ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום (הומיאוסטזיס חלבון) יורדת במהלך ההזדקנות הרגילה, מה שמקל על תחילתן של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, חלבונים עם הרחבות פוליגלוטמין נוטים לצבירה, כפי שמדגים את חלבון הנטטין ואת התפרצות במקביל של מחלת הנטינגטון. ההידרדרות הקשורה לגיל של הפרוטאום נחקרה בהרחבה באמצעות אלגנים מהונדסים של Caenorhabditis המבטאים חזרות polyQ הותכו לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). מודל זה של בעלי חיים מהונדסים מסייע לכימות ישיר של הירידה הקשורה לגיל של הפרוטאום באמצעות הדמיית היווצרות מתקדמת של מוקדי פלורסנט (כלומר, אגרגטים של חלבונים) והתפרצות מאוחרת יותר של פגמים בקטר המתפתחים כתוצאה מקריסת הפרוטאום. יתר על כן, הביטוי של polyQ::YFP transgene יכול להיות מונע על ידי מקדמים ספציפיים לרקמות, המאפשר הערכה של פרוטאוסטזיס על פני רקמות בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. מודל זה נוח מאוד לניתוח גנטי, ובכך מספק גישה לכימות ההזדקנות המשלימה לבדיקות תוחלת חיים. אנו מתארים כיצד למדוד במדויק polyQ::YFP היווצרות מוקדים בתוך נוירונים או שריר דופן הגוף במהלך ההזדקנות, ואת תחילתו של פגמים התנהגותיים הבאים. לאחר מכן, אנו מדגישים כיצד ניתן להתאים גישות אלה לתפוקה גבוהה יותר, ויישומים עתידיים פוטנציאליים באמצעות אסטרטגיות מתפתחות אחרות לניתוח גנטי C. elegans.
מבוא
הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) מוגדר כיכולת התאית לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום. האתגר המובנה בפרוטוסטזיס הוא להבטיח שכל החלבונים מקופלים ומתוחזקים כראוי בקונפורמציה מקומית, המוגברת עוד יותר על ידי האופי המגוון של גודל החלבון, הרכב חומצות האמינו, קונפורמציה מבנית, יציבות, מחזור, ביטוי, מידור תת-תאי ושינויים1. Proteostasis נשמר באמצעות פעולה מתואמת של רשת פרוטאוסטטיקה גדולה, המורכבת מכ -2000 חלבונים ייחודיים, המסדירים סינתזה נכונה, קיפול, סחר והשפלה בתוך הפרוטאום2,3. רכיבי סוס העבודה של הרשת הפרוטאוסטאטית הם תשע משפחות עיקריות שלמלווים מולקולריים 4. כל רקמה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים
- בחר גנים מעניינים להיות מומת באמצעות RNAi מבוסס האכלה. רכישת מניות של HT115 E. coli המכיל את שיבוט RNAi של ריבית20. לחלופין, תת-תבודד את ה-CDNA של הגן המעניין לאתר הרב-תכליתי של הפלסמיד L4440.
הערה: כדי למנוע השפלה של dsRNA בתוך החיידקים, השתמש בזן HT115. זהו זן E. coli חסר RNase III עם פעילות פולימראז T7 בלתי ניתנת לניתון IPTG. עבור מחקרי פרוטאוסטזיס שאינם משתמשים RNAi מבוסס האכלה, ניתן להשתמש HT115 או OP50 E. coli על לוחות NGM סטנדרטיים. - הכן 5 x 6 ס"מ לוחות לכל מצב בדיקה. לניסויים באמצעות RNAi, לגרום לייצור dsRNA ב HT115 E. coliהשתנה . עבור מחקרים ללא RNAi, OP50 E....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ב C. elegans, מודל חוזר פוליגלוטמין כבר אינסטרומנטלי לזיהוי של גנים המסדירים את הרשת הפרוטאוסטלית. לדוגמה, הראינו בעבר כי הומיודומיין אינטראקציה חלבון קינאז (HPK-1),קופקטור תמלול, משפיע על פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות על ידי ויסות הביטוי של autophagy ומלוויםמולקולריים 31. מצאנו כי אובדן של HPK-1, או על ידי השתקת RNAi או ב- HPK-1 (pk1393) בעלי חיים מוטנטיים ריקים, מגדיל את מספר צבירי Q35::YFP המצטברים במהלך ההזדקנות. חיות שליטה בוגרות ביום 2 מציגות 18.0 ± .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההזדקנות מאופיינת בירידה הדרגתית בפרוטוסטזיס. פרוטאוסטזיס מתוחזקת על ידי מערכת מורכבת, הרשת הפרוטאוסטקטית, לשליטה מתואמת, דינמית, מגיבה ללחץ של קיפול חלבונים, השפלה ותרגום. מדוע פרוטאוסטזיס נכשל במהלך ההזדקנות אינו מובן היטב, אך אפיגנום מתפורר, ירידה בזינוק בתגובות הלחץ, ואובדן צליבה מפצה כל בקנה אחד עם התמוטטות זו. ב C. elegans, התמלול של צורות מרובות של תגובת מתח במהירות לרדת בתוך כמה שעות לאחר תחילת הרבייה עקב היווצרות של סימני כרומטין דיכוי בלחץ loci2,34
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לחברי מעבדת סמואלסון בעבר ובהווה על עזרתם בחידוד שיטה זו ו/או דיון שסייעו בפיתוח כתב יד זה. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס RF1AG062593 ו- R21AG064519. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 24 צלחות תרבית באר | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 מ"ל צלחות 96 בארות | גריינר ביו-וואן | #780286 | |
| 600 ומיקרו; L צלחות 96 בארות | Greiner Bio-One | #786261 | |
| משכפל צלחות 96 פינים | Nunc | 250520 | |
| אטם צלחת חדיר אוויר | VWR | 60941-086 | |
| אגר בקטריולוגי | Affymetrix/USB | 10906 | |
| בקטו-פפטון | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans ספריית שיבוט RNAi בחיידקי HT115- Ahringer | מקור: Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | ראה גם Kamath et al, Nature 2003. |
| C. elegans ספריית שיבוט RNAi בחיידקי HT115- Vidal | Source Bioscience | C. elegans משאב ORF-RNAi (Vidal) | ראה גם Rual et al, מחקר גנום 2004. ספרייה זו זמינה גם מ-Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| מחליפי כיסוי מיקרוסקופ זכוכית | VWR | 48404-455 | |
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (איזופרופיל בטא-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| צלחת מלבנית חד-בארית לא מטופלת, 128x86 מ"מ | תרמו-פישר | ||
| נתרן אזיד, CAS #26628-22-8 | סיגמא-אולדריץ' | S2002 | |
| מיקרוסקופ Zeiss Axio Imager M2m עם תוכנת AxioVision v4.8.2.0 | Zeiss לא ידוע | ||
| Zeiss StemiSV11 M2 מיקרוסקופ Bio Quad | Zeiss | לא ידוע |
מקורות
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
