המטרה של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric assay היא להעריך מתח חמצוני בדגימות ביולוגיות על ידי מדידת הייצור של מוצרי peroxidation השומנים, בעיקר malondialdehyde, באמצעות ספקטרופוטומטריית אורך גל גלוי ב 532 ננומטר. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם סרום אנושי, ליסאטים תאים, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות באמצעות חומצה Thiobarbituric חומרים תגובתיים אסייד
במאמר זה
סיכום
תקציר
למרות הספציפיות האנליטית המוגבלת שלה ואת המחוספס, החומרים תגובתי חומצה thiobarbituric (TBARS) בדיקה כבר בשימוש נרחב כמדד גנרי של peroxidation שומנים בדם בנוזלים ביולוגיים. זה נחשב לעתים קרובות אינדיקטור טוב של רמות של עקה חמצונית בתוך מדגם ביולוגי, בתנאי המדגם טופל כראוי מאוחסן. ההבחנה כוללת תגובה של מוצרי פרוקסידציה שומנים בדם, בעיקר malondialdehyde (מד"א), עם חומצה thiobarbituric (TBA), אשר מוביל להיווצרות של תוספים מד"א-TBA2 בשם TBARS. TBARS מניב צבע אדום-ורוד שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי ב- 532 ננומטר. בדיקת TBARS מתבצעת בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C (75 °F). מד"א טהור אינו יציב, אך תנאים אלה מאפשרים את שחרורו של מד"א מד"א (דימתיל אצטל), המשמש כסטנדרט אנליטי בשיטה זו. בדיקת TBARS היא שיטה פשוטה שניתן להשלים בכ 2 שעות. הכנת ריאגנטים של בדיקות מתוארים בפירוט כאן. חוקרים מודעים לתקציב יכולים להשתמש בריגנטים אלה לניסויים מרובים בעלות נמוכה במקום לקנות ערכת TBARS יקרה המאפשרת בניית עקומה סטנדרטית אחת בלבד (ולכן ניתן להשתמש בה רק לניסוי אחד). הישימות של בדיקת TBARS זו מוצגת בסרום אנושי, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, וליזאטים לתאים. ההסתה עקבית וניתן לשחזור, וניתן להגיע למגבלות הזיהוי של 1.1 מיקרומטר. המלצות לשימוש ופרשנות של בדיקת TBARS ספקטרופוטומטרית מסופקות.
מבוא
peroxidation השומנים הוא תהליך שבו רדיקלים חופשיים, כגון מינים חמצן תגובתי ומינים חנקן תגובתי, לתקוף קשרים כפולים פחמן פחמן שומנים, תהליך הכולל הפשטה של מימן מפחמן והכנסת מולקולת חמצן. תהליך זה מוביל לתערובת של מוצרים מורכבים כולל, רדיקלים פרוקסיל שומנים, הידרופרוקסידים כמוצרים העיקריים, כמו גם malondialdehyde (מד"א) ו 4-hydroxynonenal כמוצרים משניים השולטים1.
מד"א נמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כסמן של פרוקסידציה שומנית בשל תגובתו הקלינית עם חומצה תיוברביטורית (TBA). התגובה מובילה להיווצרות מד"א-TBA2, מצומדת הנקלטת בספקטרום הנראה ב-532 ננומטר ומייצרת צבע אדום-ורוד2. מולקולות אחרו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות סרום אנושי התקבלו ממתנדבים בהסכמה באישור IRB ובהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. דגימות קודדו ולא זוהו לפני המעבר למעבדה האנליטית.
1. הכנת מדגם
- תפילת תאים HepG2
- זרע על 10 x 106 HepG2 תאים לכל בקבוקון ב 16 T75 צלוחיות עם 14 מ"ל של מדיה EMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ולגדל תאים במשך 2 ימים.
- הכן חוצץ RIPA: בצינור 50 מ"ל, להוסיף 1.5 מ"ל של 5 M NaCl, 2.5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL של NP-40 ריאגנט, ולאחר מכן להביא את הנפח הסופי ל 50 מ"ל עם מי DI.
- הכן מאגר תמיסת: aliquot 20 מ"ל של מאגר RIPA לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף 200 μL של תמיסת מעכב פרוטאז ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C(5 °F), malondialdehyde (מד"א) ביס (דימתיל אצטל) מניב מד"א23. מד"א ומקורבים כימיים קשורים מגיבים עם שתי מולקולות של חומצה תיוברביטורית (TBA) כדי לייצר תרכובות הנקראות חומרים תגובתיים לחומצה תיוברביטורית (TBARS), המעניקות צבע אדום-ורוד ויש להן λmax סופג ב-532 ננומטר (איור 1, איור 2). שימוש בביס של מד"א (דימתיל אצטל) כסטנדרט, נוצרו עקומות סטנדרטיות (איור 3, טבל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות מגבלותיו1,3,4,7,8,10,12,13,14,15,19 וחוסר התאמה להשוואה בין מעבדות, מתקן TBARS הוא אחד הוותיקים ביותר 29,30
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים לחשוף.
תודות
המחקר שדווח כאן נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס לא. R33 CA217702 והיוזמה למיקסום תוכנית פיתוח התלמידים (IMSD). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1x סטרילי PBS pH 7.4 1 ליטר | VWR, PA | --262 | מגיב ליזיס תאים |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה עצמאי | קורנינג, ניו יורק | CLS430897 | חומר כללי |
| 96 צלחת באר, לא מטופל, שקוף, עם מכסה, לא סטרילי | תרמו פישר מדעי, MA | 280895 | למדידת ספיגה |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD מכשיר מסנן ספין צנטריפוגלי | פישר סיינטיפיק, NH | UFC510024 | טיהור LDL |
| לצינורות זכוכית | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | לבדיקת TBARS |
| נחושת II כלוריד | SIGMA, MO | 222011-250G | כדי לגרום לחמצון |
| צינורות תרבית, חד פעמי, עם גימור מכסה בורג, זכוכית בורוסיליקט (13 x 100 מ"מ) | VWR, PA | 53283-800 | לבדיקת TBARS |
| המדיום החיוני המינימלי של הנשר (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 מדיה תאית |
| Eppendorf צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"ל | eppendorf, NY | 22363204 | חומר כללי |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 מ"ל | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | חומר כללי |
| סרום בקר עוברי מקור ארה"ב | אומגה מדעית, CA | FB-11 | לתרבית תאים |
| חומצה אצטית קרחונית | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS ריאגנט |
| לעצור קוקטייל מעכב פרוטאז (100x) | תרמו סיינטיפיק, MA | 87786 | מגיב ליזיס תאים |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL |
| ממס תאי HepG2 ATCC | , VA | HB-8065 | אב טיפוס מטריצה ביולוגית |
| חומצה הידרוקלורית (HCl) | פישר סיינטיפיק, NH | A144-212 | מגיב |
| ליזיס תאיםאגדה מיקרו 17 צנטריפוגה | תרמו מדעית, MA | 75002431 | חומר כללי |
| ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, פלזמה אנושית | אתונה מחקר & טכנולוגיה, GA | 12-16-120412 | אב טיפוס מטריצה ביולוגית |
| מוטות ערבוב מגנטיים, מתומן 6-מבחר | VWR, PA | 58948-025 | חומר כללי |
| Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS סטנדרטי |
| Multiskan Go Microplate ספקטרופוטומטר | פישר סיינטיפיק, NH | 51119200 | למדידת ספיגה |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | מגיב ליזיז תאים |
| נתרן כלוריד | SIGMA, MO | S7653-1KG | מגיב ליזיס תאים |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | מגיב TBARS |
| נתרן הידרוקסיד | SIGMA, MO | 367176-2.5 ק"ג | מגיב TBARS |
| SpeedVac רכז | תרמו מדעי, MA | SC250EXP | עבור ריכוז תאים ליזטים |
| T-75 בקבוק, תרבית רקמות מטופלת, 250 מ"ל, עם מכסה מסנן | ארה"ב מדעית, פלורידה | 658175 | תרבית תאים |
| חומצה תיוברביטורית | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS ריאגנט |
| בסיס TRIS Fluka | , GA | 93362 | מגיב ליזיס תאים |
| טריפסין (1x) | VWR, PA | 16777-166 | לניתוק תאי HepG2 |
מקורות
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
