; מרוכז מאוד; ללא אנדוטוקסינים ומלחים) כמו גם בתרביות תאים איכותיות (למשל, הומוגני, מעבר נמוך, חד שכבתי, מועבר בשלב הצמיחה האקספוננציאלי, ללא מיקופלזמה).
באותו יום של קוטרנספקציה, הכינו כונדרוציטים T/C28a2.
1. הכן מדיום גידול תאים T/C28a2: 500 מ"ל של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו-1% P/S. אחסן את מדיום הגידול ב-4 מעלות צלזיוס וחמם ל-37 מעלות צלזיוס לפני כל שימוש.
2. זרעים 2 x 10⁵ T/C28a2 כונדרוציטים בשני צלחות מרובות 6 בארות ודוגרים במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
תהליך זיהום רטרו-ויראלי
1. מדיום תרבית שאיבה מתאי אריזה רטרו-ויראלים HEK 293-T17 המתקבלים משלב 1.1.5. יש לשטוף 1x עם 4 מ"ל HBSS ולשאוף HBSS.
2. מוסיפים 2 מ"ל טריפסין וממתינים 2 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. נטרל טריפסין על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום תרבית HEK 293-T17 ותאי העברה ומדיום לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
3. תאי צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות. מעביר סופרנטנט למסנן סטרילי דרך ממברנה של 0.45 מיקרומטר.
4. שאפו את מדיום תרבית הכונדרוציטים T/C28a2 מ-6 הלוחות המרובים. להדביק תאי T/C28a2 על ידי הוספת 2 מ"ל של תרחיף ויראלי (שלב 1.3.3) לבאר ל-6 ריבוי בארות. השתמש בבאר אחת לבקרה (כלומר, תאים לא מועברים), הוסף 2 מ"ל של מדיום גידול תאי T/C28a2 במקום תרחיף ויראלי.
5. יש לדגור במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
כדי לבצע את תהליך הבחירה, השתמש בסלקציה אנטיביוטית על תאים שעברו טרנספטציה כדי לחסל תאים לא טרנספטנטיים ולהשיג אוכלוסיית תאים הומוגנית.
הערה: הווקטור הרטרו-ויראלי pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B מספק עמידות אנטיביוטית של יונקים לפורומיצין, המאפשרת בחירה של תרבית תאים יציבה לאחר טרנספקציה ויראלית. יש להגדיר מראש עקומות הרג לריכוז פורומיצין אופטימלי של כונדרוציטים T/C28a2 כדי לקבוע את התנאים המתאימים לבחירת שיבוטי התאים הנושאים את הטרנסגן עם רמות ביטוי גבוהות.
1. הכן T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B מדיום גידול קו תאים יציב: 500 מ"ל של DMEM, 10% FCS, 1% P/S ו-2.5 מיקרוליטר/מ"ל פורומיצין. יש לאחסן בינוני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולחמם ל-37 מעלות צלזיוס לפני כל שימוש.
2. שנה את המדיום. עבור כל מדיום תרבית רב צלחת 6 בארות, שואבים, שוטפים 1x עם 2 מ"ל HBSS ושואבים אותו. מוסיפים 2 מ"ל בינוני ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. זוהי תחילתו של תהליך הבחירה.
3. החלף את המדיום כל יומיים והתבונן בתאים מתים ובאוכלוסיות תאים עמידים לפורומיצין. השווה את התוצאות לתאי הביקורת הלא מועברים, שאינם עמידים לפורומיצין ומתים.
כדי להתחיל ברירה משובטת, ודא שהאוכלוסיות החד-שבטיות גדלו. לכל 6 באר multiplate:
1. הוסף 200 מיקרוליטר בינוני לבאר לתוך צלחת רב-תכליתית של 96 בארות.
  הערה: כל תא בודד שנבחר מתוך 6 הבארות המרובות יצופה בבארות בודדות של 96 הבארות הרב-צלחות.
2. השתמש במיקרוסקופ כדי לזהות כל אוכלוסייה חד שבטית ב-6 הלוחות המרובים. ניתן להבחין במושבות שנוצרו מתאים בודדים.
3. שואבים מדיום תרבית מ-6 מולטי-פלטות באר, שוטפים 1x עם 2 מ"ל HBSS ושואבים HBSS.
4. הוסף 10 מיקרוליטר טריפסין לכל אוכלוסייה חד-שבטית כדי להעביר תאים בודדים לכל באר מ-96 הלוחות המרובים. יש לדגור במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
לאחר 48 שעות, החלף את המדיום ב -100 מיקרוליטר של מדיום טרי לבאר. חזור על הליך זה עד להיווצרות מושבות עקב התרחבות תאים בודדים.
לאחר שתא בודד התרחב היטב, צלחו כל אוכלוסייה חד שבטית בבארות בודדות של 24 בארות, 6 בארות ו-100 מ"מ צלחות תרבית תאים.
צור קו תאים חד שבטי יציב בשיטת מיון תאים בודדים.
1. שאיבה של מדיום תרבית מלוחות תרבית תאים של 100 מ"מ. שוטפים 1x עם 8 מ"ל HBSS ושואבים אותו.
2. מוסיפים 2 מ"ל טריפסין על כל צלחת ודוגרים למשך 2 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. נטרל טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל של מדיום תרבית.
3. תאי צנטריפוגה ב-252 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. הוסף 4 מ"ל של HBSS לכל כדור תא, השהה אותו בזהירות והעביר אותו לצינורות ציטומטריה.
4. הזרקו כל דגימת תא לתוך ציטומטר זרימה (טבלת חומרים) עם טכנולוגיית מיון תאים ותאים נפרדים עם פלואורסצנטיות גבוהה בירוק ואדום.
5. העבירו תאים נבחרים לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל ותאי צנטריפוגה ב-252 x גרם למשך 5 דקות. הוסף גלולת תא לבקבוק T-25 עם 9 מ"ל של מצע גידול קו תאים יציב. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
  הערה: לאחר מיון התאים, יש לקבל שלוש אוכלוסיות חד-שבטיות (טבלה 1).
לאחר 24 שעות, הסר את המדיום והוסף 8 מ"ל מדיום טרי. חזור על הליך זה כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש.
הערה: כדי לחקור שטף אוטופגי, ניתן להשתמש בשני פקדים: רפמיצין כהתייחסות לאות שטף אוטופגי גבוה וכלורוקווין כהפניה לאות שטף אוטופגי נמוך. הכינו תמיסת מלאי רפמיצין של 10 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ותמיסת מלאי כלורוקווין של 30 מ"מ ב-H₂O ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כדי לבחור את האוכלוסייה החד-שבטית הטובה ביותר על ידי בדיקת הביטוי mCherry ו-GFP, ניתן להשתמש בשתי שיטות: ציטומטריית זרימה (שלב 1.10) או ניתוח תמונה פלואורסצנטית בעלת תכולה גבוהה (שלב 1.11).
ציטומטריית זרימה
1. זרע 2.5 x 10⁵ תאים לבאר מכל אוכלוסייה חד שבטית ב-12 צלחות באר לפחות 24 שעות לפני הטיפול ב-1 מ"ל של מצע גידול קו תאים יציב ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
2. ביום הטיפול, הסר את המדיום, הוסף 1 מ"ל של מדיום גידול קו תאים יציב בתוספת 2% FCS לבאר. הוסף 10 מיקרומטר רפמיצין ו-30 מיקרומטר כלורוקווין למצע הגידול היציב של קו התאים עם 2% FCS ודגר למשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
3. הסר מדיה, שטוף עם 1 מ"ל HBSS לבאר ושאף אותה.
4. הוסף 500 מיקרוליטר טריפסין בכל באר, דגר דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ונטרל את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית. מגרדים תאים ומעבירים אותם לצינורות חרוטיים.
5. צנטריפוגה של התאים ב-252 x g למשך 5 דקות ושואבת את הסופרנטנט. שטפו את כדורי התא עם 500 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט (PBS). צנטריפוגה ב -252 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
6. הוסף 500 מיקרוליטר של PBS, העביר תאים לצינורות ציטומטריה והזריק כל דגימה לציוד הציטומטריה. עבור כל תנאי, אסוף 10,000 אירועים.
7. כדי לבחור את האוכלוסייה החד-שבטית לפי ציטומטריית זרימה, השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לעורר EGFP ובלייזר 633 ננומטר עבור mCherry. לאחר מכן, קבע יחס של mCherry ו-EGFP פלואורסצנטי כדי לבחור את אוכלוסיית התאים עם שטף אוטופאגי גבוה ונמוך.
ניתוח תמונות פלואורסצנטיות בתוכן גבוה
1. זרע 4 x 10³ תאים מכל אוכלוסייה חד שבטית לבאר ב-384 לוחות באר (דופן שחורה/תחתית שקופה) במצע גידול בתוספת 10% FCS, 1% P/S ו-2.5 מיקרוליטר/מ"ל פורומיצין. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות לפני הטיפול.
2. הסר את המדיום והוסף 10 מיקרומטר רפמיצין ו-30 מיקרומטר כלורוקווין ב-50 מיקרוליטר של מצע גידול קו תאים יציב בתוספת 2% FCS לבאר. דגירה למשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
3. הסר מדיה, שטוף עם 50 מיקרוליטר HBSS לבאר ושאף אותה. תקן תאים עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להסיר את ה-PFA ולשטוף עם 50 מיקרוליטר HBSS לבאר.
4. כדי לזהות את גרעיני התא, יש לצבוע עם Hoechst 33342 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו צבע Hoechst 33342, שטפו עם 50 מיקרוליטר HBSS לבאר והוסיפו 50 מיקרוליטר PBS לבאר.
5. בצע איסוף נתונים וניתוח של שטף אוטופאגי המתקבל על ידי פלטפורמת HTS כמתואר בסעיף 3.
  הערה: הקריטריונים לבחירת האוכלוסייה החד-שבטית מבוססים על האם השטף האוטופאגי גדל או ירד עם רפמיצין או כלורוקווין, בהתאמה (טבלה 1). שיבוטים עם רמות גבוהות של ביטוי mCherry ו-GFP מתאימים יותר לכימות מדויק של ניתוח תמונה פלואורסצנטי בתוכן גבוה של שטף אוטופגיה.

2. בדיקת שטף אוטופאגי מבוססת תמונה בכונדרוציטים חיים

הערה: לאחר בחירת שיבוט, התחל את הבדיקה כדי לכמת שטף אוטופגי.

באמצעות פיפטה אלקטרונית כף יד של 384 ערוצים, זרע 4 x 10³ תאים של השיבוט שנבחר (שלב 1.11) לבאר לתוך 384 לוחות באר (דופן שחורה/תחתית שקופה) ב-50 מיקרוליטר של מדיום גידול קו תאים יציב בתוספת 10% FCS, 1% P/S ו-2.5 מיקרוליטר/מ"ל פורומיצין לבאר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות לפני הטיפול.
ביום הניסוי הכינו צלחת מרווח לתוספת תרכובת.
1. הוסף נפח של כל תרכובת/בקרות ומדיום גידול קו תאים יציב לצלחת המרווח באמצעות טכנולוגיית טיפול בנוזלים אקוסטיים ופיפטה אלקטרונית של 384 ערוצים, בהתאמה, כדי לקבל ריכוז מרווח.
  הערה: הבקרות בבדיקה זו כללו מדיום גידול קו תאים יציב בתוספת 2% FCS, 30 מיקרומטר כלורוקווין ו-10 מיקרומטר רפמיצין. ריכוזי המרווחים יהיו תלויים בריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, בבדיקה זו, כלורוקווין ורפמיצין נוספו ב-50 מיקרוליטר של מדיום גידול קו תאים יציב לכל באר כדי להשיג ריכוז מרווח של 300 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר, בהתאמה.
2. באמצעות רובוט שטיפת מיקרופלייט, שאב מדיום מלוח התא בצורה אוטומטית והוסף 45 מיקרוליטר של מדיום גידול קו תאים יציב בתוספת 2% FCS לבאר.
3. לאחר מכן העבירו 5 מיקרוליטר לבאר מלוח המרווח ללוחית הבדיקה כדי לקבל ריכוז סופי באמצעות תחנת עבודה אוטומטית אחרת לטיפול בנוזלים.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 16 שעות. בעזרת רובוט מכונת כביסה מיקרופלייט, שאפו את המדיום.
תקן תאים עם 50 מיקרוליטר של 4% PFA לבאר למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שוטפים עם 50 מיקרוליטר HBSS לבאר.
צבעו את הגרעינים עם Hoechst 33342 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו Hoechst 33342 ושטפו עם 50 מיקרוליטר HBSS לבאר.
הוסף 50 מיקרוליטר PBS לבאר. הלוח מוכן כעת לקריאה, איסוף נתונים וניתוח לאחר מכן.
הערה: פרוטוקול זה מתואר עבור סינון תפוקה גבוהה (HTS). עם זאת, אם משתמשים במעט תרכובות, ניתן להוסיף אותן באופן ידני, ללא מכשירים אוטומטיים. מניפולציה מינימלית של תאים וסופרנטנט באמצעות מכשירים מכוילים לטיפול בנוזלים ו/או פיפטות אלקטרוניות מאפשרות הכנה מוצלחת של חד-שכבות תרבית תאים לכימות שטף אוטופגיה על ידי ניתוח תמונה פלואורסצנטית בעלת תכולה גבוהה.

3. איסוף נתונים וניתוח שטף אוטופאגי

לרכישת נתונים, השתמש במערכת סינון תוכן גבוה (HCS) ובמיקרוסקופ אוטומטי, המאפשר רכישה וניתוח אוטומטי של תמונות על ידי אלגוריתם עיבוד תמונה.
כדי לפתח פרוטוקול רכישה, בחר מספר ערוצים וזמני חשיפה (טבלה 2) כדי לזהות את הגרעינים ואת היווצרותם של אוטופאגוזומים ואוטוליזוזומים במהלך אירועי שטף אוטופגי.
עבור כל באר, אסוף תמונות מארבעה שדות המכסים את פני הבאר ובארבע ערימות החל מ-8 מיקרומטר המופרדות על ידי מרחק עבודה של 0.2 מיקרומטר. צלם את התמונות באמצעות מטרה של פי 60 להדמיית תאים מפורטת.
נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המסופקת על ידי מיקרוסקופ HCS. כדי לפתח אלגוריתם פרוטוקול ניתוח חזק לניטור שטף אוטופגיה, בחר את השיטה המתאימה ביותר לפילוח אוטומטי של תמונות תאים ולזיהוי ספציפי של הכתמים המתאימים להפעלת LC3. בצע את רצף הניתוח הסופי על ידי הוספת שיטות, שלבי פילוח תאים והוראות כימות כמתואר להלן:
1. לחץ על אבן הבניין Find Nuclei ובחר את ערוץ הצבע הגרעיני Hoechst 33342. בחר שיטה ובחר את אוכלוסיית הפלט גרעינים.
2. לחץ על מצא את אבן הבניין של ציטופלזמה ובחר את ערוץ הצבע הציטופלזמי Fluorescein. בחר שיטה | סף אישי.
3. לחץ על אבן הבניין מצא ציטופלזמה (2) ובחר את ערוץ הצבע הציטופלזמי RFP. בחר שיטה | סף אישי.
4. לחץ על אבן הבניין של האוכלוסייה ובחר את גרעיני אוכלוסיית המחקר. בחר את השיטה Common filters (Remove border objects) ובחר את אוכלוסיית הפלט Nuclei Inside Borders.
5. לחץ על אבן הבניין Find Spots ובחר את ערוץ הסמן הספציפי Fluorescein. בחר את אוכלוסיית המחקר גרעינים בתוך גבולות ובחר את אזור המחקר ציטופלזמה. בחר שיטה ובחר את אוכלוסיית הפלט Spots Inside Borders.
6. לחץ על אבן הבניין Find Spots (2) ובחר את ה-RFP של ערוץ הסמן הספציפי. בחר את אוכלוסיית המחקר גרעינים בתוך גבולות ובחר את אזור המחקר ציטופלזמה (2). בחר שיטה ובחר את אוכלוסיית הפלט Spots (2) Inside Borders.
7. לחץ על אבן הבניין Calculate Intensity Properties ובחר את ערוץ הסמן הספציפי Fluorescein. בחר את אוכלוסיית המחקר גרעינים בתוך גבולות ובחר את אזור המחקר נקודה. בחר שיטה ובחר את מאפייני הפלט Intensity Spot Fluorescein Inside Borders.
8. לחץ על אבן הבניין Calculate Intensity Properties ובחר את RFP של ערוץ הסמן הספציפי. בחר את אוכלוסיית המחקר גרעינים בתוך גבולות ובחר את אזור המחקר נקודה (2). בחר שיטה ובחר את מאפייני הפלט עוצמה נקודתית (2) RFP בתוך גבולות.
9. לחץ על אבן הבניין הגדרת תוצאות , בחר גרעיני אוכלוסייה בתוך גבולות, בחר מספר אובייקטים של גרעינים (ממוצע), בחר כתמים בעוצמה יחסית פלואורסצאין - ממוצע לבאר, ובחר כתמי עוצמה יחסית (2) - RFP - ממוצע לבאר.
כדי לכמת שטף אוטופגי, השתמש באותה שיטה שתוארה קודם לכן לניתוח ציטומטריית זרימה¹¹. קבע את יחס mCherry/EGFP של כתמי עוצמה יחסית.
הערה: תאים עם שטף גבוה יותר הם פחות ירוקים, מה שמגדיל את יחס ה-mCherry/EGFP בתא. זיהוי וכימות מדויק של מספר משמעותי של האותות הרלוונטיים המגיעים מאירועי שטף האוטופגיה בתאים חשוב מאוד כדי לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לנטר שטף אוטופאגי בתאים על ידי אפנון פרמקולוגי או על ידי תגובת מתח תאית. כונדרוציטים אנושיים מונצחים (T/C28a2) שימשו לפיתוח קו תאים מדווח אוטופגיה באמצעות LC3 כמדווח פלואורסצנטי (mCherry-EGFP-LC3B) לאוטופגיה. איור 1 מציג את זרימת העבודה הסכמטית של בדיקת הסינון החל מפיתוח קו התאים המדווח על אוטופגיה בכונדרוציטים אנושיים (mCherry-EGFP-LC3-T/C28a2), ועד לאינדוקציה או עיכוב של שטף אוטופאגי על ידי אפנון פרמקולוגי, ולאחר מכן ניתוח הנתונים המבוצע באמצעות מיקרוסקופ הדמיה בתוכן גבוה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטופגיה פגומה היא סימן היכר חשוב של ניוון מפרקים הקשור להזדקנות, אך עדיין לא קיימים טיפולים מונעים או משני מחלה המכוונים לאוטופגיה לניוון סחוס². בהתחשב ברלוונטיות ובהשלכות הקליניות שלה, אוטופגיה הפכה ליעד עניין לגילוי ופיתוח תרופות, אם כי שיטות לניטור ישיר של שינויים במנגנון הומאוסטזיס מרכזי זה הוכחו כמאתגרות.

כאן, מתוארת בדיקה פנוטיפית מבוססת תאים לקביעת השטף האוטופאגי בכונדרוציטים אנושיים חיים. פלסמיד המכיל מדווח כפול על הפעלת אוטופג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spain, Plan Estatal 2013-2016 ו-Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 ו-PI17/02059, על ידי פלטפורמת Innopharma Pharmacogenomics המיושמת לאימות מטרות וגילוי תרופות מועמדות לשלבים פרה-קליניים, Ministerio de Economía y Competitividad. אנו מודים גם לקרן למחקר בראומטולוגיה (FOREUM) על תמיכתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תאים 100 מ"מ	צלחת תרבית תאים קורנינג	430167	צלחת תרבית תאים
12 בארות	קורנינג	353043	צלחת תרבית תאים
15 מ"ל צינור חרוטי	פלקון-קורנינג	352095	צינור חרוטי
24 בארות	קורנינג	351147	צלחת תרבית תאים
25 סמ"ר בקבוק	תרבית תאיםפלקון-קורנינג	353014	בקבוק תרבית תאים
384 בארות מנשא תאים	פרקין אלמר	6007550	צלחת תרבית תאים
6 בארות	קורנינג	351146	צלחת תרבית תאים
96 בארות	קורנינג	353077	צלחת תרבית תאים
טכנולוגיית טיפול בנוזלים אקוסטיים	Labcyte	−	https://www.labcyte.com
כלורוקווין	סיגמא-אולדריץ'	C6628	מעכב שטף אוטופאגי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO	D2650	דימבס
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)	לונזה, באזל, שוויץ	BE-604F	T/C28a2 מדיום גידול
חיוני מינימלי של נשר (EMEM)	ATCC	30– 2003	HEK 293-T17 גידול בינוני
FACSציטומטר קליבר	בקטון דיקינסון, קליפורניה	&מינוס;	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO	F9665	HEK 293-T17
סרום עגל עוברי (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010– 074	סרום
FuGene	Promega	E2691	תערובת לא ליפוזומלית של שומנים כשיטת אספקת פלסמיד ליצירת קו תאים מדווח אוטופגיה
כף יד אלקטרונית 384 ערוצים פיפטה	אינטגרה	&מינוס;	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Buffer
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	קו תאי כליה. תאים שימשו כדי להקל על אריזה רטרו-ויראלית
מערכת סינון בעלת תוכן גבוה	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	ניתוח תמונות צביעת DNA
	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
תחנת עבודה לטיפול בנוזלים	פרקין אלמר	ומינוס;	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
רובוט מכונת כביסה מיקרופלייט	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
אופטי-MEM® (1x)	Thermo Fisher Scientific	11058	Transfection medium
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, קיימברידג', MA	22418	פלסמיד
pCL-Eco	Addgene, קיימברידג', MA	12371	פלסמיד
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)	סיגמא-אולדריץ'	P0781	אנטיביוטיקה
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	MP Biomedicals 2810305		Buffer
Puromycin	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	P8833	אנטיביוטיקה
רפמיצין	Calbiochem, גרמניה	5053210	מפעיל שטף אוטופגי
תוכנה CellQuestPro	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
מסנני מזרק 0.45 μ m	קורנינג	CLS431220	מסנן סטרילי
T/C28a2	&;	ומינוס;	קו תאים של כונדרוציטים אנושיים
טריפסין	גיבקו של Life Technologies, קליפורניה	15400054	טריפסין בשימוש עם תאי T/C28a2
טריפסין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	SM-2002-C	טריפסין בשימוש עם תאי HEK 293-T17
VSV. G	Addgene, קיימברידג', MA	14888	פלסמיד

מדיום תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LC3 mCherry EGFP LC3B

בדיקה מבוססת שטף לזיהוי מודולטורים של אוטופגיה לדלקת מפרקים ניוונית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים