מאמר שיטה

מודל של מחלות לב איסכמיות והשוואה מבוססת וידאו של התכווצות קרדיומיוציטים באמצעות קרדיומיוציטים נגזר hiPSC

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61104

⸱

5 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים מודל של מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes נגזר תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם, יחד עם שיטה להערכה כמותית של נזק לרקמות הנגרמת על ידי איסכמיה. מודל זה יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.

תקציר

מחלת לב איסכמית היא גורם משמעותי למוות ברחבי העולם. לכן זה היה הנושא של כמות עצומה של מחקר, לעתים קרובות עם מודלים בעלי חיים קטנים כגון מכרסמים. עם זאת, הפיזיולוגיה של הלב האנושי שונה באופן משמעותי מזה של הלב המכרסם, מדגיש את הצורך במודלים רלוונטיים קלינית כדי ללמוד מחלות לב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למודל מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes מובדיל מתאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPS-CMs) ולכמת את הנזק ואת הפגיעה התפקודית של cardiomyocytes איסכמי. חשיפה ל-2% חמצן ללא גלוקוז וסרום מגדילה את אחוז התאים הפצועים, אשר מצוין על ידי הכתמת הגרעין עם פרודיד פרופידיום, ומפחית את הכדאיות התאית. תנאים אלה גם להקטין את ההתכווצות של hiPS-CMs כפי שאושר על ידי ניתוח שדה וקטורי עקירה של תמונות וידאו מיקרוסקופיות. פרוטוקול זה עשוי לספק גם שיטה נוחה לסינון תרופות מותאמות אישית על ידי הקלת השימוש בתאי hiPS מחולים בודדים. לכן, מודל זה של מחלת לב איסכמית, המבוסס על iPS-CMs ממוצא אנושי, יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.

מבוא

מחלת לב איסכמית (IHD) מוכרת ברחבי העולם כגורם המוות המוביל, וההערכה היא כי היא אחראית ליותר מתשעה מיליון הרוגים בשנת 20161. השכיחות של מחלות לב וכלי דם ממשיכה לעלות, ונראה שהגלובליזציה תרמה לשכיחות של גורמי סיכון למחלות לב במדינות מתפתחות. לכן, המחקר של IHD הופך יותר ויותרדחוף 2.

מודלים ניסיוניים של מחלות לב וכלי דם הם קריטיים לחקר מנגנוני המחלה, דיוק האבחון, ופיתוח של טיפולים חדשים. מספר מודלים ניסיוניים הוצעו על ידי מעבדות רבות. יש חשיבות עליונה לבחור מודל עם יתרונות משמעותיים; היתכנות, חזרה ודמיון למחלות אנושיות הם גורמי מפתח בבחירה של מודלים למחלות לב וכלידם 3. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) הנושאים מוטציות ספציפיות הקשורות לקרדיומיופתיה הם אלטרנטיבה מבטיחה למודלים של בעלי חיים4. למרות אסטרטגיות רבות תוארו עבור קרדיומיוציטים גורם iPSCs5,6,77,8,9 , כאן אנומספקים שיטהפשוטה כדי לייצר מודל IHD באמצעות cardiomyocytes מובדיל hiPSCs, שבו מבחר מייגע של cardiomyocyte באמצעות סמנים אינו מיושם. בשיטה זו, cardiomyocytes נבחרים באופן פונקציונלי על ידי ניתוח התכווצות ספונטנית.

אינדוקציה של cardiomyocytes באמצעות hiPSCs מונע הקרבה בעלי חיים וניתוח קשה מבחינה טכנית. הקמת מודלים של בעלי חיים של IHD דורשת טכניקות כירורגיות מאתגרות10. הדמיה מושלמת של ההיבטים הפתופיזיולוגיים השונים של מחלות לב אנושיות כגון קצב לב ופוטנציאל פעולה מהפיזיולוגיה של מכרסמים היא כמעט בלתי אפשרית. יחד עם המוסריות והאתיקה של שימוש במודלים של בעלי חיים, פיתוח מודלים ניסיוניים חדשים מלבד מודלים של בעלי חיים הוא הכרחי. קרדיומיוציטים מובדילים מתאי IPS אנושיים לחקות טוב יותר את המצב הפיזיולוגי של הלב האנושי. בפרוטוקול זה, אנו מקימים מודל של IHD באמצעות cardiomyocytes נגזר מתאי hiPS (hiPS-CMs). במודל שלנו, מניעת חמצן וגלוקוז מובילה לירידה בכוח ההתכווצות ובכדאיות של hiPS-CMs. השיטה שלנו מספקת גישה חדשה למודל IHD ומדגימה פלטפורמה חדשה לחקר המחלה.

פרוטוקול

1. תרבות תחזוקה hiPSC

  1. מעיל צלחת תרבות שש בארות עם למינין(שולחן של חומרים).
    1. דילל למינין ל 0.5 μg/mL בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS).
    2. הוסף למינין מדולל לצלחת שש בארות בנפח של 2.0 מ"ל / גם.
    3. דגירה את הצלחת ב 37 ° C במשך 30 דקות.
  2. הסר את תמיסת ה למינין מהבארות.
  3. זרע hiPSCs ב 2 מ"ל של iPSC תחזוקה בינונית(טבלת חומרים)על הבארים מצופה בצפיפות של 3 × 104 תאים / גם מבלי לייבש את פני השטח.
  4. תת-תרבות ה-hiPSCs.
    1. הכן 0.5× אנזימי דיסוציאציה תא(טבלת חומרים)פתרון.
      1. לערבב 10 μL של 0.5 M אתילנדיאמין טטראצטי (EDTA) ו 10 מ"ל של PBS כדי להפוך 0.5 mM EDTA / PBS.
      2. לדלל 10 מ"ל של אנזימי דיסוציאציה של 1× תאים ל- 0.5× על-ידי הוספת 10 מ"ל של 0.5 mM EDTA/PBS.
    2. לשאוף את המדיום המשמש מהבארות.
    3. הוסף 2 מ"ל/באר של PBS כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן למחוק את PBS.
    4. הוסף 800 μL של 0.5× תאי אנזימי דיסוציאציה, דגירה התאים במשך 7 דקות ב 37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO2.
      הערה: ניתן להשתמש ב- 0.05% טריפסין-EDTA כדי לנתק תאים.
    5. הסר בעדינות את פתרון אנזימי × 0.5.
    6. לשטוף את התאים עם 2 mL PBS, ולאחר מכן להיפטר PBS.
      הערה: היה עדין מכיוון שהתאים ניתקו בקלות לאחר הוספת פתרון אנזימי דיסוציאציה של תאים.
    7. הוסף 1 מ"ל של iPS תחזוקה בינונית(טבלת חומרים)המכיל 10 μM Y-27632.
      הערה: הוספת Y-27632 מגדילה את שיעור ההישרדות של hiPSCs.
    8. תנתקו תאים באמצעות מגרד תאים, ואספו אותם בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    9. תספור את מספר התאים. התאם את צפיפות התא ל- 1.5 ×10 4 תאים/מ"ל על-ידי הוספת אמצעי תחזוקה iPS המכיל 10 μM Y-27632.
      הערה: אין להשתמש צנטריפוגציה כדי למנוע נזק לתא.
    10. זרע 2 מ"ל של תערובת תאים על צלחת 6-באר מצופה למינין (צפיפות סופית: 3 × 104 תאים / גם).
    11. דגירה התאים ב 37 ° C ב אינקובטור לח המכיל 5% CO2.
    12. החלף את מדיום התרבות במדיום תחזוקת IPS ללא Y-27632 בימים 1, 4, 5 ו- 6.
  5. תת-תרבות התאים ביום 7.
    הערה: תת-תרבות התאים ביום 7 כדי לעכב בידול אקראי של hiPSCs.

2. אינדוקציה של בידול הלב של hiPSCs

  1. מעיל צלחת תרבות 96-באר עם למינין(שולחן של חומרים).
    1. דילל למינין ל 1.675 μg / מ"ל עם PBS.
    2. הוסף את תמיסת למינין מדוללת לצלחת 96 באר בנפח של 0.1 מ"ל / גם.
    3. דגירה את הצלחת ב 37 ° C במשך 30 דקות.
  2. זרע hiPSCs על לוח 96-באר בצפיפות של 3 × 104 תאים / גם.
  3. להתרבות hiPSCs ב 37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO2.
    1. יום אחד לאחר מכן, להחליף את המדיום עם 200 μL / גם iPS צמיחה בינונית(טבלת חומרים).
    2. לשנות את המדיום כל יום במשך 2-3 ימים נוספים עד התאים להגיע 70%-80% confluency.
  4. החלת מדיה של בידול.
    1. לשאוף את המדיום בילה ולהחליף אותו לאט עם 200 μL / באר של חום מראש מדיום A(טבלת חומרים).
    2. מניחים את הצלחת ב-37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO2.
    3. לאחר 48 שעות, לשאוף את המדיום ולאט להחליף אותו עם 200 μL / באר של גימור מראש בינוני B(טבלת חומרים).
    4. מניחים את הצלחת ב-37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO2.
      הערה: חשוב מאוד שהמדיה של ההבידול תשמור על טריות. הם יאבדו בהדרגה את אפקט ההבידול שלהם, בדרך כלל בתוך שבועיים. במידת הצורך, aliquot בינוני טרי ולאחסן ב -20 °C.
  5. למרוח תחזוקת cardiomyocyte בינוני.
    1. לאחר 48 שעות, לשאוף את המדיום ולאט להחליף אותו עם 200 μL / באר של תחזוקת cardiomyocyte מראש(טבלת חומרים).
    2. מניחים את הצלחת ב-37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO2.
    3. החלף את מדיום בידול cardiomyocyte כל יומיים עד היום 30.
      הערה: חשוב שמשך היישום של מדיה בידול A ו- B מוגדר במדויק ל- 48 שעות כדי להבטיח את רצף הביטוי המדויק של גנים הנדרשים להבדיל.

3. חשיפה לאיכימיה

  1. לשלול את מדיום התרבות של חומרים מזינים וחמצן.
    1. הכינו את מדיום הנשר (DMEM) המותאם של דולבקו ללא גלוקוז וסרום.
    2. שאפפו את אמצעי התרבות מהבארות של צלחת 96 באר המכיל hiPS-CMs.
    3. להוסיף את המדיום מרוצה מקופח בארות בנפח של 200 μL / גם.
  2. מניחים את צלחת התרבות באינקובטור היפוקסי(טבלת חומרים).
  3. להחיש גז חנקן, ולשמור על ריכוז החמצן הפנימי ב 2% ו CO2 ריכוז ב 5% עבור 24 שעות.
  4. המשך לניתוחים הרצויים: למשל,תוואי יכולת קבילות, הערכת התכווצות או הערכת נזק תאי.

4. הערכת הכדאיות הסלולרית באמצעות תס"א MTT

  1. השתמש ערכת אסאי MTT(טבלת חומרים) כדי להעריך באופן כמותי את הכדאיות של תאים.
    הערה: חשיפה 1 mM מי חמצן ב DMEM עבור 1 h יכול לשמש כדי לגרום נזק לתאים (שליטה חיובית). חשיפה 0 mM מי חמצן ב DMEM יכול לשמש עבור השליטה השלילית.
    1. הוסף 10 μL של ריאה של MTT לתאים באמצעות pipettor חוזר.
    2. מערבבים בעדינות למשך דקה על שייקר מסלולי.
    3. דגירה התאים עבור 3-4 שעות ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור. לאחר הדגירה, formazan המיוצר בתאים יופיע כמו גבישים כהים בתחתית בארות.
    4. לאחר הסרת supernatant, להמיס את גבישי formazan מסיסים 100 μL של תמיסת דימתיל sulfoxide (DMSO). פתרון זה ימיס את גבישי הפורמזאן, וייצור תמיסה סגולה.
      התראה: DMSO יכול לגרות עיניים, מערכת הנשימה, ועור. ללבוש כפפות מתאימות והגנה על העיניים / הפנים.
    5. מדוד את הספיגה של כל דגימה באמצעות קורא מיקרו-פלטה באורך גל של 570 00 00 00 00 00:00:00,000 --&

5. הערכת התכווצות של IPS-CMs

  1. אם לא מותקן, להשיג תוסף תמונה Velocimetry תמונה תמונה11 https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv והתקן.
  2. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות שלב, להקליט את תמונות הווידאו של hiPS-CMs באמצעות 4× עדשה אובייקטיבית ב ~ 20 מסגרות לשנייה עבור ~ 10 s, ולשמור כמו "analyze.avi". לשם השוואה של התכווצות בין לפני ואחרי איסכמיה, לאשר כי המיקום של עניין נרשם.
    הערה: מיקרוסקופ עם שלב אוטומטי שימושי כדי למקד את מיקום העניין. קובץ הסרט צריך להיות בתבנית avi לניתוח מאוחר יותר. אם לא, המר את הסרט ל- .avi.
  3. צור מבנה תיקיות כפי שצוין באות 1. דוגמה של "joblist.txt" מצוין בקובץ משלים.
  4. נתח שדות וקטוריים דו-ממדיים דיסקרטיים של עקירה תאית.
    1. הפעל פיג'י (ImageJ)תוכנה 12,עבור אל תוספים > פקודות מאקרו > עריכה ופתיחה של "vector_analysis.ijm" (קובץ קידוד משלים).
    2. לחץ על הפעל. הניתוח יבוצע באופן אוטומטי.
      הערה: וקטורים עקירה D(x,y) מחושבים עבור כל 16 × 16 פיקסלים בין מסגרת ההפניה (המסגרת הראשונה) לבין כל המסגרות הבאות (מסגרות 1 לעומת 2, 1 לעומת 3, 1 לעומת 4 וכו'). התוצאה מחושבת עבור כל מסגרת ונשמרת כ- "vec_x.txt"(x הוא מספר מסגרת). וקטור של עקירה מקסימלית, M(x, y), מוגדר עבור כל זוג (x, y) כדלקמן:
      figure-protocol-1
      כאשר k מייצג את מספר המסגרת שבו | Dk (x,y)| = מקסימום [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x, y)|] ו- n מציין את המסגרת האחרונה. התוצאה נשמרת כ- "Max_vector.txt". | M(x, y)| מייצג את העקירה המרבית הנגרמת על ידי התכווצות קרדיומיוציט בנקודת הניתוח (x, y). ערך C של התכווצות ביחידות שרירותיות מחושב באופן הבא:
      figure-protocol-2
      ערך זה נשמר בעמודה 7, שורה 1 ב- "Max_vector.txt". C מייצג את סכום העקירה עבור כל (x, y). ככל שהחלק שבו העקירה בשל התכווצות שריר הלב גדולה, כך הערך של C גדול יותר. השדה הווקטורי של עקירה מקסימלית, M(x, y), מכוסה בתדמית ניגודיות פאזה של המסגרת הראשונה ("Phase_contrast.png") ושמור כ-"Overlaid.png". כמו סדר הגודל של וקטור העקירה מחושב בהתבסס על המסגרת הראשונה של הווידאו, עדיף עבור hiPS-CMs להיות במנוחה תקופה דיאטולי עבור המסגרת הראשונה.

6. הערכת נזק תאי באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. לדלל 1 תמיסת מ"ג/מ"ל של פרודיד פרופידיום ל 1:1,000 ב PBS.
  2. מכתים את התאים המנותקים עם פרודיד פרופידיום.
    1. שאיפה למדיום ולמקם אותו בצינור צנטריפוגה בגודל המתאים.
    2. צנטריפוגה הצינור ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות, בזהירות להסיר את supernatant כדי לא לאבד תאים מותזים.
    3. דגירה התאים עם תמיסת פרודיד propidium מדולל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות בחושך.
    4. צנטריפוגה הצינור ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות, בזהירות להסיר את supernatant כדי לא לאבד תאים מותזים.
    5. לשחזר את התאים ~ 1 מ"ל של PBS.
      הערה: חשוב לאסוף תאים צפים מנותקים מהמדיום כדי לכמת במדויק נזק תאי.
  3. תאים מחוברים כתם עם פרודיד פרופידיום.
    1. יש לשטוף תאים מצורפים פעמיים באמצעות PBS בעדינות ולאחר מכן בטל את PBS.
    2. דגירה התאים עם תמיסת פרודיד propidium מדולל במשך 15 דקות בחושך.
    3. לשאוף את תמיסת הפרופידיום אידיד.
    4. נתק את התאים באמצעות 0.25% ת'פסין. העבר את תמיסת התא לצינור צנטריפוגה.
    5. צנטריפוגה הצינור ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות, בזהירות להסיר את supernatant כדי לא לאבד תאים מותזים.
    6. לשחזר את התאים ~ 1 מ"ל של PBS.
  4. ערבב את התאים הצפים והמצורפים לניתוח מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנה (FACS).
  5. העבר את פתרון התא דרך מסנן 30 μm.
    הערה: העברת התאים למסנן חשובה מאוד למדידת FACS מדויקת.
  6. נתח את הדגימות באמצעות מערכת FACS.

7. אימונוסטיין

  1. תקן את דגימת התא.
    1. לשאוף למדיום התרבות.
    2. מוסיפים 4% פארפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
      הערה: פתרון paraformaldehyde טרי מומלץ קיבעון אופטימלי.
  2. לחלחל את התאים עם 0.2% Triton X-100 במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את reagent.
  3. הוסף 3% אלבומין סרום בשר כדי לחסום את התאים במשך 30 דקות.
  4. החל נוגדן ראשי.
    1. השליכו את תמיסת אלבומין של סרום השור מצלחת התרבות.
    2. דגירה התאים עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את פתרון הנוגדנים.
    4. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
  5. החל נוגדן משני.
    1. בטל פתרון PBS מצלחת התרבות.
    2. דגירה התאים עם נוגדנים משניים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: נוגדן מונוקלונלי אנטי לב ראשי נגד לב (TNNT2) עכבר משמש ים של 1:750 ב 3% BSA. הנוגדן נגד העכברים התיזים המשני אלקסה פלור 488 מדולל ל 1:1,000 ב 3% BSA.
  6. כתם נוסף של גרעין וסיבים אקפטין.
    1. הסר את פתרון הנוגדנים.
    2. דגירה התאים בגרעין מכתים רייגנט (טבלת חומרים) וactin כתמים רייגנט (טבלת חומרים) ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: 4', 6-diamidino-2-פנילידול (DAPI) או Hoechst 33342 יכול לשמש לכתמים גרעיניים.
    3. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
  7. צלם תמונות פלואורסציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסציטי.

תוצאות

תאים מובדילים בהצלחה להראות התכווצות ספונטנית מתחת למיקרוסקופ (וידאו 1). בדרך כלל, 50% של בארות להראות התכווצות ספונטנית <20 ימים(איור משלים 1). חלבון סמן לב (למשל, cTnT) יכול לשמש כדי לאשר בידול מוצלח(איור 2).

בדרך כלל, תאים מהקבוצה האיסכמית מראים קתנות נמוכה יותר ב- MTT assays (איור 3A) והתכווצות (איור 3E, F, איור משלים 2) מאלה של קבוצת בקרה נורנוקסית. כמו כן, היחס בין תאים חיוביים-פרודיד פרופידיום גבוה יותר בקבוצה האיסכמית מאשר בקבוצת הביקורת(איור 3B-D),המציין נזק תאי גבוה יותר.

figure-results-1
איור 1: מבנה תיקיות לניתוח וקטור עקירה באמצעות imageJ.
"joblist.txt" מתאר נתיב לקבצי סרטים בכל שורה. אם יש שלושה קבצים לנתח, יהיו שלוש תיקיות (movie1, movie2 ו- movie3), שבו "analyze.avi" (הסרט של עניין) צריך להיות ממוקם. לאחר ביצוע הניתוח על-ידי קוד "vector_analysis.ijm", קבצים ייווצרים (המצוינים בכחול) בכל תיקיית סרט. מידע המאוחסן בכל קובץ מוסבר בפירוט בטקסט הראשי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: תמונה מייצגת של כתמי סמן לב.
ביטוי של חלבון סמן לב טרופונין T (cTnT). כחול: 4', 6-diamidino-2-פנילינדל (DAPI), אדום: actin, ירוק: cTnT. Inset: ביטוי מנוקב של cTnT, אשר מתאים למבנה sarcomere. סרגל קנה מידה, 50 μm. נתון זה שונה מ-Wei et al.13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: תמונות מייצגות של תסה של יכולת הכדאיות הסלולרית, הערכת נזק תאי והתכווצות.
(א) השוואה של הכדאיות הסלולרית (MTT assay). ספיגה גבוהה יותר מצביעה על יכולת קתית גבוהה יותר. n = 5 עבור כל תנאי. (B, C ו-D) ניתוח ציתומיה זרימה של תאים מוכתמים ב-19 00:00:00,000 --&00:00,000 --&00:00,000 --&00 תאים איסכמיים להפגין עוצמת פיזור קדימה מופחתת ופלואורסצינציות PI מוגברת, לעומת השליטה. (ד) אחוז התאים המוכתמים ב- PI בניתוח ציתומיה זרימה. n = 3 עבור כל תנאי. (ה) ניתוח של כיווץ iPS-CMs באמצעות תוכנת ImageJ. הווקטורים האדומים והכחולים מצביעים על הצירים הגדולים והקטנה ביותר, בהתאמה. סרגל קנה מידה, 100 μm. (ו) ניתוח כמותי של התכווצות iPS-CM באמצעות קוד. n = 3 עבור בקרה ו- n = 8 עבור מצב איסכמי. קווי שגיאה מייצגים שגיאה רגילה של ממוצע. לצורך הניתוח הסטטיסטי, בוצע מבחן T של תלמיד דו-זנב שלא שולם. *: p < 0.05, **: p < 0.01. : p < 0.0001. נתון זה מצוטט מ-Wei et al.13 אנא לחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

וידאו 1: תאים מובדילים מראים התכווצות ספונטנית מתחת למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

איור משלים 1: ניתוח קפלן-מאייר של אחוז הדגימות ללא התכווצות ספונטנית. 50% מדגימות IPS-CM הראו התכווצות ביום ה-20. ביום ה-30, 64.4% מהדגימות הראו התכווצות. n = 83. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 2: הערכת התכווצות הלב. התכווצות קנה מידה שהושגה על ידי חלוקת התכווצות C על ידי מספר נקודות ניתוח (x, y) היה התווה עבור קבוצות שליטה ואיסכמיות לפני ואחרי החשיפה 24 h היפוקסיה. n = 3 עבור בקרה ו- n = 8 עבור מצב איסכמי. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 3: הערכת התוכן של cardiomyocytes. אימונוסטיין של חלבון סמן לב על צלחת 96 באר. ירוק: cTNT, כחול: DAPI. שיעור התאים המבדילים חושב כ- 20.7 ± 9.6% על-ידי חלוקת האזור המוכתם ב- cTnT על-ידי האזור המוכתם ב- DAPI. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. n = 4 עבור תנאי בקרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

קובץ קידוד משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

חוקרים משתמשים לעתים קרובות במודלים של בעלי חיים קטנים במעבדה כדי לערוך ניסויי IHD. כאן, פיתחנו מודל תרבות תאים של IHD אנושי כדי לבצע ניסויים כאלה.

הבעיה העיקרית שמשתמש בפרוטוקול זה עשוי להתמודד היא שיעור נמוך של cardiomyocytes מופלל. מספר צעדים יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשפר את קצב ההבידול המוצלח: (א) להיות עדין בעת pipetting כי התאים בקלות להתנתק לאחר תוספת של reagent אנזימי דיסוציאציה התא, (ב) הוספת Y-27632 מגבירה את שיעור ההישרדות של תאי iPS בעת ניתוק, ו-(ג) התזמון של שינויים בינוניים בתחילת ההבידול צריך להיות בדיוק 48 שעות זה מזה כדי להבטיח ביטוי מבוקר של גנים המעורבים בידול.

לגבי חלבוני מטריצה חוץ תאיים המשמשים לציפוי פני השטח של צלחת תרבות, חומרים אחרים מאשר למינין שהשתמשנו בפרוטוקול זה יכולים לשמש. לדוגמה, Matrigel14,15וג'לטין16,17 משמשים לתרבות התחזוקה ללא מאכילים של hiPSCs. על פי Haraguchi ואח ', hiPSCs זרעו על Matrigel היו בהצלחה הבדיל לתוך גיליון תא לב18.

ישנם מספר מחקרים קודמים לגבי מודלים תרבותיים עבור מידול מחלה באמצעות cardiomyocytes נגזר hiPSCs. לגבי מידול של פגיעה איסכמיה-reperfusion, מניפולציות של הסביבה התאית, כגון היפרקלמיה, חסה, והצטברות הקטאט,הוצגו 19. שיטות אחרות כוללות כדוריות תאים כדי לעכב את דיפוזיהחמצן 20 ועיכוב חילוף החומרים באמצעות ציאניד21. בפרוטוקול הנוכחי, פגיעה בתא הושגה על ידי שיטה פשוטה יחסית, כלומר 24 h מחסור של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, יש לנקוט בטיפול כדי לשקול תהליכים פתופיזיולוגיים מדויקים של מחלת הלב האיסכמית, כפי שאכן יש הבדלים בין המחלה vivo מודל המחלה של הפרוטוקול הנוכחי, כגון נוכחות או היעדר של סביבה תאית תלת מימדית ודם.

לגבי ההיבט הטכנולוגי של הערכת תפקוד cardiomyocyte, Toepfer ואח' דיווח אלגוריתם מבוסס MatLab כדי לקבוע התכווצות sarcomere והרפיה hiPS-CMs22. סמית' דיווח על שיטה מתקדמת של ניתוח אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה של תאים מעוררי רגש הנגזרים מ-hiPS-CMs, תוך שימוש במערכים רב-תכליתיים מתוחכמים בעלידוגמאות ננוטופוגרפיות 23,,24. היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שזה דורש רק תוכנה קונבנציונלית חומרים מתכלים, כגון תוכנת imageJ וצלחות 96-באר.

ביחס לרמת החמצן בלב, לחץ החמצן בורידים שמגיעים ללב נחשב 40 mmHg25. על פי מקדוגל ואח ', לחץ חמצן חוץ תאי תחת היפוקסיה מוערך להיות <12.8 mmHg26. על ידי החלת השיטה של סיבובים ואח'27 , לחץ החמצןבמדיום התרבות (מליחות: 35,) תחת המצב hypoxic (2% חמצן) ב 37 °C מטופל עם הפרוטוקול הנוכחי מחושב להיות 14.9 mmHg, שהוא גבוה יותר מאשר ההערכה לעיל. באופן מעניין, דיווח אל-אני ואח' כי יהיה הדרגתי של לחץ חמצן במדיום התרבות, ולחץ החמצן מושפע מסוג התא, מצפיפות הזרעים ובנפחבינוני 28. בדרך כלל, ריכוז החמצן בתחתית צלחת התרבות שבה תאים מתגוררים הוא הנמוך ביותר. לכן, ההשפעה של עומק במדיום התרבות תפחית עוד יותר את לחץ החמצן היעיל ליד hiPS-CMs. על מנת לגרום נזק מספיק hiPS-CMs באמצעות מצב היפוקסי, יש לשלם תשומת לב זהירה לעומק של בינוני וצפיפות של תאים.

דגם hiPS-CM שלנו, אשר קרוב מאוד לתנאים הפיזיולוגיים של מיוציטים לב אנושיים, מחקה יתרון IHD אנושי. גישות מבוססות מודל של בעלי חיים כוללות סוגיות אתיות, טכניות ואקדמיות. במיוחד, במודלים vivo דורשים טכניקה מתקדמת של מיקרוכירורגיה כדי להשיג נתונים לשחזור: למשל, חסימה של הענף הקדמי יורד של העורק הכלילי השמאלימכרסמים 3. דגם hiPS-CM המתואר בזאת מתגבר על מחסומים קריטיים אלה ומספק פלטפורמה שימושית, רלוונטית וחוזרת על עצמה למחלות לב וכלי דם.

עם זאת, יש ל ציין כמה מגבלות. הבדל ברור בין cardiomyocytes המושרה על ידי IPS ו cardiomyocytes נורמלי הוא היעדר T-tubules29, ואנחנו לא כוללים גורמים הומוריסטיים כגון נזק לרקמות המושרה על ידי leukocytes והפעלה של מערכת משלימה במחקר שלנו. יתר על כן, שיעור cardiomyocytes מופללים במודל זה (20.7 ± 9.6%, דמות משלימה 3)יש לשפר. הפרסום האחרון על ידי Halloin ואח 'מתאר מדרגי, שיטה כימית מוגדרת כדי לגרום hiPS-CM טוהר של >95% על ידי אפנונים מסלול WNT כימי ללא דרישה של כל בחירה על ידי סמנים30. אף על פי כן, המודל שלנו של IHD אנושי הוא פשוט יחסית וישים קלינית (למשל, סינון תרופות באמצעות תאי IPS נגזר המטופל). המודל שלנו הוא גם פלטפורמה ייחודית להכללת מנגנונים בסיסיים של מזהי IHD.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI, הקרן לקידום מחקר בינלאומי משותף (טיפוח מחקר בינלאומי משותף), 17KK0168. המחברים מכירים בהכרת תודה מעבדת המחקר המרכזית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אוקאיאמה לסיוע של FACS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב צביעת אקטין (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent)Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בR37112
נוגדן טרופונין T נגד לבThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בMA5-12960
מדיום תחזוקת קרדיומיוציטים (ערכת בידול קרדיומיוציטים PSC)Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בA2921201
אנזימי דיסוציאציה של תאים (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA12563011
מדיום התמיינות A (ערכת התמיינות קרדיומיוציטים PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
מערכתFACS Aria IIIBD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב
מיקרוסקופ פלואורסצנטיKEYENCE, אוסקה, יפןBZ-X710
עז נגד עכבר Alexa Fluor 488 נוגדן משניThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בA28175
תאי iPS אנושייםRIKEN, צוקובה, יפן201B7
אינקובטור היפוקסיSANYO, אוסקה, יפןMCO-175M
מדיום גידול iPSC (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"בA1517001
מדיום תחזוקה iPSC (StemFit AK02N)Ajinomoto, טוקיו, יפןRCAK02N
למינין (iMatrix-511)Nippi, טוקיו, יפןערכת בדיקת iMatrix-511
MTT (ערכת בדיקת התפשטות תאים MTT)חברת קיימן כימיקלים, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב10009365
מגיב צביעת גרעין (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent)תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"בR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, קיוטו, יפן35501-02

מקורות

  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94(2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590(2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666(2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269(2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiomyocytes hiPSCPIV

מאמרים קשורים