הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

5.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61110

⸱

21 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Montpellier, INSERM, Institut des Neurosciences de Montpellier, 2Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 3Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, MIRCen, Laboratoire des Maladies Neurodégénératives, 4Laboratory for Optics and Biosciences, Ecole polytechnique, CNRS, INSERM, IP Paris

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אסטרוציטים לפרוש את קליפת המוח באופן אחיד, מה שהופך את הניתוח של המורפולוגיה המורכבת שלהם מאתגר ברמה התאית. הפרוטוקול המסופק כאן משתמש בתיוג צבעוני המבוסס על אלקטרופורציה ברחם כדי לבודד אסטרוציטים קליפתיים ולנתח את נפחם ומורפולוגיה שלהם עם צינור ניתוח תמונה ידידותי למשתמש.

תקציר

אסטרוציטים פרוטופלזמיים (PrA) הממוקמים בקליפת המוח של העכבר הם צמודים זה בזה, ויוצרים מטריצה תלת מימדית רציפה לכאורה בשלבים למבוגרים. עד כה, שום אסטרטגיה חיסונית לא יכולה לבודד אותם ולחלק את המורפולוגיה שלהם בבעלי חיים בוגרים ובמהלך הקורטיקורטיקוס. מקורו של PrA קליפת המוח מאבות הממוקמים בפאליום הגבי וניתן לכוון אותו בקלות לשימוש באלקטרופורציה של וקטורים אינטגרטיביים ברחם. פרוטוקול מוצג כאן כדי לתייג תאים אלה עם צבע רב תכליתי שילוב הגנום (MAGIC) סמנים אסטרטגיה, המסתמך על piggyBac / Tol2 טרנספוזיציה ו Cre /lox recombination כדי לבטא stochastically חלבונים פלואורסצנטיים נפרדים (כחול, ציאן, צהוב, ואדום) ממוען לתאים תת תאיים ספציפיים. אסטרטגיית מיפוי גורל צבעונית זו מאפשרת לסמן באתרו אבות קליפתיים סמוכים עם שילובים של סמני צבע לפני תחילת הגליוגנזה ולעקוב אחר צאצאיהם, כולל אסטרוציטים, החל בשלבים עובריים ועד בוגרים ברמת התא הבודד. תיוג דליל למחצה שהושג על ידי התאמת הריכוז של וקטורים אלקטרופולציה וניגודי צבע המסופקים על ידי סמני צבע משולבי גנום רב-תכליתיים (סמני MAGIC או MM) מאפשרים להתאים אישית אסטרוציטים ולבודד את הטריטוריה והמורפולוגיה המורכבת שלהם למרות הסידור האנטומי הצפוף שלהם. להלן זרימת עבודה ניסיונית מקיפה הכוללת את פרטי הליך האלקטרופורציה, רכישת ערימות תמונה רב-ערוציות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ופילוח תלת מימדי בסיוע מחשב שיאפשר לניסוי להעריך נפח PrA ומורפולוגיה בודדים. לסיכום, אלקטרופולציה של סמני MAGIC מספקת שיטה נוחה לתייג בנפרד אסטרוציטים רבים ולקבל גישה לתכונות האנטומיות שלהם בשלבים התפתחותיים שונים. טכניקה זו תהיה שימושית כדי לנתח תכונות מורפולוגיות אסטרוציטים קליפת המוח במודלים שונים של העכבר מבלי להזדקק צלבים מורכבים עם קווי כתב מהונדסים.

מבוא

אסטרוציטים לשחק פונקציות חיוניות רבות בהתפתחות המוח ופיזיולוגיה1. לצד תפקידם במחסום הדם - מוח שבו הם מווסתים את ספיגת החומרים המזינים ואת זרימת הדם, הם תורמים באופן פעיל להיווצרות ותפקוד הסינפסה תוך הפקת נוירומודולטורים שיכולים לשנות פעילות עצבית והתנהגות2. יתר על כן, תפקוד לקוי של אסטרוציטים תורם למגוון הפרעות נוירולוגיות3. אסטרוציטים הממוקמים בקליפת המוח מציגים מורפולוגיה משוכללת המאפשרת מגע נרחב עם תהליכים עצביים. מגעים אלה, חיוני לתפקוד מעגלי, שולטים גם במורפוגנזה אסטרוציטים ובסינפטוגנזה באמצעות חלבוני הידבקות בתאים4. מדעני מוח זקוקים לכלים נוחים וחזקים כדי לחקור התפתחות אסטרוציטים ומורפוגנזה במודלים הנוירולוגיים שלהם של עניין. עם זאת, בשל ההחמרה הקרובה של אסטרוציטים לשכניהם וריצוף תלת מימדי אחיד שלהם, זה מאתגר לבודד אסטרוציטים קליפת המוח ולהעריך באופן מקיף את המורפולוגיה שלהם באמצעות immunomarkers.

נכון לעכשיו, שתי אסטרטגיות הנדסה גנטית עיקריות מאפשרות תיוג ואינדיבידואליזציה של אסטרוציטים קליפת המוח במקום: הפעלת כתב דליל בקווי עכבר מהונדסים או טרנסגנזה סומטית באמצעות אלקטרופורציה של פלסמידים כתב. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הרבייה של קו עכבר כתב floxed עם עכברים המבטאים צורה בלתי ניתנת להסבר של Recombinase Cre המופעל במיוחד אסטרוציטים על משלוח טמוקסיפן (למשל, Aldh1l1-CreERT25). מספר חסרונות קשורים לאסטרטגיה זו. ראשית, הרבייה של עכברים מהונדסים דורשת מספר רב של בעלי חיים ובדרך כלל יש צורך במבחנים מרובים כדי לקבוע את המינון הנכון של טמוקסיפן כדי לספק תיוג דליל כראוי של אסטרוציטים קליפת המוח. ניתוח פנוטיפים אסטרוציטים קליפת המוח במודל עכבר גנטי של עניין ידרוש אפילו יותר רבייה וצריכת עכבר. יתר על כן, בהזרקת טמוקסיפן הרחם ידוע להפריע parturition, מה שהופך אסטרטגיה זו קשה ליישם את המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות אסטרוציטים. In vivo DNA electroporation היא אסטרטגיה חלופית ללא טמוקסיפן המסתמכת על מספר מינימלי של בעליחיים 6. גישה זו, המבוצעת בשלבים עובריים או לאחר לידה, מורכבת מהזרקת פלסמידים עיתונאיים בחדרים הצדדיים של מכרסמים ואחריו פולסים חשמליים היוצרים נקבוביות בקרום התא, ומכאן מאפשרים לדנ"א להיכנס לתאי אב המצפים את החדר. לאחר מכן, transgenes הכתב נישא על ידי פלסמידים electroporated מעובדים על ידי מכונות התא ממוקד והביע7. שתי שיטות electroporation תוארו בעבר לתייג אסטרוציטים קליפת המוח של העכבר: 1) תיוג אסטרוציטים לאחר הלידה על ידי Electroporation (PALE), המסתמך על electroporation של 1-2 פלסמידים כתב אפיזומלי צבע יחיד בשלבים מוקדמים לאחר הלידה4; 2) האסטרטגיה StarTrack מבוסס על electroporation הרחם (IUE) של פלסמידים כתב אינטגרטיבי צבע יחיד מרובים8,9,10. למרות שתי טכניקות אלה ביעילות תווית PrA בקליפת המוח, הם גם מציגים כמה מגבלות. בגרסה הראשונית שלהם, שתי השיטות מסתמכות על חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP) מקדם לנהוג ביטוי אסטרוציטים, אשר עשוי להטות את התיוג לכיוון גליה רדיאלי, כמו גם אסטרוציטים פייאל תגובתי המבטאים GFAP חזק יותר מאשר מנוחה רגילה PrA11,12. לגבי PALE, חסרונות אחרים הם השלב המאוחר של electroporation, אשר מונע תיוג של פרה בגיל הרך (או אלה שמקורם אבות delaminating מוקדם) וניתוח של שלבים מוקדמים של התפתחות אסטרוליה, ושימוש וקטורים אפיזומליים שהופכים מדוללים באמצעות חטיבות רצופות במהלך התפשטות מסיבית כי פרה לעבור במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה13,14. בניגוד ל- PALE, StarTrack מבוסס על אלקטרופוציה עוברית של פלסמידים עיתונאיים אינטגרטיביים המאפשרים מעקב אחר תרומתם של אבות עוברים ואחרי לידה ל- PrA. תוכנית StarTrack מעודכנת המסתמכת על מקדם Ubiquitin C (UbC-StarTrack) משיגה ביטוי רחב יותר של כתבים פלואורסצנטיים הן בירידה העצבית והן בירידה הגלית (כולל אסטרוציטים) של אבות עצביים15,16,17. עם זאת, בגרסתה הנוכחית, יישום גישה זו הוא מורכב, שכן הוא מסתמך על תערובת שווה של 12 פלסמידים נפרדים המבטאים שישה חלבונים פלואורסצנטיים (FP) עם עירור חלקי וחפיפת ספקטרום פליטה.

מוצג כאן הוא פשוט בשיטת תיוג multicolor מבוססי אלקטרופורציה הרחם באמצעות מבני כתב אינטגרטיבי מונע על ידי מקדם חזק ופעיל באופן נרחב כדי לבודד אסטרוציטים קליפת המוח14. בנוסף, צינור ניתוח תמונה קל באמצעות מורשה (למשל, Imaris) וגישה פתוחה (Vaa3D18,19,20) תוכנת ניתוח תמונה מסופקת לפלח נפח טריטוריאלי אסטרוציטים ו arborization, בהתאמה. בהשוואה לשיטות שתוארו לעיל, אסטרטגיה זו מסתמכת אך ורק על 1-2 טרנסגנים אינטגרטיביים צבעוניים מרובי סמני צבע משולבי גנום (סמני MAGIC או MM21) המופנים לתא התא הגרעיני הציטופלסמי (אופציונלי) שביטויו מונע על ידי מקדם CAG סינתטי המורכב משפר ציטומגלווירוס, מקדם העוף β-actin, ואתר מקבל β-גלוביןsplice 22. זה מאפשר תיוג ומעקב של אסטרוציטים קליפת המוח, מעובר לשלבים מאוחרים לאחר הלידה, ללא תלות ביטוי GFAP14,23. כל אחד מהטרנג'ינים האלה נושא את ארבעת ה-FP השונים הבאים: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP ו- tdTomato/mCherry, המציגים חפיפה ספקטרלית מינימלית שניתן לעקוף בקלות עם 1) רכישת ערוצים רציפים; 2) כוח עירור ממוטב ורווח איסוף; ו-3) מסננים דיכריים ספציפיים לאיסוף חלונות פליטת FP צרים. אסטרטגיית MM משתמשת רקומבינציה Cre /lox עם recombinase Cre עצמית excisable (seCre) כדי להניע ביטוי סטוכסטי של FP באוכלוסייה הסלולר. עותק יחיד של MM transgene מבטא את ה-FP באופן בלעדי הדדית, בעוד שטרנסג'ינים מרובים יוצרים שילובי FP ויוצרים עשרות גוונים שונים. אינטגרציה גנומית של הטרנסגנס מונעת על ידי מערכת טרנספוזיציה PB (PB) או Tol224,25,26. לכן, באמצעות electroporation הרחם, ערכת הכלים MM ואת "פסיפס" צבעוני שהיא מייצרת לאפשר סימון בו זמנית של אבות קליפת המוח הסמוכים מרובים ואת המעקב אחר הירידה הגלית שלהם, כולל אסטרוציטים קליפת המוח, על פני תקופות ארוכות. ניגודי צבעים הנובעים מהביטוי של חלוקה ברורה של FP היתר מתאר של קווי המתאר של PrA ולאחר מכן לחלץ מידע מפתח על נפח טריטוריאלי שלהם (באמצעות IMARIS) ומורפולוגיה מורכבת (באמצעות Vaa3D). האסטרטגיה הצבעונית המוצגת בפירוט כאן היא שיטה נוחה וחזקה המעניקה גישה מהירה וקלה למשטח האסטרוציטים הקליפתיים והמורפולוגיה בעכברים מסוג בר בשלבים התפתחותיים שונים, וקל להסתגלה לחקירת תכונות אנטומיות אסטרוציטים במודלים של עכברים של מחלות נוירולוגיות מבלי להשתמש בקווי כתב מהונדסים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. פרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי המועצה האתית לניסויים בבעלי חיים של צ'ארלס דרווין (CEEACD / N ° 5).

1. הכנת פלסמידים נטולי אנדוטוקסין לסמני MAGIC באלקטרופורציה של הרחם

  1. טרנספורמציה חיידקית
    1. על הקרח, להפשיר DH5 תאים מוסמכים אלפא מאוחסן ב -70 מעלות צלזיוס.
    2. לחמם את צלחות אגר המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (100 מיקרוגרם / מ"ל אפיצילין או 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin) ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 1 μL של 5-50 ng של DNA פלסמיד סמני MAGIC ב 10 μL של תאים מופשרים DH5 אלפא מוסמך דגירה על קרח במשך 10 דקות ללא ערבוב.
    4. לשינוי הלם החום, מניחים את aliquot באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ולאחר מכן מניחים מיד על קרח ולחכות 3-5 דקות.
    5. בתנאים סטריליים, להוסיף 230 μL של בינוני SOC דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F).
    6. מורחים את תכולת האליקוט מעל צלחת הגר ומדגרים במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. תרבות פלסמיד
    1. למחרת בבוקר, בתנאים סטריליים, להרים מושבה מצלחת אגר ולשים אותו בצינור 14 מ"ל המכיל 2 מ"ל של LB בינוני עם אנטיביוטיקה מתאימה. תן לו לדגר במשך היום ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב 300 סל"ד.
    2. בסופו של דבר, זרע 300 מ"ל של LB עם אנטיביוטיקה באמצעות תרבות המתנע 2 מ"ל משלב 1.2.1 ו הדגירה לילה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור רועד ב 300 סל"ד.
  3. הכנת דנ"א פלסמיד
    1. למחרת בבוקר להמשיך עם טיהור של סמני MAGIC פלסמיד DNA (כלומר, PB-CAG-Cytbow ו Tol2-CAG-Nucbow, כמו גם CAG מונחה פלסמידים המבטא PB ו Tol2 transposases ו Cre recombinase) באמצעות ערכת maxiprep ללא אנדוטוקסין בעקבות פרוטוקול היצרן.
    2. יש ללטף את הדנ"א ב-200 מיקרו-ל' של מים סטריליים ולהעריך את ריכוזו באמצעות ספקטרופוטומטר לפני האחסון ב-20°C.C.

2. הכנה לסמני קסם באלקטרופורציה של הרחם (MM IUE)

  1. הכנת פתרון
    1. חם 30 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ולשמור אותו חם במהלך כל משך הניתוח.
    2. הכינו תערובת פלסמיד המכילה PB-CAG-Cytbow ו- Tol2-CAG-Nucbow (ריכוז סופי, 0.8 מיקרוגרם / μL כל אחד), PB ו Tol2 transposases (ריכוז סופי, 0.4 מיקרוגרם / μL כל אחד), CAG-seCre (ריכוז סופי, 0.16 מיקרוגרם / μL), ו 0.01% צבע ירוק מהיר ב- PBS ללא Ca2 + ו מ"ג2 +.
      הערה: למטרות שחזור אנטומי אסטרוציטים, ניתן להשמיט את מבנה Tol2-CAG-Nucbow. עם זאת, פלסמיד זה שימושי כדי להבחין זוגות של אסטרוציטים צמודים וכאשר משתמשים סמני MAGIC כדי לחקור יחסי שיבוטיםבין אסטרוציטים 14.
    3. הכן פתרון הרדמה המכיל 100 μL של קטמין (100 מ"ג / מ"ל) ו 100 μL של xylazine (20 מ"ג / מ"ל) מדולל ב 2 מ"ל של תמיסת מלח.
    4. הכן פתרון משכך כאבים על ידי דילול 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine מלאי פתרון 1:10 בתמיסת מלח.
  2. הכנת חומר הניתוח
    1. לעקר את הכלים הכירורגיים (ראה טבלה של חומרים)בטמפרטורה גבוהה בחומר חיטוי חרוזי זכוכית או שווה ערך.
    2. מניחים טיפה של ג'ל אלקטרודה בצלחת 35 מ"מ.
    3. הכנס את המיקרופיפט למחזיק המיקרו-אינג'ט, שבר את קצה המיקרופיפט ושואף את פתרון הדנ"א.
    4. הנח טיפה 1 μL של פתרון ירוק מהיר (0.01%) במכסה של צלחת 3 ס"מ, ולהשתמש בו כנקודת התייחסות, להתאים את קוטר הקצה של micropipette על ידי שבירת קצה שלה עם מלקחיים עדינים. להתאים את פרמטר הלחץ כך טיפות גודל שווה מיוצרים על ידי microinjector, ובכך לאפשר משלוח של כ 1 μL של פתרון DNA לכל זריקה.
  3. הכנת העכבר הנשי בהריון
    1. לשקול את RjOrl:שוויצרי עכבר בהריון.
    2. בצע זריקה תוך-פרטית עם 12.5 μL לגרם של משקל גוף (BW) של פתרון הרדמה. המתן 5 דקות וודא שהעכבר ישן על-ידי צביטה של בוהן.
    3. ברגע החיה אינה מגיבה לצבוט, להזריק אותו תת עורית עם 1.6 μL / g BW של פתרון משכך כאבים.
    4. מוסיפים טיפה של ג'ל עיני על כל עין כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח ומניחים את בטן החיה על כרית החימום.
    5. לגלח בעדינות את בטנו, לנקות אותו עם כרית ספוגה יוד, ולחטא את האזור מגולח עם כרית אלכוהול.
    6. סדר שדה הפעלה על-ידי הצבת דחיסות סטריליות סביב האזור המגולח, המנקה והמחוטא.

3. באלקטרופורציה של הרחם (IUE)

  1. הזרקה תוך חדרית
    1. חותכים חתך אנכי 2 ס"מ לאורך קו האמצע החל בחלק התחתון של הבטן, דרך העור, ולאחר מכן דרך השריר הבסיסי. לחשוף את קרני הרחם על ידי מניפולציה בעדינות את שקיות העובר ולהעריך את המיקום של צוואר הרחם ואת מספר שקיות עובריות בכל צד של צוואר הרחם.
    2. לכוון את המוח של העובר E15.5 להיות electroporated על מנת לראות את bregma, מוכר בקלות כמו המיקום שלה תואם עם הצומת של שלושת כלי הדם העיקריים הפועלים לאורך סדקים מוחיים.
    3. תארו לעצמכם קו וירטואלי בין bregma (גלוי דרך הגולגולת) לבין העין; להציג את micropipette בין הקו הווירטואלי ואת הסדק האורך, ולאחר מכן ללחוץ על דוושת הרגל של המזרק כדי לספק 1 μL של פתרון DNA בחדר לרוחב של חצי הכדור הממוקד.
      הערה: כאשר מוזרק במיקום הנכון, החדר לרוחב מלא נראה כחול, המציין כי הוא כבר מלא עם פתרון ה-DNA.
  2. אלקטרופולציה
    1. החל את האלקטרודות (ראה טבלה של חומרים), טבול בעבר ג'ל אלקטרודה, משני צידי העובר מוזרק עם אנודה המכסה את ההמיספרה מוזרק. לחץ על דוושת הרגל של electroporator כדי לספק סדרה של ארבעה פולסים 50 ms של 35 V, כל מופרדים על ידי מרווח 950 ms.
    2. לעמעם את העובר עם תמיסת מלח מחוממת.
      הערה: יש לשמור על העוברים לחים באמצעות תמיסת מלח מחוממת במהלך כל הניתוח והרחם לא צריך להתייבש.
    3. חזור על שלבים 3.1.2–3.2.2 עבור כל עובר.
    4. לאחר שכל העוברים הממוקדים כבר electroporated, להחליף את קרני הרחם בבטן על ידי בעדינות דוחף אותם עם מלקחיים בחזרה למיקום המקורי שלהם. ממלאים את חלל הבטן בתמיסת מלח מחוממת כדי למנוע מהרחם להתייבש בזמן התפרים.
    5. ראשית לסגור את שריר הבטן עם תפר נספג מתמשך, ולאחר מכן את העור עם תפרים בודדים מרובים (~ 10) באמצעות 4-0 תפר.
    6. שים את החיה בכלוב נקי, שוכב על צידו על מגבת נייר נקייה ולהפוך את החיה לצד השני כל 5-10 דקות עד שהוא מתעורר ומתחיל לנוע בכוחות עצמו.
    7. להעריך את מצבו של החיה למחרת, במיוחד אם הקן נעשה.
      הערה: אין צורך בטיפול לאחר הניתוח. בהיעדר קן, כל סימן לכאב (למשל, השתטחות, פרווה שעיר) ו/או דימום כבד, יש להרדים את החיה ללא דיחוי.

4. קצירת רקמות וקטעים

  1. איסוף רקמות
    1. הזרק פנוברביטל (100 מ"ג/ק"ג BW) תוך-פרטית להרדמה סופנית בזמן הקציר הרצוי. במקרה זה, זמני הקציר היו לאחר הלידה (P) ימים P4, P7, ו P21.
    2. בצע זלוף תוך-טרידי באמצעות פתרון קר מראש המבוסס על paraformaldehyde.
    3. לנתח את המוח ולמקם אותו לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתמיסה מבוססת paraformaldehyde עבור postfixation.
  2. היסטולוגיה
    1. למחרת בבוקר לשטוף את המוח 3x במשך 10 דקות עם 1x PBS.
    2. להטמיע את המוח ב 3% agarose מומס 1x PBS.
    3. חותכים 80 מיקרומטרים באמצעות מיקרוטום להב רוטט.
    4. לאסוף קטעים בצלחת 24 היטב ממולא מראש עם 1x PBS.
    5. טען מקטעים באמצעי ההרכבה (ראה טבלת חומרים)בין השקופית לכיסוי. שמור על השקופיות המותקנות ב-20 °C (70 °F) לשימור אופטימלי של חלבונים פלואורסצנטיים ואחסון לטווח ארוך.

5. הדמיה קונפוקלית רב-ערוצית

  1. הגדרות מיקרוסקופ
    1. הגדר את התצורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לרגש בנפרד קווי לייזר mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry באמצעות קווי לייזר של 440, 515 ו- 559 ננומטר, בהתאמה.
    2. השתמש במטרה 20x 0.8 NA (או NA גבוה יותר) והתאם דגימת XY וגודל שלב Z בהתאם לקריטריוני Nyquist.
      הערה: תמונות שנרכשו ברזולוציה גבוהה יותר (למשל, 60x 1.4 יעד שמן NA) ואלגוריתמים deconvolution יאפשר שחזור של הפרטים העדינים של arbors אסטרוציטים. עם זאת, הנסיין צריך לזכור כי תהליכי אסטרוציטים הטובים ביותר לא יכול להיפתר על ידי הדמיה אופטית קונבנציונלית.
  2. רכישת תמונה
    1. מצא את האסטרוציטים הבהירים ביותר באזור האלקטרופולציה.
    2. מכיוון שתאים המסומנים בתווית הממוקמים קרוב לפני השטח עשויים להיראות בהירים יותר מאלה העמוקים יותר בפרוסה, התאם את הגדרות הרכישה בתאי פני השטח כדי למנוע רוויה של התמונות.
    3. התאימו את קביעות הרכישה בנפרד לכל אחד משלושת הערוצים תוך הקפדה להימנע מרווית פיקסלים באמצעות HiLo LUT, המציג ערכי אפס כערכי פיקסלים כחולים ומקסימליים כאדום.
      הערה: תמונה מאוזנת כראוי אמורה להציג רק כמה פיקסלים כחולים וכמעט ללא פיקסלים אדומים.
    4. לרכוש אריחים 1,024 x 1,024 פיקסל Z-ערימות באמצעות השלב הממונע של המיקרוסקופ, עם חפיפה של 10% בין ערימות סמוכות כדי לאפשר שחזורי פסיפס של האזור electroporated או אזור העניין.

6. פילוח נפח טריטוריאלי של אסטרוציטים

הערה: פעולה זו מתבצעת באמצעות תוכנה מסחרית (למשל, IMARIS).

  1. הכנת ערכת הנתונים
    1. חותכים את האסטרוציטים המסומנים בתווית בשחזור התלת-ממדי (250 x 250 פיקסלים) על-ידי בחירת תאים המוקפים לחלוטין במקטע הרקמה בתמונה.
      הערה: ניתן גם לעבוד ישירות על אמצעי אחסון גדולים יותר אם המחשב המשמש יכול לטפל בהם.
    2. לחץ על כפתור משטח כחול בסרגל הכלים אובייקט של התצוגה עלה כדי ליצור משטח חדש עבור כל אסטרוציטים.
    3. כדי להשיג ניגודיות תצוגה חזותית טובה יותר, התאם תחילה את ערכי ניגודיות הצבעים המינימליים והמקסימליים על-ידי לחיצה על ערוך | הצג את אפשרות התאמת התצוגה וגרור את שתי נקודות האחיזה. במידת הצורך, שנו את צבע הערוץ בלחיצה ישירה על שם הערוץ בחלון 'התאמת תצוגה' לבחירת צבע חדש.
      הערה: עדיף תמיד לעבוד עם אותו צג צבע כדי למנוע הטיה חזותית.
    4. לחץ על ערוך | מאפייני תמונה כדי לציין באופן ידני את גודל voxel במיקרומטר. אם גודל voxel אינו מדויק, חישובי אמצעי האחסון יהיו שגויים.
    5. שמור את ההגדרות החדשות.
  2. פילוח פני שטח
    1. השתמש בסמל הכחול כדי להציג משטח. סמל ותיבה של פני השטח יופיעו ברשימה סצנה. תיבת אמצעי אחסון מאפשרת לראות/להסתיר את ערכת הנתונים.
    2. בחר את קו פני השטח ולחץ על דלג על יצירה אוטומטית | ערוך באופן ידני.
    3. לחץ על | מתאר ניראות ולחץ על ללא. לאחר מכן עבור לתצוגה בחר ולחץ על לחצן צייר.
    4. לחץ על מצב כדי לבחור את מצב הציור.
    5. השתמש בכלי הציור המהיר והיעיל למחצה Isoline. הגדר את קו המיתאר של התא על-ידי הזזת מצביע העכבר עליו. אם התצוגה המקדימה של isoline אינה תואמת לקו המיתאר של האסטרוציטים, התאם את מיקום מצביע העכבר. כדי לאמת את התצוגה המקדימה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבחירה. כדי לתקן טעויות אפשריות, השתמש בחלון הלוח כדי למחוק את מיתאר מישור Z הנוכחי או הקש Ctrl + Z.
    6. שימוש | פרוסה מקם כדי לנווט במישורי Z, עבור למישור הבא על-ידי שינוי מספר מישור Z והתחלת מתאר חדש. עדיף להתחיל מאמצע התא ולאחר מכן לעבור לגפיים.
    7. כאשר קווי המתאר צוירו בכל מישורי Z המכילים את האסטרוציטים, לחץ על צור משטח. לפני יצירת משטח, ודא שכל הרכיבים מחוברים. אם לא, בחר את הגדולים ביותר או חבר נתונים רלוונטיים לפני ייצוא נתוני אמצעי אחסון.
    8. בדוק את הנתונים הכמותיים המוצגים בלוח הנתונים וייצא סטטיסטיקות בתבנית גיליון אלקטרוני, תוך שמירת ערך אמצעי אחסון ויחידה.
    9. שמור את פני השטח תחת שם חדש כדי לגשת אליו מאוחר יותר.

7. מעקב אחר ארבוריטים אסטרוציטים

הערה: פעולה זו מתבצעת באמצעות תוכנת גישה פתוחה Vaa3D.

  1. הכנת ערכת הנתונים
    1. טען את מחסנית התמונות וחפש אסטרוציטים מבודדים או אסטרוציטים סמוכים המציגים צבעים שונים.
      הערה: ניתן לשפר את הרזולוציה של השחזור על ידי הגדלת המטרה NA ודגימה. בסופו של דבר, עם זאת, בשל מגבלת הרזולוציה של מיקרוסקופיה קונפוקלית, לא ניתן לעקוב במדויק אחר תהליכי האסטרוציטים הטובים ביותר. יש להקפיד להימנע מהגזמה מעבר לרזולוציה של התמונות שנרכשו.
    2. באמצעות פיג'י, חתוך 250 x 250 פיקסלים סביב כל אסטרוציטים.
    3. מכיוון שמעקב Vaa3D מתבצע בצבע אחד בלבד, בחרו ערוץ אחד ובטלו את הפעלת הערוצים האחרים.
    4. המר את התמונה ל- RGB ושמור אותה בתבנית .tiff.
  2. מעקב ארבור
    1. פתחו את תמונת RGB ב-Vaa3D. עבור אל | תמונה | נתונים לאחר מכן, דגימה מחדש של התמונהוהתאמת ערכי הגודל של X/Y ו- Z voxel.
      הערה: בעת שחזור arbors אסטרוציטים, יש להקפיד לא לעקוב אחר פרטים עדינים יותר מאשר הרזולוציה המסופקת על ידי התמונות.
    2. פתח חלון תלת-ממד על-ידי לחיצה על הצג באופן חזותי | מציג תלת-ממד עבור התמונה כולה. לחצו לחיצה ימנית על תמונה תלת-ממדית ובחרו לחיצה ימנית 1 להגדרת סמן. הצבע עם הסמן במרכז האסטרוציטים ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר סמן.
      הערה: לחץ על בריחה כדי לקבל גישה לתצוגה 3D שוב.
    3. עבור אל | מעקב תלת-ממדי מתקדם | Vaa3D-נוירון2-מעקב אוטומטי.
    4. בחלון החדש שנפתח, בחר את הערוץ שעליו יש להחיל את התוסף.
    5. בחר סף רקע (לעתים קרובות בין 30 ל- 90). התאם ערך זה עבור כל אסטרוציטים במידת הצורך.
    6. בטלו את הסימון באפשרות Radius מ-2D ושמרו על דגימה אוטומטית ודוגמה אוטומטית מסומנת.
    7. קבע cnn_type ב-3, length_thresh ב-1 SR_ratio ב-0.1.
    8. לאחר לחיצה על אישור, ודא שהתוסף יוצר באופן אוטומטי שני קבצים בהתבסס על השם המקורי. הסיומת –ini.swc ו- -coordinateX-coordinateY-coordinateZ-app2.swc יתווספו. הוסף תווית ייחודית לקבצי שמות אלה באופן ידני כדי לא להחליף אותם תוך המשך הפעלת התוסף.
    9. פתח את מנהל האובייקטים, עבור אל נוירון | מבנה קו, בחר את האסטרוציטים במעקב, לחץ על מצב תצוגהובחר מצב קו תמיד.
    10. חזור לחלון התלת מימד, שם מופיע שלד של האסטרוציטים.
      הערה: אם הפילוח והאות אינם תואמים, חזור על שלבים 7.2.3-7.2.10 והתאם את הסף עד שהם יתאימו. הקפד להזין מחדש את הפרמטרים האחרים בעת איפוסם בעת הפעלה מחדש של התוסף.
    11. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השלד ובחר נוירון הבחירה הראשונה | קו #1... APP2_Tracing לגשת למדידות כמותיות שיופיעו על משטח חלון חדש| ביאור אובייקט.
      הערה: בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופיה קלה, מדידות המוצגות תחת הפריטים המפורטים מספר ענפים ומספר bifurcations לספק רק הערכה גסה של מורכבות arbor אסטרוציטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אלקטרופולציה של סמני MAGIC באבות קליפת המוח העוברית מאפשרת תיוג של אסטרוציטים מהשלבים המוקדמים עד המאוחרים של התפתחות קליפת המוח (איור 1). אסטרוציטים אלה נמצאו בכל שכבות קליפת המוח בשלבים שונים לאחר הלידה (P4, P7, P21) כפי שהם התפזרו נרחב לתוך קליפת המוח כולה. הם הוערכו באמצעות תמונות קונפוקל אריחים שנרכשו במטרה 20x 0.8 NA (או NA גבוה יותר) והורכבו כשחזורי מחסנית Z(איור 2). תיוג קומבינטורי של סמני MAGIC איפשר התאמה אישית של אסטרוציטים קליפת המוח והפקת מידע לגבי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באלקטרופורציה של הרחם (IUE) של סמני MAGIC באבות קליפת המוח (איור 1) אפשר תיוג של אסטרוציטים לאורך קליפת המוח לאחר הלידה בשלבים שונים לאחר הלידה (P4-P7-P21, איור 2). מעניין, השלב של IUE אינו קריטי, כמו electroporation שבוצעו מ E13.5 כדי E15.5 מניב דפוסי תיוג דומים לגבי אסטרוציטים קליפת המוח14. עם זאת, המיקום של נוירונים פירמידליים שכותרתו parenchyma קליפת המוח משתנה עם שלב electroporation. ואכן, IUE ביצע ב E15 סימני שכבה 2-3 נוירונים ואילו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים ל- S. Fouquet ולמתקני ההדמיה וליבת בעלי החיים של מכון דה לה ויז'ן ומכון דס מדעי המוח דה מונפלייה (MRI ו- RAM) על סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מלגות מ Région Ile-de-France ו Fondation ARC לשפוך la Recherche sur le Cancer כדי S.C, ומאוניברסיטת פריז-Saclay (יוזמות דוקטורטים Interdisciplinaires) ללוס אנג'לס, על ידי מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC-SG 336331, PI J. Valette) כדי E.H., על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche תחת חוזים ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (צרפת BioImaging) על ידי פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) ועל ידי תוכנית ATIP-Avenir (PI K. Loulier).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1.1 טרנספורמציית חיידקים
אמפיציליןEuromedexEU0400-C
DH5 תאים מוכשרים אלפאפישר סיינטיטיק11563117
קופסת קרחDutscher139959
KanamycinSigma60615
LB אגרסיגמאL2897
SOC בינוניפישר סיינטיטיק11563117
צלחת פטרי סטרילית- 10 ס"מתרמו פישר150350
אמבט מיםVWR462-0556H
<חזק>1.2 תרבית פלסמיד
14 מ"ל צינור תרביתדוצ'ר187262
זכוכית erlenmeyer- 2 ליטרפישר סיינטיטי11383454
LB בינוניסיגמאL3522
<חזק>1.3 הכנת DNA פלסמיד
NucleoBond Xtra Maxi Plus EFMacherey-Nagel740426.10
<חזק>2.1 הכנת התמיסות
26 גרם x 1/2 מחטTerumo8AN2613R1
30 G x 1/2 מחטTerumo8AN3013R1
Fast GreenSigma AldrichF7272
NaClVWR27810.295
מזרק פוליפרופילן חד פעמי, 1 מ"לDutscher50002
<חזק>2.2 הכנת חומר הניתוח
מלקחיים אדסון - דפוס דבייקי- 12.5 ס"מFST11617-12
מלקחיים עם קצה מקושת- 10 ס"מFST11071-10
מעקר חרוזי זכוכית סטרי 250סיגמאZ378569
מיקרופיפטה מזכוכית 1 מ"מ קוטרFHC10-10-L
מלקחיים גראף - טיטניום 1 מ"מ קצות עקומה קלה- 10 ס"מFST11651-10
מלקחיים גראף - טיטניום 1 מ"מ טיפים ישרים- 10 ס"מFST11650-10
מספריים קשתית - ישר עדין- 9 ס"מFST14060-09
סרט מעבדהפישר סיינטיטי11730454
מיקרו-מזרקINJECT+MATICללא מספר
מחזיק מחט Olsen-Hegar - 12 ס"מFST12002-12
סיב אופטיVWR631-1806
נייר לבן מצופה פלסטיקDistrimed700103
ג'ל אלקטרודות SignagelFree-Med15-60
צלחת פטרי סטרילית- 35 מ"מDutscher056714
סטריליזטור, חרוז יבש מזכוכית, סטרי 250סיגמאZ378569
<חזק>2.3 הכנת עכבר בהריון
פד אלכוהולAlcomed1731000
BuprecareAxience0.3 מ"ג/מ"ל
דחיסתtRAFFIN70189
קטמיןמריאלאימלגן 1000
ג'ל עינייםtvm מעבדהאוקרי-ג'ל
RjOrl:עכברים שוויצרייםJanvier Labs
Vetadine, תמיסה 10%Vetoquinol4337400113B
כרית חימוםמכשיר הרווארד72-0493
קסילזיןבאייררומפון 2%
<חזק>3.2 אלקטרופורציה
תפר נספג גודל 4-0 45 ס"מ תפר 1 מחט 19 מ"מ אורך 3/8 מעגלהפוך NovosynC0068220
Electroporate SonidelSonidelNEPA 21
פיפטות העברה סטריליות (עטופות בנפרד)Dutscher043202S
פינצטה עם אלקטרודות דיסק פלטיניום 3 מ"מסונידלCUY650P3
<חזק>4.1 קצירת רקמות וחתך רקמות
צלחת 24 בארותפלקון353047
אגרוזלונזה50004
אנטיגנפיקסמיקרום מיקרוטקU/P0014
CoverslipDutscher100266
DolethalVetoquinolDOL202
DPBS (10X), ללא סידן, ללא מגנזיוםFisher Scientific11540486
לקEMS72180
SlideDutscher100001
VectashieldVectorlabsH-1000
VibratomeLeicaVT1000S
<חזק>5. הדמיה קונפוקלית רב-ערוצית
20X שמן NA 0.85אולימפוס
קארל זייסLSM880
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליאולימפוסFV1000
תוכנית אפוכרומט 20x/0.8 M27קארל זייס
<חזק>6. סגמנטציה של נפח טריטוריאלי של אסטרוציטים
IMARIS 8.3 וגרסאות מאוחרות יותרBitplane
7. חבילת תוכנה לניתוח בעזרת אסטרוציטים
3D Visualization-Assisted Analysis (Vaa3D)HHMI - קמפוס מחקר ג'נליה / מכון אלן למדעי
קטלוגי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המוח

מקורות

  1. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  2. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  3. Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
  4. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  5. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  7. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
  8. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  9. Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039(2013).
  10. Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
  11. Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  12. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697(2017).
  13. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  14. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  15. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896(2016).
  16. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87(2015).
  17. Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
  18. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  19. Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
  20. Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342(2014).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662(2019).
  24. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  25. Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  26. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
  27. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אסטרוציטים קורטיקלייםמיקרוסקופיה קונפוקליתחלבונים פלואורסצנטייםPiggyBac Tol2רקומבינציית Cre Loxמיפוי גורל רב-צבעישחזור Z Stackמורפולוגיה של אסטרוציטים
ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.