הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

4.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

13 ביוני 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

אולטרסאונד ממוקד עם סוכני microbubble יכול לפתוח את מחסום הדם מוח מוקדי חולף. טכניקה זו שימשה כדי לספק מגוון רחב של סוכנים על פני מחסום הדם מוח. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור מסירה מקומית למוח מכרסמים עם או בלי הדרכה MRI.

תקציר

ניתוח סטראוטקסי הוא תקן הזהב להעברת סמים וגנים מקומיים למוח המכרסמים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני אספקה מערכתית כולל לוקליזציה מדויקת לאזור המוח היעד והפחתת תופעות לוואי מחוץ ליעד. עם זאת, ניתוח סטראוטקסי הוא פולשני מאוד אשר מגביל את היעילות התרגומית שלה, דורש זמני התאוששות ארוכים, ומספק אתגרים כאשר מיקוד אזורי מוח מרובים. אולטרסאונד ממוקד (FUS) יכול לשמש בשילוב עם microbubbles במחזור כדי לפתוח באופן ארעי את מחסום הדם מוח (BBB) באזורים בגודל מילימטר. הדבר מאפשר לוקליזציה תוך נדרית של סוכנים המועברים באופן שיטתי שאינם יכולים בדרך כלל לחצות את ה- BBB. טכניקה זו מספקת חלופה לא פולשנית לניתוח סטראוטקסי. עם זאת, עד כה טכניקה זו טרם אומצה באופן נרחב במעבדות מדעי המוח בשל הגישה המוגבלת לציוד ושיטות סטנדרטיות. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק גישה ספסל לפתיחת FUS BBB (BBBO) כי הוא סביר לשחזור ולכן ניתן לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה.

מבוא

למרות התגליות הרבות במדעי המוח הבסיסיים, מספר הטיפולים המתעוררים להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות נותר מוגבל יחסית1,2. הבנה מעמיקה יותר של הגנים, המולקולות והמעגלים התאיים המעורבים בהפרעות נוירולוגיות הציעה טיפולים מבטיחים שאינם ניתנים למימוש בבני אדם בטכניקות הנוכחיות3. טיפולים יעילים מוגבלים לעתים קרובות על ידי הצורך להיות חדירה למוח ו ספציפי לאתר4,5,6,7,8. עם זאת, שיטות קיימות של אספקת תרופות מקומיות לאזורי מוח ספציפיים (למשל, משלוח באמצעות הזרקה או קנולה) הן פולשניות ודורשות פתח להתבצע בגולגולת9. הפולשנות של ניתוח זה מונעת שימוש שגרתי באספקה מקומית למוח האנושי. בנוסף, נזק לרקמות והתגובות הדלקתיות הנובעות מכך הם מבלבלים בכל מקום למחקרים בסיסיים ופרה-קוליניים המסתמכים על הזרקה תוך-מוחית10. היכולת לספק סוכנים באופן לא פולשני על פני מחסום הדם מוח (BBB) ולמקד אותם לאזורי מוח ספציפיים יכולה להיות השפעה עצומה על טיפולים בהפרעות נוירולוגיות, ובו זמנית לספק כלי חקירה רב עוצמה למחקר פרה-קליני.

שיטה אחת של הובלה ממוקדת על פני BBB עם נזק מינימלי לרקמות היא אולטרסאונד ממוקד transcranial (FUS) יחד עם microbubbles כדי לפתוח את BBB11,12,13,14,15,16. פתיחת FUS BBB צברה תשומת לב לאחרונה לטיפול בהפרעות ניווניות, שבץ וגליומה על ידי לוקליזציה של טיפולים כדי למקד אזורים במוח כגון גורמים נוירוטרופיים17,18,19, טיפוליםגנטיים 20,21,22, נוגדנים23, נוירוטרנסמיטורים24, וננו חלקיקים25,26,27,28,29. עם מגוון רחב של יישומים ואופיו הלא פולשני30,31, פתיחת FUS BBB היא חלופה אידיאלית לזריקות תוך ורידי סטראוטקסיות שגרתיות. יתר על כן, בשל השימוש הנוכחי שלה בבני אדם30,32, חקירות פרה-קוליניות באמצעות טכניקה זו יכול להיחשב תרגום מאוד. עם זאת, פתיחת FUS BBB עדיין לא הייתה טכניקה מבוססת נרחבת במדע בסיסי ומחקר פרה-קליני בשל חוסר נגישות. לכן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגישה ספסל לפתיחת FUS BBB כנקודת מוצא למעבדות המעוניינות לבסס טכניקה זו.

מחקרים אלה נערכו עם מתמר אולטרסאונד ספציפי FUS מגובה אוויר בהספק גבוה או מתמר טבילה קולי ממוקד בהספק נמוך. המתמרים הונעו על ידי מגבר כוח RF המיועד לעומסים תגובתיים ומחולל פונקציה סטנדרטי על הספסל. פרטים על פריטים אלה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים נעשו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של UAB.

1. הגדרת ציוד נהיגה אולטרסאונד ממוקד

  1. השתמש 50 אוהם כבלי BNC קואקסיאליים כדי לחבר (1) את הקלט של מתמר אולטרסאונד לפלט של מגבר RF ו (2) את הקלט של מגבר RF לפלט של מחולל הפונקציות.
  2. הגדר את מצב מחולל הפונקציות לפרץ סינוסואיד פעם בשנייה עם מחזור חובה של 1%.
    1. עבור מתמר טבילה בהספק נמוך של 1 מגה-הרץ עם מרחק מוקד של 0.8 אינץ' המשמש עם מגבר RF של 50 dB, הגדר את הגדרות ההתחלה ל: גל סינוס של 1 מגה-הרץ, שיא V אחד לשיא, מחזור 10k, מרווח זמן של 1 (או נקודה).
    2. עבור מגובה האוויר, מתמר בהספק גבוה של 1.1 מגה-הרץ, הגדר את ההגדרות הראשוניות ל: גל סינוס של 1.1 מגה-הרץ, שיא של 50 mV לשיא, מחזורי 11k, מרווח של 1 שניות.
      הערה: אל תפעיל את המתמרים אלא אם כן הם שקועים. אין להניח יד או חלק גוף אחר במוקד אולטרסאונד או לגעת בפנים מתמר בזמן שהוא פועל.

2. הגדרת ספסל אולטרסאונד ממוקדת

  1. הדפס תלת-ממד את המסגרת הסטראוטקסית ואת מחזיק המסגרת הסטריאוטיפית.
  2. חבר את המתמר לממקם XYZ באמצעות מלחציים המחזיקים צינור PVC(איור 1a). בורג מהדק על שקופית X-ציר ולנעול עם אגוז כנף.
    1. אם אתה משתמש במתמר אולטרסאונד בהספק גבוה, חבר אותו לצינור PVC באמצעות זוג מגנטים תואמים. ודא כי מגנט אחד יש חור והשני יש בליטה תואמת. כיפה בתחתית צינור ה-PVC וחיבר אליו את אחד המגנטים באמצעות אפוקסי (ראו איור 1b).
    2. חבר את המגנט השני למרכז העליון של מתמר אולטרסאונד בהספק גבוה באמצעות אפוקסי. ודאו שהוא נמצא ממש במרכז המתמר(איור 1c).
  3. אם אתם משתמשים במתמר אולטרסאונד בהספק גבוה, תצביעו על ביטול מיקום XYZ. קצה מצביע זה מציין את המיקום בחלל של מרכז מוקד מתמר כאשר מתמר אולטרסאונד מחובר לממקם XYZ. הפוך מצביע מתוך 18 G מחט לחתוך להיות אורך המרחק המוקד של מתמר בתוספת עובי של מתמר(איור 1d).
    1. החל אפוקסי על מגנט שלישי (מגנט זה גם זוגות עם מגנט כובע PVC) ולחבר אותו לחלק העליון של המצביע. לאחר מכן יוכל המצביע להתחבר למגנט בצינור ה-PVC לביטול XYZ(איור 1d).
  4. בשעת שימוש במתמר הטבילה בהספק נמוך, הדפסו תלת-ממד את הקובץ למצביע ולקליפ ההרכבה.
    1. חבר את מתמר הטבילה בהספק נמוך לצינור PVC על-ידי גזירת קליפ ההרכבה לצינור PVC והכנס את המתמר לטבעת (איור 1f).
  5. הפוך אמבט מים על ידי הדבקת חתיכות חתוכות מסדין אקרילי שיוכלו לנוח על ראש החיה מעל המסגרת הסטריאוטיפית(איור 1e).
    1. חותכים פתח בתחתית האמבטיה כי הוא בערך בגודל של ראש החיה. מכסים את החור באמבט המים עם סרט פולימיד.
      הערה: יש להקפיד על מנת להבטיח כי המים אינם דולפים סביב סרט פולימיד כפי שהוא יכול להרטיב את פרוות החולדה ולגרום היפותרמיה.
  6. הפוך MRI fiducial על ידי מילוי 4 מ"מ קוטר פלסטיק דק פגזים או כדור זכוכית עם נוזל MRI גלוי (למשל, שמן ויטמין E) ולאטום אותו. הניחו אותו במחזיק ה-MRI בצד ימין של המסגרת הסטראוטקסית המודפסת בתלת-ממד (איור 2a).
  7. אבטחו היטב את מחזיק המסגרת המודפס בתלת-ממד לממקם XYZ במיקום טוב למיקום בעלי חיים. החלק את הלשונית בקצה הרוטאלי של מחזיק המסגרת לתוך הערוץ התואם על מסילת ציר Y ואבטחתו באמצעות ברגים מוגדרים(איור 1h, חצים אדומים).
  8. להנעת מיקום XYZ, התקן את ה- USB לממיר טורי במחשב על-ידי ביצוע הוראות היצרן וחבר את הממיר. התקן את סביבת זמן הריצה ואת תוכנת בקר המנוע במחשב.
    1. ודא שהיציאה הטורית המתאימה נבחרה בתוכנה על-ידי בחירת ה- USB לממיר טורי בפקד הנפתח של בחירת היציאה בלוח הקדמי של תוכנת הבקר. חבר את ה- USB לממיר טורי לתיבת הבקר של מנוע הצעד באמצעות כבל מוצלב טורי בן 9 פינים (למשל, כבל מודם מסוג RS232 Null).
    2. הפעל את תוכנת הבקר כדי לבדוק שניתן לנהוג במנועי Stepper תחת בקרת תוכנה. שלב זה עשוי לדרוש סיוע של תמיכת IT מקומית.

3. הליך מיקוד תוך נדרי

הערה: חולדות זכר Sprague Dawley במשקל 250-350 גרם שימשו לניסויים אלה. לבעלי חיים הייתה גישה חופשית למים ולאוכל עכברושים, ונשמרו על מחזור אור:כהה של 12:12 שעות.

  1. שים את החיה תחת הרדמה (3% isoflurane עם חמצן) ולבדוק את חוסר התגובה לצביטת בוהן. לאחר מכן הכנס את הקטטר כמתואר להלן.
    1. לחמם את הזנב עם מנורה לעשות קל יותר להכות את הווריד. היזהר לא לחמם יתר על המידה את החיה או לשרוף את הזנב.
    2. ברגע שהחיה ישנה (אינה מגיבה לצביטת בוהן), הכנס את קטטר וריד הזנב 24 G שישמש להעברת microbubbles, צבע כחול אוונס (EBD), ניגוד MRI gadobutrol אם באמצעות MRI, ואת הסוכן הניסיוני של עניין. ברגע שהווריד נפגע, הדם ימלא את הנדן, יסיר לאט את המחט הפנימית תוך דחיפת הנדן עוד יותר לתוך הווריד.
      הערה: ראה מדריך כמו סטיוארט שרודר33 אם עושים את זריקות וריד זנב החולדה בפעם הראשונה.
    3. אם אין זרימת דם, לאט להזיז את נדן קטטר מתוך הווריד כדי לבדוק כי המחט אולי דקר את הווריד. אם הדם זורם כאשר הקטטר נמשך מעט לאחור, אז הראשון לתקוע עבר את הווריד ואת מיקום הקטטר יהיה צורך להפעיל מחדש במקום אחר על הזנב כי הוא rostral למיקום הקודם.
  2. ממלאים את תקע הקטטר בתמיסת מלח ומזיין את תקע הקטטר לסוף יציאת הקטטר ברגע שהנמל מתמלא בדם. לעטוף בזהירות את קלטת המעבדה סביב הקטטר והזנב כדי לשמור אותו במקום. התחל עם חתיכה קטנה בחלק העליון ולעבוד בכיוון caudal, משאיר את הקצה מאוד של תקע קטטר חשוף.
  3. חבר את קו ההרדמה למחבר ההרדמה במסגרת הסטראוטקסית(איור 2a)ותקן את ראש בעלי החיים למסגרת על-ידי הנחת הפה על סרגל הנשיכה ועל-ידי הנחיית מוטות האוזניים לשתי תעלות האוזן, ולאחר מכן הדק את הברגים שנקבעו. ודא שראש החיות מאובטח ומאוזן.
  4. מעבירים את החיה למיטת ה-MRI ומחברים את קו ההרדמה לקונוס האף. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב- MRI של בעלי חיים קטנים 9.4 T.
  5. אסוף תמונות משוקללות T2 קורנל ואקסיאליות הלוכדות את המוח כולו, כמו גם את ה- MRI fiducial (איור 2b) למדידות קואורדינטות. ספק לפיזיקאי MRI המקומי או לטכנולוגיה את המידע הבא כדי שיוכלו לבנות את פרוטוקול ה- MRI.
    1. לתמונות קורנל(איור 2b למעלה), השתמש בפרמטרים הבאים: מספר תמונות: 27, רוחב: 62.2 מ"מ, גובה: 62.2 מ"מ, עומק: 37.97 מ"מ, גודל Voxel: 0.24 x 0.24 x 1.41 מ"מ3.
    2. לתמונות ציריות(איור 2b למטה), השתמש בפרמטרים הבאים: מספר תמונות: 13, רוחב: 61.47 מ"מ, גובה: 53.81 מ"מ, עומק: 16.7 מ"מ, גודל Voxel: 0.41 x 0.21 x 1.29 מ"מ3.
      הערה: אין צורך בפרמטרים מדויקים אלה כל עוד הקורונל ברזולוציית המטוס קרוב ל-0.25 מ"מ והתמונות מכסות את כל המוח ואת הפידו-סוציאלי.
  6. לאסוף מדידות קואורדינטות מן התמונות לעיל על ידי הקלטת המרחק מן fiducial MRI לאזור המוח כי יהיה ממוקד עם FUS.
    1. בסורק, על תמונות הכתר שנאספו בשלב 3.5, למצוא את התמונה שבה fiducial הוא הגדול ביותר, המציין את מרכז fiducial. רשום את המרחק מהחלק העליון של fiducial לאזור המוח של עניין מ"מ (תוכנת MRI תהיה כלי מדידת קנה מידה או נקודה, להתייעץ עם טק MRI מקומי או פיזיקאי על איך לעשות את זה) הן בכיוון המדיאלי / לרוחב בכיוון הגחון הגבי (איור 2b, למעלה).
    2. בסורק, בתמונות הציריות שנאספו בשלב 3.5, מצאו את התמונה המציגה את החלק העליון של הדו-גזעי ומדדו את המרחק ממרכז הסיב לאזור המוח היעד הן בכיוון הגבי/גחוני והן בכיוון המדיאלי/לרוחב (איור 2b, למטה).
    3. השווה בין שתי המדידות המדיאליות/לרוחב ואם הן שונות השתמש בממוצע. מדידות קואורדינטות אלה ישמשו בשלב מאוחר יותר בשלב 4.3 להנחיית מוקד FUS לאזור מוח היעד עם מיקום XYZ.
  7. לאסוף תמונות PRESCAN MRI. השווה תמונות אלה לתמונות שנאספו לאחר פתיחת FUS BBB (איור 4). תמונות משוקלל T1 ישמשו מאוחר יותר כדי לדמיין את פתיחת BBB, תמונות T2 משוקלל ישמש מאוחר יותר כדי להבטיח שלא נגרם נזק לרקמות בעקבות טיפול FUS34.
    1. עבור תמונות ציריות משוקללות T1, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 51.2 מ"מ, עומק: 3.0 מ"מ, גודל voxel: 0.23 x 0.2 x 0.23 מ"מ3, מספר תמונות: 13.
    2. עבור תמונות ציריות משוקללות T2, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 51.2 מ"מ, עומק: 2.6 מ"מ, גודל voxel: 0.2 x 0.2 x 0.2 מ"מ3, מספר תמונות: 13.
    3. עבור תמונות קורנל משוקללות T1, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 30 מ"מ, עומק: 27 מ"מ, גודל voxel: 0.16 x 0.16 x 1 מ"מ3, מספר תמונות: 27.
    4. עבור תמונות קורנל משוקללות T2, השתמש בפרמטרים הבאים: רוחב: 30 מ"מ, גובה: 30 מ"מ, עומק: 27 מ"מ, גודל voxel: 0.12 x 0.12 x 1 מ"מ3, מספר תמונות: 27.
      הערה: כמו בשלב 3.5, פרמטרי דימות אלה אינם צריכים להיות זהים לאלה המפורטים. תמונות אלה יש FOV קטן יותר ברזולוציה גבוהה יותר מאלה שנאספו בשלב 3.5.
  8. שמירה על החיה במסגרת סטראוטקסית, להעביר במהירות את החיה ממיטת MRI למערך FUS הספסל. ודא כי החיה להישאר ישן להעברה תחת השפעת הרדמה.
  9. עבור זמני העברה ארוכים יותר, השתמש בתיבה להעברה גדולה מספיק כדי להתאים את החיה ואת המסגרת. עם תקע הרדמה עדיין מחובר, מניחים את החיה ואת המסגרת בתוך התיבה ולאפשר isoflurane עודף למלא את התיבה במשך כמה דקות. נתק את קו ההרדמה והעבר במהירות.

4. הליך אולטרסאונד ממוקד

  1. עם ההגעה למערך ספסל FUS, לחבר מיד את קו ההרדמה לתוך חרוט האף ולהמשיך לרוץ 1.5-3% איזופלורן עם חמצן. לעשות את זה מהר ככל האפשר כדי למנוע את החיה מתעוררת.
  2. החלק את המסגרת למחזיק המסגרת והצמד אותה למקומם בחוזקה. השתמש בקוצץ כדי לגלח את ראשו של החיה. להבריש את השיער עודף ולהחיל קרם מסיר שיער על הקרקפת. בואו לשבת במשך 3 דקות ולנגב עם מים גזה.
  3. אם MRI אינו זמין למיקוד, השתמש במסגרת סטראוטקטית סטנדרטית (לא בהדפסת תלת-ממד) כדי לבטל את מיקום המצביע ל bregma על-ידי נגיעה בקצה המצביע ל bregma (חתך בקרקפת יהיה צורך בכך) וביטול התוכנה או הקלטת הקואורדינטות. הזז את גררת XYZ למעלה ב- 50 מ"מ על-ידי לחיצה על לחצן 50 כלפי מעלה בתוכנה והחלפת המצביע עבור המתמר. בהתבסס על אטלס מוח חולדה כמתואר קודםלכן 35, לעבור קואורדינטות המוח הרצוי באמצעות לחצני דריכה בתוכנה. אם אתה משתמש בשיטה זו במקום MRI, דלג מטה לסעיף 4.6.
  4. בשעת שימוש בהנחיות MRI, חברו את המצביע והזיזו את המצביע למיקום ה-MRI fiducial (איור 1d,g). מקם את המצביע בחלק העליון והמרכזי של FIDUCIAL MRI (חור קטן בחלק העליון של מחזיק fiducial מסופק עבור הצבעה). לחץ על לחצן מיקום ה- Null שהוא הנקודה שממנה חושבו כל המרחקים בתמונת ה- MRI.
  5. הסר את המצביע והזז את הממקם לקואורדינטות המדיאליות/לרוחב ולנקודות הציון rostral/caudal. הרם את המיקום על ידי לחיצה על כפתור 50 למעלה כדי לאפשר את המיקום של אמבט המים וג'ל אולטרסאונד. אם המערכת תגיע לראש הנסיעה בציר Z, תוקפו של מיקום הביטול יבוטל. הקואורדינטות הגביות/גחון ייקבעו לאחר הוספת המתמר.
  6. החל ג'ל אולטרסאונד על הקרקפת של החיה ומניחים את אמבט המים על החיה עם חלון סרט פולימיד לחוץ על הג'ל. ודא כי אין בועות אוויר בג'ל אולטרסאונד.
  7. ממלאים את אמבט המים במים דלים.
  8. אם משתמשים במתמר בעל העוצמה הגבוהה, הורידו את המיקום כך שהמגנט נמצא ממש מעל המים. חבר את המתמר לממקם על ידי הנמכה זהירה של המתמר למים בזווית כדי למנוע מבועות אוויר להילכד מתחת לפנים ולחבר את המגנטים.
  9. אם משתמשים במתמר טבילה בהספק נמוך, הורידו את המיקום למים ממש מעל קליפ המתמר. ואז לקצץ את המתמר במקום על ידי הנמכה איטית אותו לתוך המים בזווית כדי למנוע בועות אוויר מלהילכד מתחת לפנים.
    הערה: אמבטיה שקופה מועילה כאשר מסתכלים מתחת לפני מתמר עבור בועות.
  10. הורידו את המיקום לקואורדינטת הגב/גחון.
  11. הפעל את מגבר ההספק של RF.
  12. הזרק 1 מ"ל/ק"ג של 3% צבע כחול אוונס (EBD) על ידי הדבקת קצה המחט לתוך תקע קטטר והזרקה. אפשר לו להסתובב במשך 5 דקות.
  13. הפעל את microbubbles על ידי טלטול אותם באלימות עם שייקר הבועה.
    1. הכן 5x המינון של 30 μL / קילוגרם של microbubbles (בועה conc. 1.2 x 1010/ mL) ב 0.2 מ"ל של מלוחים כדי להסביר את 2 טיפולי FUS ואת צינורות 18 G מכונף עירוי להגדיר. לדוגמה, אם החולדה שוקלת 200 גרם, ואז למלא את המזרק המכיל 18 G קצה מחט עם 30 μL של microbubbles ב 1 מ"ל של מלוחים.
      הערה: הקפד להשתמש 18 G טיפים מחט הן לקחת והזרקת עם ערכת עירוי מכונף.
    2. הפוך את המזרק מספר פעמים כדי לקבל חלוקה אחידה של microbubbles. לאחר מכן צרף ומלא את ערכת העירוי המכונפת. מקם את המזרק על משאבת העירוי והגדר את משאבת העירוי כדי לספק 0.2 מ"ל בקצב של 6 מ"ל / שעה. זה יספק עירוי איטי של microbubbles על החשיפה FUS 2 דקות.
    3. הכנס את המחט המכונפת לתקע הקטטר.
  14. ראשית, להפעיל את משאבת העירוי, לחכות 3 s ולהתחיל את הטיפול FUS על ידי לחיצה על הפלט לאפשר כפתור על מחולל הפונקציה (שכותרתו " על "עלמחולל הפונקציות בטבלת החומרים). חזור על אלה פעמיים לכל אזור עם 5 דקות בין כדי לאפשר microbubbles לנקות.
    1. לחץ שוב על כפתור ההפעלה על מחולל הפונקציות כדי לעצור את הטיפול FUS כאשר משאבת העירוי מפסיק ב 2 דקות.
    2. המתן 5 דקות עד שהמיקרו-ביבים יתבהרו. ואז להתחיל את העירוי ואת הטיפול השני FUS.
    3. מיד לאחר הטיפול השני FUS, להזריק ניגודיות gadobutrol (אם באמצעות MRI) ואת הסוכן של עניין, למשל, חלקיקים ויראליים. סה"כ נפח שנמסר של כל הסוכנים לא יעלה על 5 מ"ל /ק"ג.
      הערה: עיתוי המסירה (למשל, לפני או אחרי פתיחת FUS BBB) של סוכן העניין עשוי להשתנות בהתאם לסוכן המשמש.
  15. כבו את מגבר החשמל של ה-RF והחזירו מיד את החיה ל-MRI.

5. אישור MRI לפתיחת BBB

  1. אם MRI אינו זמין, דלג לסעיף 6 והשתמש בביטוי EBD לאישור פתיחת BBB.
  2. מחזירים את החיה למיטת ה-MRI בדיוק באותו מיקום כמו בשלב 3.7 ומחברים את קו ההרדמה.
  3. אסוף את סריקות פוסט ה- MRI עם אותם פרמטרי הדמיה המשמשים בשלב 3.7 כדי לדמיין שיפור MRI gadobutrol באזור פתיחת BBB (איור 3b,e).

6. זלוף ואיסוף רקמות

  1. לחלחל החיה עם קר 4% פורמלין עד הדם פועל ברור לחלוטין.
  2. הסר את המוח ואת המקום 4% פורמלין או PFA ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן, מניחים את המוח בתמיסת סוכרוז 30% עד שהמוח שוקע (בערך 2-3 ימים). לבסוף, פלאש להקפיא חנקן נוזלי או על קרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד cryosectioning.
  3. להקפיא את המוח באוקטובר ולקחת cryosections.
  4. תיקון וכיסוי מקטעים עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פסגת עירור EBD ב 470 ו 540 ננומטר ופסגות פליטה ב 680 ננומטר. כריכה עם מדיום הרכבה DAPI על מנת לדמיין את המורפולוגיה הסלולרית הכוללת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, אנו מראים כי אולטרסאונד ממוקד עם microbubbles יכול לגרום לפתיחת BBB מקומית באמצעות הפרמטרים שצוינו לעיל הן עם מתמר טבילה בהספק נמוך (איור 3) והן מתמר FUS (איור 4). ראשית, בניסויים מוקדמים, מתמר הטבילה בהספק נמוך היה מכוון לחצי כדור מוח אחד או לפנייים (איור 3b) או למדיאלי(איור 3a). בעלי חיים הוקרבו שעתיים לאחר מכן בזלוף (איור 3a) או ללא זלוף (איור 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן תיארנו גישה ספסל כדי microbubble סייע FUS BBB פתיחת עם גישות חלופיות כולל, שני מתמרים שונים ושיטות למיקוד תוך חיים עם וללא הדרכה MRI. נכון לעכשיו, על מנת להקים MRI מונחה FUS BBB פתיחת במעבדה, יש אפשרות לרכוש מכשירים מוכנים לשימוש מעולה המספקים תוצאות סטנדרטיות מאוד לשחזור עם ממשקים ידידותיים למשתמש. עם זאת, מעבדות רבות אינן מוכנות לעלות של מכשירים כאלה. לכן, המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק נקודת התחלה שכל מעבדה יכולה להקים על מנת לבנות את המומחיות שלהם בטכניקה.

פתיחת FUS BBB היא כעת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק תשתית מחקר EPSCoR NSF לאוניברסיטת קלמסון (1632881). בנוסף, מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז המחקר הבינלאומי Civitan, ברמינגהאם, AL. המחברים מודים בהכרת תודה על השימוש בשירותים ובמתקנים של אוניברסיטת אלבמה במתקן המשותף להדמיית בעלי חיים קטן בברמינגהאם [NIH P30 CA013148]. המחברים מכירים בראג'יב צ'ופרה על תמיכתו והנחייתו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שייקר בועותLantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, מכשיר הפעלה המשמש להפעלת מיקרו-בועות Definity
תקע קטטר / מכסה הזרקהטכנולוגיות עירוי SAIמספר חלק:תקע קטטר IC / מכסה הזרקה
צבע כחול אוונססיגמאE2129-10Gצבע כחול אוונס
מחולל פונקציותTektronixAFG3022Bערוץ כפול, 250MS/s, מתמר FUS 25MHz
, 1.1MHzFUS InstrumentsTX-110מתמר אולטרסאונד ממוקד כדורי תואם MRI 1 MHz עם הידרופון
כרית חימום לעכברים וחולדותKent ScientificPS-03כרית חימום- PhysioSuite לעכברים וחולדות
משאבת עירויKD Scientific780100KDS 100 Legacy משאבת עירוי מזרק יחיד
קלטת קפטוןGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) למדפסות תלת מימד והדפסה, 8 x 8 אינץ', 10 גיליונות לחבילה
מתמר טבילה בהספק נמוך, מתמר טבילה 1MHzOlympusV303-SU, 1 מגה-הרץ, 0.50 אינץ'. קוטר אלמנט, סגנון מארז סטנדרטי, מחבר UHF ישר, F=0.80IN ערכות
מגנטWINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15 מ"מ לתפור בשקית מגנטית אבזמים לתפירת סקראפבוקינג - 10 סטים
מגבר RFE& IA07575W
קטטר וריד זנבBD382512/ פישר פריט: NC122851324 גרם BD Insyte Autoguard צנתרים IV מוגנים (לא מכונפים)
מיקרו-בועות ניגודיות אולטרסאונדLantheus Medical ImagingDE4, DE16 DEFINITY(Perflutren Lipid Microsphere)
ג'ל אולטרסאונדAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		ג'ל אולטרסאונד Aquasonic 100 Transmission 1 ליטר בקבוק סחיטה
ערכות עירוי מכונפות, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion Sets
תוכנת בקר מנועN/AN/Aתוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב-LabView לשליטה בסביבת זמן הריצה של בקר המנוע Velmex
עבור תוכנת בקר המנועNational InstrumentsLabView מנוע זמן ריצה גרסה 2017 ומעלהhttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 צירים מפעיל שלב ליניארי (מיקום XYZ)Velmex
VelmexMB-1בורג BiSlide 1/4-20x3/4 אינץ' בורג כובע שקע (10 חבילות), כמות:
3 בקר מנועVelmexVXM-3בקרה, בקרת מנוע צעד 3 צירים ניתנת לתכנות, כמות: 1
קליעי הרכבהVelmexMC-2Cleat, 2 חורים BiSlide, כמות: 6
קליעי הרכבהVelmexMC-2Cleat, 2 חורים BiSlide, כמות: 2
ממיר USB לטוריVelmexVXM-USB-RS232כבל תקשורת טורי USB ל-RS232 10 רגל, כמות: 1
שלב ליניארי בציר xVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, נסיעה = 10 אינץ', 2 מ"מ / סיבוב, גבולות, NEMA 23, כמות:
מנוע צעד 1 ציר xVelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2, מנוע צעד עם פיר יחיד, כמות: 1
שלב ליניארי בציר yVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, נסיעה = 10 אינץ', 2 מ"מ / סיבוב, גבולות, NEMA 23, כמות:
מנוע צעד 1 ציר yVelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2, מנוע צעד פיר יחיד, כמות: 1
בולם ציר zVelmexD6CL-6.3FD6CL מנחת עבור צעד כפול מסוג 23 מנוע, כמות:
1 שלב ליניארי בציר zVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, נסיעה = 10 אינץ', 2 מ"מ / סיבוב, גבולות, NEMA 23, כמות:
מנוע צעד 1 ציר zVelmexPK266-03B-P2Vexta Type 23T2, מנוע צעד כפול, כמות: 1
קבצים
תושבת מתמר טבילה ומצביע
https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq מסגרתhttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
מחזיקhttps://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T בעל חיים קטן MRIBrukerBruker Bruker BioSpec 94/20ParaVision גרסה 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
מסיר שיער קרםכנסייה & דווייטנאיר קרם
gadobutrol MRI חומר ניגודבאיירגדביסט (Gadobutrol, 1mM / mL)
מסגרת סטריאוטקטיתStoelting# 51500לא תואם MRI
מכשיר אספקת FUS FUSInstrumentsRK-300מוכן לשימוש FUS תואם MRI למכרסמים
PTF ברגי להדפסה תלת מימדית סטריאוטקסית מסגרת סטריאוטקסי

מקורות

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Evans BlueGadobutrolMRI
גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.