איתור השושלת וניתוח שבטים בפיתוח קליפת המוח באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM)

Summary

פרוטוקול לבצע מעקב שושלת היוחסין ניתוח גנטי פונקציונלי של גנים המועמדים ברמת תא בודד באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM) מוצג. ניתוח שבטים MADM מספק מסגרת כמותית כדי למדוד את ההתנהגות ההתרבות, הפלט הסלולר, ואת הקשר השושלת של ושלתי בודדים ותאי הבת שלהם.

Abstract

קליפת המוח של היונקים יוצרת. מעגלים עצביים פונקציונליים מאוד מושלתי עם זאת, המנגנון הסלולר והמולקולרי הבסיסי המסדיר את מעברי השושלת של תאי גזע עצביים (NSCs) ובסופו של דבר הפקה של נוירונים ו glia בהתפתחות נוירואפיתל נשאר ברור. שיטות למעקב אחר דפוסי החטיבה לבטחון לאומי ולמפות את השושלת של התאים הקשורים clonally מתקדמים באופן דרמטי. עם זאת, הרבה טכניקות מעקב של השושלת העכשווית סובלים מחוסר הרזולוציה התאית של הגורל תאים הצאצא, אשר חיוני לפענוח דפוסי החלוקה תא מחולל קדמון. הציג הוא פרוטוקול באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM) לבצע בניתוח vivo שבטים. ב-MADM במקביל מניפולציה בתאי קדמון בודדים ומדמיין דפוסי חלוקה מדויקים והתקדמות השושלת ברזולוציית תא בודדת חסרת תקדים. מבוסס MADM מבוססי אירועים שילוב מחדש במהלך השלב G2-X של mitosis, יחד עם זמניות inducible Creer^T2, לספק מידע מדויק על תאריכי הלידה של שיבוטים דפוסי החלוקה שלהם. לפיכך, מעקב MADM השושלת מספק הקריאות אופטי כמותי איכותניות וכמותית של מצב התפשטות של תא גזע ושלתי ברמת התא בודד. MADM מאפשרת גם לבדיקת המנגנונים והדרישות הפונקציונליות של הגנים המועמדים בהתקדמות השושלת ההמועצה לבטחון לאומי. שיטה זו היא ייחודית בניתוח השוואתי של בקרה ושיבוטים מוטציה ניתן לבצע באותה סביבה רקמה ב vivo. כאן, הפרוטוקול מתואר בפרוטרוט, והתפיסות הנסיוניות להעסיק את MADM עבור ניתוח שבטים ומעקב השושלת בקליפת המוח המתפתח מומחש. חשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לבצע ניתוח שבטים MADM בנישה כל מורטין תא גזע, כל עוד מנהל ההתקן של Creer^T2 קיים.

Introduction

קליפת המוח היא מבנה מאורגן מאוד המורכב משש שכבות נפרדות. קליפת המוח מכילה מערך מגוון של סוגי תאים כולל נוירונים ו גליה, אשר מקיימים אינטראקציה של מעגלים עצביים פונקציונליים. רוב, אם לא כולם, הקרנה בקליפת הגזע נוירונים ולגליה נגזר מתוך מאגר משותף של התאים העצביים העצבית (NSCs) המכונה גליה הרדיאלי ושלתי (rgps)^1,2,3. RGPs עצמם נגזרות של תאי גזע נוירואפיתל (NESCs) ההלחנה נוירואפיתל מוקדם מתחלקים. ביום העובריים 9 (E9) בעכברים, NESCs מתחיל לעבור לתוך RGPs⁴. Rgp התקדמות השושלת דורש באופן מדויק ורגולציה מרחבית, וכאשר תהליך זה מפריע, הפרעות נוירולוגיות חמורות כגון מגלונצפלוס, microcephaly, lissencephaly, או ליקויים כגון סכיזופרניה ואוטיזם יכול לגרום^5,6. בשנת E10, רוב rgps לעבור מחלקות מתרבים סימטרי, וכתוצאה מכך התרחבות של בריכת הקדמון העצבי^4,7. RGPs בסופו של דבר להתחיל לחלק סימטרית, לייצר נוירונים הקרנה הקורטיקלית באופן זמני מוגדר. באמצעות גלים רצופים של נוירוגנזה, הנירמול היילוד להגר לתוך לוחית קליפת המוח ויוצרים למינציה הקליפת המוח עם הנוירונים הנולדים מוקדם הכובש שכבות עמוקות והנוירונים הנולדים מאוחר המתגוררים שכבות שטחיות^8,9,10. בגלל clonally הנוירונים הקשורים הניריונים להעביר רדיוally לתוך קליפת המוח עם פיזור מאוד קטן, תאים בתים נוטים ליצור טור או מבנה חרוט בצורת המכונה יחידה הרדיאלי עצביים^4,11,12,13. על ידי E17, הרחבה מתחלקים הנוירוגניים הושלמה עכברים¹⁴. Rgps יכול גם לייצר תאים ependymal וכמה מחלקות של גליה, כולל אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך^{1,15,16,17,18,19}. הפוטנציאל של rgps כדי להצמיח הן נוירונים ו אסטרוציטים נראה עקבי על פני כל האזורים קליפת המוח¹⁸, עם כ 1/6 של הנוירוגניים rgps גם להפקת glia¹¹.

כיום, הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים המסדיר את ההתקדמות הטמפורלית של תא גזע לאורך שושלת היוחסין שלה הם בעיקר לא ידועים. דפוסי הזמני של ביטוי גנים יכול להיות השפעה ניכרת על החלטות השושלת ב rgps^{20,21,22,23,24}. כיצד זה מערכת יחסים הדוקה בין הזמני לבין מרחבית מוביל מגוון מולקולרי של סוגים נוירוונאליות מבוגרים באזורים הקורטיקליים לא ידוע. כמו כן, כיצד הפוטנציאל של תא גזע בודד התפוקה התאית שלו מאופנן ברמה התאית והמולקולרית היא שאלה חשובה ומלא מענה. מחקרים עתידיים בתקווה לטפל בכמה מהשאלות האלה, בסופו של דבר הרחבת ההבנה שלנו של היווצרות מעגלים קורטיקלית תפקודית.

בביולוגיה התפתחותית מבקשת להבין את מערכת היחסים של שושלת היוחסין שתאים במוח משתפים אחד עם השני. בתחילה, מעט מאוד כלי מחקר היו זמינים עבור זה, ומחקרים מוקדמים רבים הסתמך על תצפיות ויזואליות של דפוסי החלוקה באורגניזמים שקופים כגון האלגיה של Caenorditis²⁵. העשורים האחרונים ראו עלייה דרמטית במספר ותחכום של טכניקות זמין^{13,26,27,28,29}. הופעתה של מערכת עריכת הגנום crispr-Cas9 מאפשר שחזור סינתטי של קשרי השושלת של התא על ידי החדרת ברקודים DNA מתפתחת^27,30. שתי דוגמאות האחרונות של אסטרטגיות barcoding כוללים את השימוש של מדריך ביות RNA המכוון crispr-Cas9 כדי ספציפי ברקוד ה-DNA הבית או cytidine deaminase התמזגו עם nickase Cas9 למקד את היעד באזורים חוזרים^31,32. טכנולוגיות אלה מספקים גישות מובנות מאוד דרך המבוא של ברקודים כי בהדרגה לצבור מוטציות ייחודיות לאורך זמן. גישות לעריכת הגנום הן בעלות ערך רב משום שהן מאפשרות ניתוח רטרואקטיבי של היחסים בין שני תאים המבוססים על הירושה המשותפת של ברקודים אלה. עם זאת, כדי לקרוא את ברקודים בתאים בודדים, הרקמה בדרך כלל חייב להיות מופרת, ולכן מידע לגבי מיקום, מורפולוגיה, ומספרי התאים המוחלט של מחולל קדמון בודד הוא איבד.

קומבינטורית תיוג תבניות לשמר מידע מרחבי ועקרונית גם לאפשר את ההבחנה בין מקומי היטב או אפילו חופפים שיבוטים^33,34. עבור שיטת העקיבה השושלת כדי להיות אינפורמטיבי זה חייב לתייג ושלתי בודדים שלהם צאצאים בצורה דלילה ומלא מחיק. בעיקר, המוח³⁵ ו קונפטי^36,37 גישות להשתמש סטוכסטי recombinase היצורים הצבעוניים מבוססי כתבים המבטאים שילוב של חלבונים פלורסנט מתוך לוקוס יחיד. המספר הנרחב של שילובים צבע סימולטני שניתן להשיג ב vivo להפוך את זה כלי רב עוצמה בעת מעקב שיבוטים rgp הקורטיקלית ו אסטרוציטים³⁴. טרנספסון מערכות מבוססות מתן שילוב גנומי יציבה של כתבים פלורסנט קידוד המתיר מעקב השושלת של קליפת הושלתי יש גם פיתח^{33,38,39,40,41}. טרנספסון מערכות מבוססות יש יתרון נוסף בכך מבנה העיתונאי להשתלב באופן מובן לתוך הגנום, ובכך באופן אמין התווית תאים ביתי הקשורות לבנות. כדי לעקוב אחר האסטרוציטים באופן ספציפי, מספר שיטות פותחו כי כרוך אלקטרופורציה של הטרנספט הספיצסים כולל מסלול כוכב, אשר עושה שימוש בשילוב של בנייה קידוד החלבונים פלורסנט שונים^40,42. גישה נוספת, סמנים הקסם, מציג וקטורים בריינרד ברייסייבל כמו הטרנספנאין. זה כבר בשימוש בהצלחה להתחקות אחר עצבי מתחלקים אסטרוציט ושלתי^34,43. לאחרונה, ניתוח פסיפס על ידי החלפת קלטת dual-recombinase-בתיווך (MADR) נמצא באופן בלתי נשכח תאים מוטנטים לבטא אלמנטים טרנסגניים מתוך המלון המוגדר בדיוק כרומוזום⁴⁴. אלה חזקים בטכניקות תיוג vivo קומבינטורית סיפקו תובנות רבות לדינמיקה של שושלת היוחסין של תאים מחולל. עם זאת, ניתוחים אלה מבוצעים על רקמה קבועה, מתן תמונה של שיבוטים בודדים בשלב התפתחותי מוגדר. כדי לצפות בשינויים הדינמיקה השושלת של שיבוטים יחיד לאורך זמן, כרונית בשיטות הדמיה vivo דומה לאלה שבוצעו פיתול כישור למבוגרים בלבד צריך להיות מיושם⁴⁵.

פסיפס ניתוח עם סמנים כפולים (madm) הוא בעל עוצמה כפול תיוג צבע שיטה המאפשרת מעקב vivo השושלת של תאים בודדים של מחולל שושלת בעכברים^46,47. שני מרכיבים נחוצים עבור אירועים תיוג MADM להתרחש: ראשית, הקלטות MADM חייב להיות ממוקד זהה הרוח על הכרומוזומים הומוולוגיים. הקלטות מורכבות משני גנים של כתבת פלורסנט של צ'יאריק, eGFP (ירוק, [G]) ועגבניה דו-דימר (אדום, tdT [T]). הקלטת GT מכיל את ה-N-טרמינוס של egfp ואת C-הטרמינוס של tdt, מופרדים על ידי אינטרון המכיל אתר loxp. הקלטת TG בנויה בהיפוך, עם ה-N-טרמינוס של tdt ו-C הטרמינוס של egfp. שנית, הביטוי של היצור recombinase באותו תא המכיל את הקלטות madm ממוקד חיוני. בהעדר של היצור, הקלטות הצ לא מבטאותegfp פונקציונליים או tdt משום שרצפי הקידוד שלהם מובלים. אתרי ה-loxP משמשים כיעד לשילוב מחדש של מתווכת ביניהם, והתוצאה היא החוקה של שתי קלטות הביטוי בו זמנית. אם שילוב מחדש מתרחש במהלך השלב G2 של מחזור התא ואחריו הפרדה של X (G2-X), שתי התאים בתים לבטא אחד משני חלבונים פלורסנט. הוויסות הזמני של פעילות creer^T2 באמצעות טממוקסיפן (TM) מספק מידע מדויק על תאריך הלידה של שיבוטים madm ואת דפוסי החלוקה של צאצאי שלהם (איור 1a)^29,46,47.

MADM יכול פוטנציאל שיטתי תווית שיבוטים בודדים עם רזולוציה גבוהה תא יחיד במוח העכבר דומה מסורתי אך לא ספציפי שיטות מפרך כמו Golgi צביעת⁴⁸ או מילוי צבע⁴⁹. כי רק היזם המניע creer^T2 קובע את סוג התא ספציפיות של תיוג madm שבטים, madm יכול בעיקרון להיות מיושם עבור השושלת היוחסין מעקב בכל איבר murine ורקמות^47,50,51,52. אכן, מחקרים כבר השתמשו madm לחשוף את קשרי השושלת במשובטים שמקורם ברקמות שונות^{47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59}. תבניות ניסיוני madm הוחלו על שושלת היוחסין של הקרנה בקליפת המוח נוירונים, גליה, ותאי גזע לידה ב קליפת מוח מפתח^{7,11,12,46,60,61,62,63,64,65}. Madm שימש גם כדי ללמוד היוחסין של התאים בבית המשפחה gyrus מבוגרים, תלמוס, המוח בתאי גרגר עושה לבלר, ו interneurons ברמת המשובטים (ראה שולחן 1 עבור רשימה מלאה)^{47,53,54,56,57,66}.

תכונה ייחודית של MADM היא היכולת לקשר גנטית מוטציות מאשר לקלטת MADM אחד, ובכך ליצור פסיפס גנטי (איור 1B ואיור 2). התוצאה היא בתאי בת מסוג פראי המסומנים עם סמן פלורסנט אחד (tdT באיור 1B) ו homozygous מוטציה אחים עם השני (egfp באיור 1b) בסביבה heterozygous ללא תווית. MADM הוא ייחודי בניתוח זה השוואתי של שליטה subclones מוטציה ניתן לבצע בסביבה רקמה זהה ב vivo. במקור, הקלטות MADM המיועדים לתוך Rosa26 לוקוס⁴⁷, אבל ניתוח madm של הפונקציה גנטי היה מוגבל גנים המרוחק לוקוס. כדי להתגבר (לפחות חלקית) מגבלה זו ולהרחיב את האפשרויות של ניתוח מבוסס MADM הגנים, הקלטות MADM הפילו קרוב למרכז הריכוז של Chr. 7⁵¹, Chr. 11⁴⁶, ו Chr. 12⁵¹. מיקוד כל 19 העכבר האוטומטי עם הקלטות MADM הוא בעיצומו ויאפשר כמעט כל גן להיות למדו בעתיד, מתן פלטפורמה שאין כמוה למחקר של קשרי השושלת ההתפתחותית בשילוב עם ניתוח גנטי פונקציונלי.

Protocol

פרוטוקולי עכבר נבדקו על ידי מתקן ליבה טרום קלינית מוסדית (PCF) וועדה אתית פנימית ב IST אוסטריה. כל הרבייה והניסויים בוצעו תחת רישיון שאושר על ידי המשרד הפדרלי למדע ומחקר של אוסטריה בהתאם לחוקי החיות האוסטרי והאירופי.

1. גידול עכברים ניסיוניים לניתוח שבטים MADM

1. הגדר מתגים מתוזמנים של מערכת MADM (> P56; CD-1) בשעות אחר הצהריים המאוחרות (5:00 PM) ולבדוק אטמי הנרתיק ההליך בוקר (8:00 AM). הבוקר שבו התוסף נחשב כיום 0.5. ראה איור 2 למבט כולל על כיוונון ההזדווגות של העכבר הנסיוני. ודא כי נקודות זמן עבור אינדוקציה TM של פעילות וניתוח של Creer^T2 מתאימים לטיפול בשאלות ניסיוני.
   הערה: לקבלת מידע נוסף, התייחס לאיור 3 ולתוצאות מייצגות להלן.
2. לדגימה לאחר הלידה, להגדיר ברגים ליצור אמהות אומנה במקביל.
   הערה: יש להתחיל את היום עד 1 ימים לפני הקמת מספר מעבר ניסיוני.

2. האינדוקציה TM בעכברים MADM

1. להכין 20 mg/mL TM פתרון העבודה על ידי המסת אותו בשמן תירס בתוך 15 מ"ל או 50 mL הצינורית צנטריפוגה ו הצבת אותו על פלטפורמת נדנדה עבור ~ 4 h בטמפרטורת החדר (RT), הבטחת TM הוא התפרקה לחלוטין. חנות פתרון עבודה ב 4 ° c מכוסה רדיד אלומיניום ושימוש בתוך 2 שבועות.
2. כדי לגרום לאירועים שילוב MADM מחדש, לספק הזרקה אחת של TM intraperitoneally (IP) באמצעות מזרק 1 מ ג ו 25 גרם מחט לתוך סכר בהריון מתוזמן. בהתאם לשלב של נוירוגנזה קורטיקלית, הכנס TM בין E10-E15 במינון של 1-2 מ"ג/סכר בהריון. עבור נקודות זמן מוקדמות (כלומר, E10) להשתמש במקסימום של 1 מ"ג/סכר בהריון (25 מ"ג/ק"ג) כדי למנוע סיבוכים במהלך ההריון¹¹. עבור נקודות זמן בין E11-E15 להשתמש 2 מ"ג/סכר הריון (50 מ"ג/ק"ג)⁷.
   הערה: לחילופין, TM יכול להיות מנוהל עם gavage אוראלי עבור הריונות מאוחרת.
3. עבור ניתוח שבטים MADM לפוסט זמן לידה, לשחזר עוברים חיים ב E18-E19 באמצעות ניתוח קיסרי, ולאחר מכן לגדל גורים עם אמא אומנת.
   הערה: בהתאם למצב הבריאותי של האישה ההרה, ייתכן שלא יהיה צורך לבצע ניתוח קיסרי אך העלאת גורים עם האם המאמצת עדיין נדרש משום שהאמא המקורית TM מטופל עלול להיות בעייתי מניקה.
4. כדי לשחזר עוברים חיים על ידי ניתוח קיסרי או לאחזר נקודות זמן עובריים לניתוח, להקריב את הסכר בהריון על ידי פריקה צוואר הרחם.
5. מניחים את החיה במצב פרקדן ולחטא פרווה עם 70% אתנול. לעשות חתך קטן בעור בבטן התחתונה מעל הרחם באמצעות מלקחיים כירורגי ומספריים. להפוך את החתך השני דרך השרירים ואת הקיר שרירי הבטן כדי לחשוף את צפק.
6. להסיר את הרחם על ידי הפרדת הרקמות הסובבות עם מספריים. העבר הרחם ללא פגע על כפפה מלאה במים חמים כדי להגדיל את שיעור ההישרדות העובר עד שכל אחד מהם מוסר מן השפיר על בנפרד.
7. השתמש מספריים עדינים ואצבעות לפתוח בזהירות את קירות הרחם כדי לשחרר עוברי. אל תחתוך את מיתרי הטבור קרוב מדי לגוף כדי למנוע אובדן דם נרחב. אם יש להשתמש בעוברים לצורך ניתוח, המשך לשלב 3.9. , אם הגורים יהיו מאומץ. המשך לשלב 2.8
8. אם יש צורך בטיפוח, נקו את הגורים לפני שהעבירו לאמא המאמצת. בזמן ניקוי הגורים, הקישו בעדינות על החזה מפעם לפעם כדי להתחיל לנשום. הניחו חזרה על כפפה שנייה מלאה במים חמים כדי לשפר את שיעור ההישרדות.
   הערה: חשוב להסיר בעדינות את השפיר הנותרים ו/או השליה עם מגבת נייר.
9. לפני שהעבירו את הגורים לאמא המאמצת, הסר את האם המאמצת מהכלוב, הסר את הגורים המקוריים והחלף עם הגורים הניסיוניים. . החזר את האמא המאמצת לכלוב שלה
   הערה: עיין בדיון לקבלת הצעות נוספות לשיפור שיעורי הקבלה.
10. אם יש צורך בהקלדה, לאסוף ביופסיה או זנב בין P6-P8.
    הערה: בצע צעד זה רק אם רשיונות ניסוי בעלי חיים מאשרים פרקטיקה זו.

3. הכנת רקמות עבור שיבוטים MADM במוח

הערה: לניסויים הכוללים רקמת פוסט-לידה (≥ P4), המשך לשלב 3.1. עבור נקודות זמן עובריים והפוסטנטאל מוקדמת (P0-P3), המשיכו לשלב 3.9.

1. להפחית את בעלי החיים הניסיוני MADM עם הזרקת IP של פתרון קטמין/xylazine אזין (65 mg, 13 מ"ג, ו 2 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, בהתאמה) ולאשר כי העכבר אינו מגיב על ידי צובט את הרגל האחוריות.
   הערה: עכברים ממין זכר וגם נקבה MADM הנשי (CD-1 רקע) משמשים לניתוח. אם יש צורך בהקלדת הגנוזה, אסוף את ביופסיות האוזניים בשלב זה.
2. מניחים את החיה מורדם במצב פרקדן על מגש הניתוח זלוף ולחטא פרווה עם 70% אתנול. כדי להתחיל בניתוח, בזהירות לעשות חתך עם מספריים ומלקחיים כירורגי דרך השכבה החיצונית של העור ולאחר מכן החתך השני דרך שכבת השריר. הרימו את קצה עצם החזה וחתכו את רקמת החיבור בצדדים, ולוקחים זהירות נוספת כדי להימנע מחיתוך הכבד. חלל החזה יהיה גלוי.
3. לגזור את הסרעפת ולהרים כדי לחשוף את הלב. לקצץ בזהירות את כלוב הצלעות ואת הסיכה מגש כירורגי כדי לחשוף את הלב. . לגורים, הסר את כלוב הצלעות לחלוטין
4. הכנס מחט עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) לחדר השמאלי התחתון (רקמת paler). באמצעות מספריים קשתית קטנה לעשות חתך לקצה האחורי של האטריום הימני (רקמה אדומה כהה) כדי לנקז את הדם.
5. בצע זלוף עם PBS ואחריו מיד על ידי תוצרת טרייה, קרח קר 4% פאראפורמלדהיד (בלייס) הכין ב-PBS. עבור הגורים (P4-P10) להשתמש מזרקים כדי לבצע perfusion. מלא מזרק אחד עם 10 מ ל של PBS ואחר עם 10 מ ל של 4% בתחתית. ודא שכל בועות האוויר בתוך מזרקים הוסרו. עבור חיות מבוגרות יותר, השתמש במשאבה פריסטלטית.
6. התחילו בירי עם ה-PBS (10 מ"ל ב-2 ל -4 מ"ל/מינימום בגורים; 20 מ ל ב-4 ל-6 מ"ל/min למבוגרים באמצעות משאבה פריסטלטית). הכבד יהיה ברור וצהוב חיוור אם המחט ממוקם כראוי.
7. לאחר השלמת, להסיר את המחט מתוך הגורים ולהכניס את המחט המכילה למעלה לתוך החור אותו. עבור מבוגרים, לעצור את המשאבה הפריסטטית לפני החלפת הפתרון PBS עם קרח קר למטה, הקפד להימנע בועות אבובים ספיגה. המשך להמשיך עם השימוש בלגון (10 מ ל ב-2 ל -4 מ"ל/מינימום בגורים; 30 מ ל ב -4 מ ל/מינימום למבוגרים באמצעות משאבה פריסטלטית).
8. כאשר זלוף הושלמה, לערוף את ראשו של העכבר ולהסיר את המוח באמצעות ניתוח זהיר. העברת המוח ל 4% בכיוון הכיתה. השתמש לפחות 5x כרכים המוח (כלומר, ~ 5-10 מ ל של התחתית בתוך 15 מ"ל צנטר צנטריפוגה) ו דגירה לילה ב 4 ° צ' עבור קיבעון postperfusion כדי להבטיח קיבוע מלאה של רקמות. . המשך לצעוד 3.10
9. לרקמות עובריים ולרקמות הפוסט-לידה המוקדמות (כלומר, P0-P3), לאחר ביצוע סעיף קיסרי, ערוף את ראשו של העוברים במספריים. אם יש צורך בהקלדה, אסוף את זנב העובר בנקודה זו. מייד מבתר את המוח ומעביר לצלחת 12% המכילה 2 ל -3 מ ל של 4% בחצי הג. המשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס לקיבוע.
10. בשעות הבוקר שלאחר ההחלפה בלרוק עם 10 מ ל (מבוגר) או 2 ל-3 מ ל (העובר) של PBS וחזרה לכביסה 3 x עבור 15 דקות ב-RT. העברת רקמות ל 30% סוכרוז במאגר פוספט (PB) והחנות ב 4 ° c על פלטפורמת נדנדה עד הרקמה כיורים בתמיסה.
11. הטמע את המוח בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בתבנית הטבעה, ודואגת לכוון את המוח לכיוון משני הצדדים או למשונן. הקפא על ידי הצבת תבנית ההטבעה על קרח יבש עד שאוק הופך לאטום לחלוטין (~ 10-15 דקות). לאחסן רקמות ב-80 ° c עד שימוש נוסף.

4. הכנת רקמת MADM עבור אימונוהיסטוכימיה

1. חבר את בלוק הרקמה לדיסק הדגימה בקריוסטט על ידי החלת טבעת של OCT לדיסק והצבת הבלוק ישירות לתוך ה-OCT כאשר הוא מתחיל לקפוא. ודא שהבלוק מכוון כראוי למישור החיתוך הרצוי.
   הערה: כאן, הודעה מקורלית לחקור שיבוטים MADM קורטיקלית מתוארת בפרוטרוט.
2. הגדר את טמפרטורת הבלוק בקריוסטט ל-20 ° c וטמפרטורת הלהב ל-21 ° c.
3. אפשר לחסום את הרקמה להסתגל לטמפרטורה הקאמרית על ידי הרכבה של הדיסק הדגימה למחזיק הדגימה ולעזוב בהקפאה עבור ~ 5 דקות לפני תחילת החסימה.
4. חיתוך בלוק במקטעים עבים (45 עד 60 μm) עד להגעה לאזור הרקמה של הריבית.
5. ברגע שקצה הקליפה נראה בבירור, הפסק לפרוש ונעל את הלהב. ודא שהלהב מוגן לפני גזיזת הבלוק.
6. קצץ את OCT העודף מסביב לרקמה בלהב, ועוזב ~ 1-2 מילימטר של OCT בכל צדי המוח.
7. הבא האוריינט הבלוק כך שאחד הקצוות הצדדיים של הקליפה מכוון כלפי מטה והשני כלפי מעלה (כלומר, הקצה הrostral ביותר של הקליפה מכוון ימינה).
8. התחל לסדר עם עובי של 45 יקרומטר עבור שיבוטים למבוגרים ו 30 יקרומטר עבור שיבוטים עובריים. לבצע כל מקטע בנפרד ולהשתמש מברשת קטנה כדי לשמור על האזור מתחת לסכין נקי של כל פסולת שנותרה בעת גזיזת את הבלוק.
   הערה: אם הדבר לא נעשה ומקטע נופל, ייתכן שיהיה קשה לקבוע את הסדר הנכון של הפרוסות.
9. אם מקטעים מתחילים תלתל, לקצץ את קצות הבלוק ו/או בזהירות להתאים את צלחת הזכוכית אנטי רול.
10. לניתוח שיבוט עובריים, מקטעי הטעינה ישירות לשקופית חלבית. ייבוש על צלחת חימום ב 37 ° c לפני שממשיכים ישירות לשלב 5.6.
    הערה: ניתן להוסיף מספר מקטעים לשקופית אחת, אך להבטיח שהסדר הרציף יישמר.
11. כדי לאסוף שיבוטים מבוגרים, להכין 24 לוחות המכיל 1 מ ל של PBS/ובכן (בדרך כלל, 5-6 לוחות למוח). החל מן הבאר הראשונה, עם מלקחיים קר לאסוף סעיפים סדרתיים בודדים ב-PBS לפי סדר המיון.
    הערה: שיטת הסעיף הצף מאומצת לרקמת מבוגרים כדי להבטיח שאין מקטעים שאינם מחמיץ ושמקטעים נטענים אינם מכילים קמטים.
12. הפסיקו לדבר ברגע שיגיע סוף הקליפה.
13. עבור שיבוטים למבוגרים, המשך להרכבה מקטעים צפים.
    הערה: ניתן לשמור מקטעים ב-PBS ב-4 ° צ' עד 24 שעות.

5. הרכבה רקמות מבוגרים להדמיה

הערה: הכלים הבאים נדרשים: מברשת צבע קטנה, צלחת פטרי, PBS עם 0.5% רצף (PBS-T), שקופיות הדבקה (טבלת חומרים), הרכבה בינונית (טבלת חומרים), כיסוי, ומלקחיים.

1. ממלאים צלחת פטרי עם PBS-T.
   הערה: חומרי ניקוי משמשים לסיוע בתהליך ההרכבה. אם הצביעת עבור אנטיגנים נוספים רגישים לדטרגנטים (כלומר, גליקורופנס) הוא הכרחי, עדיף לדלג על תוספת של רצף.
2. הנח שקופית הדבקה לתוך ה-PBS-T כך שהיא כמעט מכוסה עד לתווית.
3. העבירו את החלק הראשון. לערוץ הPBS-טי
4. באמצעות מברשת צבע קטנה, לתמרן את הקטע על השקופית ולסדר אותו כדי לשמר את סדר החיתוך. המשיכו באותו אופן עם כל הסעיפים הנוספים.
5. לאחר שכל המקטעים נמצאים במיקום, הצב את השקופית (~ 12 לל16 מקטעים/שקופית) בחדר שקופית כהה. הרימו מעט את המכסה כדי לאפשר לחלקים להתייבש לחלוטין (~ 10-20 דקות) ולהבטיח שהם יישארו מלאים בצעדים הבאים.
6. במקרה של ביצוע אימונוהיסטוכימיה עבור אנטיגנים נוספים, המשך ישירות לסעיף 6 או 7.
   הערה: עבור נקודות זמן עובריים, יש צורך לבצע שלבים מותמים עבור לפחות GFP ו-tdT (סעיף 6). עבור שיבוטים למבוגרים, זה נדרש רק אם הצביעת עבור אנטיגנים נוספים במקביל (סעיפים 6 ו -7).
7. מייבשים ורוחצים את סעיפים 1 x עם PBS 1x עבור 5 דקות כדי להסיר PBS-T שיורית. להחיל ~ 1 mL של 4 ′, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) מדולל ב-1x PBS (1 μg/mL) לשקופית, להבטיח את כל הסעיפים מכוסים ו מודלת עבור 15 דקות.
8. הסר בזהירות את ה-DAPI ושטוף 1x עם PBS 1x עבור 5 דקות. הסרת העודפים PBS ויבש עבור ~ 1 על 2 דקות לפני הטבעה ב-110 μL של הרכבה בינונית. חותם עם שמיכות 24 x 60 מ"מ ולתת יבש לפחות 3 h לפני הדמיה.

6. כתמים חיסוני של GFP ו-tdT בלבד

הערה: סעיף זה נחוץ עבור שיבוטים עובריים.

1. מניחים את השקופיות אופקית בחדר הדגירה של מחולל שקופיות. סמן גבולות שקופית באמצעות סמן שעווה כדי למזער את כמות המאגר הדרושה.
2. מייבשים מקטעים עם 1x PBS. כדי לשפר את איכות הצביעת, לעבוד עם רקמה טרייה.
3. הוסף 250 ליטר מאגר חוסם (0.5% טריטון X-100, 2-3% סרום חמור רגיל ב-1x PBS) לכל שקופית, וודא שכל המקטעים מכוסים. . מודטה לשעה
   הערה: ריכוז חומרי הניקוי (טריטון X-100 או רצף הזמן 20) ישתנה בהתאם לנוגדנים העיקריים הנוספים המשמשים כיוון שמספר אנטיגנים רגישים יותר לדטרגנטים מאחרים.
4. הסרת מאגר חסימות והוספת נוגדנים ראשיים לחסימה במאגר לשקופית (300-400 μL/שקופית).
   הערה: דוגמה לתגובת נוגדן ראשונית סטנדרטית נגד GFP/anti-tdT (MADM) יכול להשתמש עוף נגד GFP (1:500) ו ארנב anti-RFP (1:500).
5. דגירה עם נוגדנים הראשי לילה ב 4 ° c.
   הערה: השקופיות חייבות להיות מודולות לחלוטין אופקית עם מאגר המכסה את כל המקטעים. אחרת, כתמים לא מאוזנים או ירודים עלול לגרום.
6. אשר בבוקר שלמחרת שמאגר החסימות עם הנוגדנים הראשיים עדיין מכסה את כל המקטעים בשקופית. אם לא, חזור על צעד הדגירה עבור 3 עד 4 h בשעה RT.
7. הסר נוגדנים עיקריים ולשטוף 4x עם PBS 1x עבור 10 דקות ב RT.
8. הוסף נוגדנים משנית מדולל במאגר חסימת לשקופית (300 ליטר μL/שקופית): אלקסה Fluor 488 נגד עוף IgG (1:500) ו Cy3 אנטי ארנב IgG (1:500).
9. מודטה ב RT עבור 2 h. השאר שקופיות מכוסות מאור כדי למנוע הלבנת של fluorophores.
10. הסר נוגדנים משניים ושטוף 2x עם PBS 1x עבור 10 דקות.
11. דגירה עם DAPI מדולל ב-PBS (1:5000) עבור 15 דקות.
12. שטוף סעיפים 1x עם PBS 1x עבור 10 דקות.
13. להסיר את העודפים PBS ויבש עבור ~ 1 על 2 דקות לפני הטבעה של 110 μL של הרכבה בינונית.
14. חותם עם שמיכות 24 x 60 מ"מ ולתת יבש לפחות 3 h לפני הדמיה. תמונה שקופיות בתוך 1 עד 2 שבועות לאחר ביצוע אימונוהיסטוכימיה כדי להבטיח אות אופטימלי.

7. כתמים חיסוני של GFP, tdT, ו אנטיגנים נוספים

1. בצע את השלבים 6.1-6.3.
2. הסרת מאגר חסימות והוספת נוגדנים ראשיים לחסימה במאגר לשקופית (300-400 μL/שקופית).
   הערה: כאשר מכתים שלושה או יותר אנטיגנים (כלומר, GFP, tdT, וחלבון של עניין) ואת הנוגדן עבור חלבון הריבית הועלה בארנב, מומלץ להשתמש anti-tdT (עז) הנוגדן הראשי על דילול של 1:500. דוגמה לתגובת נוגדן העיקרי עבור שלושה אנטיגנים עם כתמים tdT חלופיים יכול להשתמש עוף נגד GFP (1:500), עז anti-tdT (1:500), ו נוגדן נגד חלבון הריבית (כלומר, ארנב).
3. בצע את שלבים 6.5-6.7.
4. הוסף מיקס נוגדן משני מדולל במאגר חסימת לשקופית (300 ליטר-400 μL/שקופית): אלקסה Fluor 488 נגד עוף IgG (1:500), Cy3 נגד עז IgG (1:500), ו אלקסה Fluor 647 אנטי ארנב IgG (1:500).
5. בצע את השלבים 6.9-6.14.

8. רכישת תמונה וקוונפיקציה של שיבוטים MADM

1. לזהות ולתעד את הסעיפים המכילים שיבוטים ואת מיקומם בקליפת המוח.
   הערה: מספר המקטעים שמתפרס על-ידי שיבוט ישתנה בהתאם למועד המושרה של השכפול, למנהל ההתקן של Creer^T2 ולזמן הניתוח. ניתן לבצע שלב זה גם במיקרוסקופ מוקד או במיקרוסקופ אפיפייתי.
2. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, להתחיל על ידי בחירת וקביעת התצורה של קווי לייזר נכונה מסננים. עבור מוחות MADM, בחר DAPI, GFP, ו-tdT (עירור: 358 nm, 488 nm, ו 554 nm, בהתאמה; שיא פליטת: 461 nm, 507 nm, ו-581 nm, בהתאמה). ודא שהחור מוגדר ליחידה אוורירית אחת לאיכות הדמיה אופטימלית.
3. עבור הגדרות ספציפיות המוקד, שיבוטים תמונה עם מטרה 20x ו-1x זום. עבור תמונות שישמשו בכמת, השתמש בערך מהירות סריקה לשכון בערכים של 1.52-2.06 μs (ערכים 7-8 בתוכנה לרכישת תמונות) ללא ממוצע. להתאים את עוצמת הלייזר ולהשיג הגדרות עבור כל ערוץ לפי הצורך.
   הערה: בהתאם לאיכות התמונה הדרושה, הגדרות עבור מהירות סריקה וחישוב ממוצע עשויות להשתנות.
4. לאחר שיבוט מזוהה בבירור, לארגן אריחי הדמיה כדי לכסות את כל הסעיפים הרלוונטיים שיבוט. התאימו את מחסנית ה-z כך שכל התאים המסומנים ב-MADM בשכפול נלכדים עם מרווח זמן של פרוסת מחסנית 1.5 μm/z. כוונן את אזור האריחים כך שרוחב כולו של קליפת הקליפה ייתפס בעת הדמיה של השכפול (כלומר, ממשטח הפיקה אל ה-callosum).
5. תמונה שיבוטים בודדים פורש מקטעים מרובים ברציפות, להבטיח כי כל מקטעים ללא תאים בתוך שיבוט הם עדיין בתמונה למטרת שחזור תלת-ממד ופרשנות נכונה של מידע מרחבי התא.
6. לנתח כל מקטע המכיל תאים של שיבוט MADM ברציפות מrostral אל קצה caudal של קליפת המוח. הבחנה בודדים נוירונים ו גליה מבוסס על המבנה שלהם ו/או סימן כתמים. הקלט מידע מעבר במקביל לפי גבולות השכבות המתאימות שהוגדרו על-ידי כתמים גרעיניים (DAPI).
   הערה: ראו איור 4 עבור תוצאות מייצגות לניתוח עובריים ואיור 5 עבור תוצאות מייצגות לניתוח למבוגרים.

9. סדרתי 3D שחזור של שיבוטים

הערה: שחזור תלת-ממד של שיבוטים בודדים המוצגים על מקטעים המוח הסדרתי הוא שימושי עבור תצוגה חזותית, כמו גם ניתוח של ארכיטקטורות שבטים תלת-ממדיים, ניתן לבצע בהתאם לשלבים הבאים.

1. תפר והפתיל מיזוג תמונות באריחים מבוסס על פרמטרי רכישה באמצעות תוכנה לרכישת תמונות. פתח קובץ. czi ולאחר מכן הפעל את שיטת התפרים תחת הכרטיסייה עיבוד בתוכנה זן (zeiss).
2. ייצוא ערימות תמונה תפור כמו z מטוסי מטוסים בפורמט TIFF. פתח את הקובץ תפור. czi ולאחר מכן הפעל את שיטת ייצוא התמונה תחת הכרטיסיה עיבוד . עבור תמונות רב-ערוצי, לייצא כמו תמונות אדום/ירוק/כחול לעיבוד התמונה הבאה.
3. חזור על שלבים 9.1 ו-9.2 עבור כל חלק במוח הטורי של שיבוט.
   הערה: לשחזור מדויק תלת-ממדי, כל חלקי המוח בתוך שיבוט, כולל אלה ללא תאים המסומנים בתווית, חייבים להיות גם מעובדים.
4. ששרשר תמונות בודדות לערימה אחת בסדר החל מrostral ביותר כדי להגיע למישור ה-caudal z ביותר באמצעות תוכנת עיבוד תמונות קוד פתוח כגון imagej/פיג'י^67,68.
   הערה: יש להסיר את כל התמונות הריקות בקצות כל מקטע מוח.
5. במקרה הצורך, תקן את מחסנית התמונה שמתקבלת משלב 9.4 עבור יישור שגוי באמצעות התוסף ImageJ שנקרא "Multistackreg" על-ידי ביצוע השלבים 9.5.1-9.5.5. אם אין צורך ביישור תמונה, המשך לשלב 9.6.
   הערה: תוסף זה מבצע יישור תמונה של הערוץ עם הניגודיות הגבוהה ביותר (בדרך כלל DAPI) ולאחר מכן מחיל את השינוי המוקלט על ערוצים אחרים, ובכך מאפשר יישור תמונה אמין של ערימות רב-ערוצי. תוסף עזר שנקרא "Turboreg" חייב להיות מותקן מראש.
   1. ב-ImageJ, התקן את התוספים "Multistackreg" ו-"turboreg".
   2. פתח את ערימת התמונות של תמונות שיבוט שהתקבלו משלב 9.4 ליישור. פצל ערוצים לתוך DAPI (כחול), GFP (ירוק) ו-tdT (אדום) בתוך אפשרות הצבע תחת כרטיסיית תמונה .
   3. הפעל "Multistackreg" תוסף כדי ליישר ערוץ dapi על ידי שינוי "גוף נוקשה" ולשמור את קובץ השינוי.
   4. החל את קובץ ההמרה השמור על שני הערוצים האחרים באמצעות "Multistackreg".
   5. מזג את כל שלושת הערוצים המיושרים ושמור את המחסנית המיושרת.
6. כדי לכוון את השכפול ב-ImageJ לסובב מחסנית של תמונות שיבוט שהתקבלו משלב 9.4 (או step 9.5.5 לאחר יישור) בכיוון אנכי עם משטח pial על גבי הקצה התחתון של הקורפוס. . חתוך במישור הxy במידת הצורך
7. עבור מצגת איכותית וניתוח כמותי, צור תמונה מקסימלית של הקרנת z (שלב 9.8) או בצע עיבוד תלת-ממדי (שלב 9.9) של השכפול.
8. ב-ImageJ, פתחו את מחסנית התמונה משלב 9.6 ובחרו אפשרות הקרנה Z עם עוצמת הקרנה מקסימלית. זה יפיק תמונה של השיבוט כולו מוקרן על אותו מישור.
9. ב-ImageJ, פתחו את מחסנית התמונה משלב 9.6 ובחרו בפונקציה 3d של פרוייקט z כדי ליצור הדמיה תלת-ממדית של השכפול שניתן לסובב.
   הערה: חשוב בשלב זה כדי להזין את מרווח הפרוסה הנכון המקבילה לעובי הערימות הבודדות במהלך רכישת תמונה. יש להשתמש בכלי האינטרפולציה כדי להסיר פערים בין פרוסות.

Results

MADM תוצאות החוקה של חלבונים בצבע ירוק ואדום פונקציונלי עם שתי תאים בתים כל אחד ביטוי אחד משני חלבונים פלורסנט על כרומוזום G2-X אירועי הפרדה (איור 1א). בגלל אירועים MADM התוצאה לתיוג קבוע וברורים של שני ליננים הצאצא, הערכה הניתנים לשינוי של התאים הירוק והאדום של תא ביתי (subclones) ניתן לבצע. משתנים כולל דפוס חלוקה (למשל, סימטרי לעומת אסימטרי) ופוטנציאל (למשל, מספר צאצאי) של הקדמון המקורי ניתן לקבוע.  כימות כל שיבוט מסומן בתווית משנה כאשר בדיעבד לקבוע אם התא המקורי הקדמון עובר מחלקות ההתרבות סימטרי, או אסימטרי, מחלקות נוירוגניים בזמן האינדוקציה TM. מחקרים קודמים מקובצים Emx1-creer^t2 או nestin-^T2 creer שיבוטים השלכה הנגזרים ההטלה בקליפת המוח לשתי^{שיעורים}רחבים⁷,^11,46. הראשון, כינה "שיבוטים סימטרי מתרבים", מורכבים בממוצע של מספר ניכר של נוירונים, עם שני שיבוטים ירוק ואדום המכיל ארבעה או יותר נוירונים כל אחד. הקבוצה השנייה, "שיבוטים אסימטריים" מגדיר מחלקה של שיבוטים שבהם "מיעוט" תת-שיבוט מכיל פחות משלושה נוירונים ואת "הרוב" subclone, ארבעה או יותר¹¹. הגדרות אלה הם ספציפיים RGPs בקליפת המוח וייתכן שיהיה צורך לעבור בעיון עבור אזורי מוחי אחרים ורקמות. עבור שני כיתות של שיבוטים קורטיקלית, צאצאים יחולקו לאורך שכבות שטחיות ועמוקים.

בעת עיצוב לימודי שבטים MADM יש מספר היבטים שיש לקחת בחשבון. הזמן שבו אירועים MADM המושרה על ידי המינהל של TM הוא שיקול מפתח (איור 3). עבור הקרנה בקליפת הבית הטלה ההקרנה MADM שיבוטים (כלומר, באמצעות Emx1-CreER^T2 או Nestin-Creer^T2) ב E10, כמעט כל rgps היו עדיין במחלקות סימטרי¹¹. לכן, אינדוקציה ב E10 עם TM לכדו סיבובים מרובים של הגברה RGP מתרבים והביא שיבוטים עם מספרי עצב גבוה. עם זאת, מספר RGPs ב E10 היה בדרך כלל קטן, ולכן הממשל TM שנוצר מאוד מאוד אירועים MADM (לפעמים פחות מאחד לכל מוח). רוב ה-RGPs הוחלף ממחלקות נוירוגניים סימטריות בסביבות E12. כדי למקד את המשובטים הנוירוגניים אסימטרי לחלוטין, זה היה הטוב ביותר לגרום ב-E12 או מאוחר יותר (איור 3). הזמן בין אינדוקציה TM והתבוננות שילוב מחדש של MADM האירועים בקליפת המוח נטו להיות פחות מ -24 h. הזריקות היו השיטה המועדפת לניהול TM בשלבים עובריים עבור שיטה זו משום שהוא הוביל לשגות יותר בשבטים. חשוב גם לשמור על מינון TM למינימום משתי סיבות. ראשית, אם מגדיל את הקצב מחדש MADM, ההסתברות של גרימת מרובים, אולי חופפים, שיבוטים הוא גבוה יותר. שנית, אם הרבה יותר מדי TM מועברת, שיעור מוגבר של הפלות, העובר מחדש, וגדלים המלטה קטן יותר עשוי להיות נצפתה. הפלות בערך כמחצית של כל הסכרים בהריון נצפתה כאשר זריקות TM נמסרו ב E10. תדירות זו ירדה מ E11 ופחתה ל כ 1/3 בקירוב של סכרים הריון ביטול. לסיכום של מינונים TM, האינדוקציה פעמים, ונהגים Creer^T2 המשמשים במחקרים madm הקודם, להפנות לטבלה 1. פעילות עיתונאי בהעדר TM נצפתה עם כמה TM-inducible Creer^T2 מנהלי התקן T2⁶⁹. ביטוי חוץ רחמי או MADM שילוב אירועים מחדש בהעדר TM לא נצפתה עם Emx1-Creer^t2 של מנהלי ההתקנים ^T2 של nestin-creer . זה עשוי להיות באופן חלקי בשל העובדה כי TM בתיווך כרומוזום טרנס שילובים להתרחש בערך 1:1000 כדי 1:10000 בתדר נמוך יותר מאשר cis-שילובים, הפחתת ההסתברות של התוויות MADM רחמי.

גורם נוסף שכדאי לשקול בעת תכנון ניסוי בניתוח שבטים MADM הוא משך המחקר. שינוי אורך הזמן בין אינדוקציה TM וכאשר הניסוי היה ניתח (א) (חלון זמן) מציג את הדינמיקה של תא גזע לאורך זמן⁶⁴. חלונות זמן עובריים קצרים (כלומר, TM/E11-A/E13; TM/E11-A/E16) כבשו את הדינמיקה של נוירוגנזה עובריים (איור 4). השוואת שיבוטים משני חלונות או יותר זמן מספק תובנה כמותית למספר התאים המיוצרים ואיך התפלגות העצב משתנה בשלבים שונים של התקדמות השושלת⁶⁴. כדי ללכוד את כל הפוטנציאל של שיבוטים בודדים, יש צורך להאריך את חלון הזמן שנותחו לתוך לידה או מבוגרים timepoints^7,11,12. דוגמאות של שיבוטים נאוקורטיקליים המושרה העובר ונותחו במבוגר מוצגים באיור 5. של הערה, נוירוגנזה קורטיקלית היא השלימה ברובו, gliogenesis מגדילה על ידי E17. כ 1/6 rgp נוירוגניים גם להמשיך ליצור אסטרוציטים ו/או oligodendrocytes הפוך¹¹.

שיבוטים סימטריים להתרחש כאשר RGPs עוברים אחד או יותר סיבובים של חלוקה מתרבים¹¹. שיבוטים RGP המושרה בין E10-E12 היו בממוצע גדול יותר בגודל וסיפק יותר תכונות מרחבי של התפלגות תא העצב הסופי (איור 4A-C). שיבוטים עם נוירונים באופן יחסי מופץ יחסית ברחבי שכבות עמוק ושטחי לקח על "גליל" צורה תוך שיבוטים עם נוירונים יותר מפוזרים בשכבות שטחיות מאשר שכבות עמוקות פיתח "חרוט" צורה¹¹. כדי ללכוד במלואו את המידע המרחבי והורפולוגית של שיבוט, היה צורך לשחזר באופן משני את כל השכפול באמצעות תמונות רציפות. כדי למדוד פיזור שבטים, הפיזור הרוחבי המקסימלי (שנמדד בכל הממדים) ברבדים שטחיים (LII-VI) של שיבוט הושוו לפיזור הנוירונים ברבדים עמוקים (LV/ליב). יחס זה (התפלגות עליונה: הפצה נמוכה יותר) סיפק הבדיקה הניתנת לכימות של צורת השכפול הכוללת.

שיבוטים אסימטריים, היכן שיבוט המיעוט היה שלוש או פחות, סיפק תובנה לפלט העצבי של rgp יחיד (איור 4D-F ואיור 5a-f)^7,11,12. אוכלוסיית רוב (subclone גדול) יכול להיות מתויג גם באדום או ירוק, עם ממוצע של כ -7 הקרנה מרגש הנוירונים לכל שיבוט כאשר המושרה באמצעות Emx1-creer^t2 או nestin-creer^t2(איור 5G)^7,11,12. המספר הכולל של תאים שיבוט MADM יכול להיות נוסף על ידי ניתוח התפלגות הנוירונים בשכפול גדול ברחבי שכבות שטחיות ועמוקים. אוכלוסיית המיעוט (תת-שיבוט קטנה) הותווית על ידי הצבע ההופכי והייתה בממוצע 1-2 תאים לכל שיבוט (איור 5H). סה כ "גודל יחידה", אשר היה בממוצע 8-9 נוירונים, יכול להיות מחושב על ידי הוספת משנה קטנים וגדולים יחד (איור 5I)^7,11,12. חשוב לציין כי בעוד הפלט העצבי של rgps היה צפוי מאוד, היה מידה של שבטים טרוגניות^12,70.

הקדמה של מוטציה באמצעות הקלטת MADM מאפשר את הדור של פסיפסים גנטיים, מתן שיטה ייחודית לנתח את הרגולטורים המולקולריים של התקדמות השושלת של תא גזע. ככזה, MADM מספק פלטפורמה ניסיונית ללא תחרות כדי ללמוד את הפונקציה האוטונומית התא של הגן (למשל, האגודה שלה microcephaly או macrocephaly). על ידי השוואת שיבוטים המושרה בפסיפס גנטי MADM למשובטים המושרה ב-MADM שליטה, הבדיקה כמותית מאוד של שינויים מספרי נוירונים והפצה ניתן ליצור. מחקרים מבוססי MADM הקודם לכמת את הפונקציה האוטונומית התא של Otx1 ב microcephaly היווצרות ברמת המשובטים (ראה איור 6A-E עבור דוגמה ייצוגית)¹¹. במחקר אחר, ניתוח שבטים MADM הראה כי Ndel1 אינו תא באופן עצמאי לווסת מספרים תא הקרנה, אבל במקום את היכולת של נוירונים היילוד להיכנס או להעביר בתוך הצלחת קליפת המוח, אשר מאוחר יותר צורות קליפת המבוגר⁴⁶. מחקרים אלה הפגינו את האופי הכמותי ביותר של ניתוח שבטים MADM בחקר הפונקציות האוטונומית התא של גנים המסדירים פיתוח קורטיקלית. אין כרגע דוגמאות בספרות באמצעות MADM ללמוד גנים מעורבים מקרוצפליה ברמת המשובטים. עם זאת, במחקרים עתידיים בניתוח של גנים הרלוונטיים לשליטה בגודל הקורטיקלית בכלל יכולים לספק תובנות רצויות מאוד ברמה המולקולרית והתאית.

איור 1: עקרון MADM למעקב אחר השושלת וניתוח שבטים במפלס תא גזע אחד. (א) לבצע מעקב אחר השושלת וניתוח שבטים עם madm, שני רכיבים חייב להיות נוכח. ראשית, יש לכוון את הקלטות MADM לאותו משכן זהה על כרומוזומים הומוולוגיים. הקלטות מורכבות משני גנים של כתבת פלורסנט של צ'יאריק, eGFP (ירוק, [G]) ועגבניה דו-דימר (אדום, tdT [T]). הקלטת GT מכיל את ה-N-טרמינוס של egfp ואת C-הטרמינוס של tdt, מופרדים על ידי אינטרון המכיל אתר loxp. הקלטת TG בנויה בהיפוך, עם ה-N-טרמינוס של tdt ו-C הטרמינוס של egfp. שנית, הביטוי של היצורים recombinase חייב להתרחש בתא המכיל את הקלטות madm המיועד. אתרי ה-loxP משמשים כיעד לשילוב מחדש של מתווכת היצורים, והתוצאה היא החוקה של שתי קלטות הביטוי בו זמנית. אם שילוב מחדש מתרחש במהלך השלב G2 של מחזור התא ואחריו הפרדה X (G2-X), שתי התאים בתים יהיה לבטא אחד משני חלבונים פלורסנט. (ב) עקרון מאדמ לניתוח של פסיפס גנטי ברמת שיבוט אחת. אלולים מוטנטים (מוטציות הנקודה, מחיקות, הוספות, loxp-מוקף תנאי אללים מותנה כפי שתוארה באיור 1b, וכו ') ניתן להציג מחדש את הקלטת TG-madm באמצעות השילוב meiotic (לראות איור 2 ו היפאנמייר ואח '⁴⁶ לפרטים על איך להציג אללים מוטציות ל אם recombinase מתווך-X מתווכת הקשר בין השני מתקיים בין הקלטות madm זה התוצאות באחד gfp + homozygous מוטציה תא (genex^-/-) הגן של עניין אחד tdt + homozygous תא סוג פראי (genex^+/+) בסביבה heterozygous בלתי מתויג^46,47,71. התוצאות תיוג חלופי לא נעשה שימוש בניתוח המשובטים (כלומר, תאים צהובים) תוארו בעבר בפירוט^11,46,47. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערכות רבייה עבור הדור של עכברים MADM ניסיוני עבור מעקב השושלת. מערכת רבייה עבור הדור של שליטה MADM (א) ו ג'ין X madm (ב) הניסויים עכברים לניתוח שבטים. למידע נוסף אודות תבניות הרבייה של madm ר' ביטלט ואח '⁷ והיפאנמייר ואח '^7,46. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מסלול הזמן בדיקת שושלת היוחסין מבוסס MADM מבוססי. סכימטי של חלונות הזמן עיצוב ניסיוני. עבור תבניות האורך של הדגימה, נקודת הזמן של אינדוקציה שיבוט נשארה קבועה ואורך התקופה לפני ניתוח מגוונת. בדגימת מרווח מתקדם, נקודת הזמן של הניתוח נשארה קבועה, אך זמן האינדוקציה מגוון. ניתן להשתמש בשילוב בין אחת לשתי הגישות בהתאם לשאלות שמטופלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח שבטים MADM המתפתח והבוגר בקליפת המוח. TM בתיווך madm אינדוקציה שיבוט ב סימטרי מתרבים (tm ב E10) (A-C) ו סימטרית תפלת רכזית (tm ב E12) (D-F) חלוקת rgps. מתוארים הם שיבוטים מאדמ בודדים ב vivo בפיתוח (TM/E10-a/E16 ו-tm/E12-a/E16) (ב, E) ובוגרים (tm/E10) (C, F) ב -madm-11^GT/TG; Nestin-creer^{T2 +/-} (ב, ה) ו -madm-11^GT/TG; Emx1-creer^{T2 +/-} (ג, F). הפלט תא העצב היה עצמאי של צבע שיבוט והרוב ירוק/תת מיעוט שיבוטים יכול להיות מושווה הרוב⁷האדום/מיעוט שיבוטים תחת תנאי^{שליטה 7,11}. כ 1/6 של שיבוטים למבוגרים גם הכיל אסטרוציטים ו/או oligodendrocytes הפוך, המצוין על ידי כוכביות לבנות. פאנלים B ו- F משוחזרים באישור היפאנמייר ואח '^מ46 ורונדס וסימונס⁷², בהתאמה. CP = לוחית הקורטיקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח שבטים MADM כדי ככמת RGP בתיווך פלט תא העצב. ניתוח של הפקת תא עצב (יחידת) הפקה של מערכת העצבים האינדיבידואלית ברמת המשובטים באמצעות MADM^7,11. (א) הפרדיגמה הניסיונית לגרימת שיבוטים מmadm אסימטריים בעיקר בקליפת המוח המתפתחת. (ב) אפשרי שיבוט אסימטרי התוצאות עם שיבוט משנה הרוב המסומן בצבע ירוק או אדום (C) מקטעים רצופים הפורש שיבוט אסימטרי נוירוגניים אחת (D, E) 3d שחזור תמונות של הנציגה אסימטרית מג-X שיבוטים מmadm עם רוב האוכלוסייה באדום (ד) או ירוק (E) ב madm-11^GT/TG Emx1-CreER^{T2 +/-} עם אינדוקציה TM ב E12 וניתוח ב P21. הערה התאים הירוקים והאדומים המסומנים הם סוג פראי. (F) סכמטי המציין את שני התוצאות הנסיוניות האפשריות madm שיבוט. (ז) קוונפיקציה של גודל האוכלוסייה רוב הנובעים מחידוש RGPS ב madm-11 שיבוטים. (ח) קוונפיקציה של גודל אוכלוסיית המיעוט הנובעים מחידוש rgps ב madm-11 שיבוטים. (I) כימות של הגודל היוניטרית של המשובטים הנוירוגניים מדגני-11. ערכים היפוטעיים יכולים לייצג ממוצע ± SEM. סרגל קנה מידה = 100 יקרומטר (D ו- E). TM = טמוקסיפן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח שבטים MADM כדי ללמוד גנים להוביל microcephaly ו macrocephaly. ניתוח היפותטי MADM שבטים התוצאות בעת ביצוע ניתוח גנטי פונקציונלי של גנים המועמדים להוביל microcephaly או macrocephaly. כדי לנתח את הפונקציות האוטונומיות התא של גן של עניין (gene X) על פלט תא העצב, madm דורש מוטציה אללים כדי להיות מוצג בפני הקלטות madm דרך reiotic שילוב (לפרטים כיצד להחדיר אללים המוטציות לתוך מערכת madm לראות גם איור 2, היפאנמייר et al.⁴⁶, ו laukoter et al.^46,73). (א, ב) סכמטי המציין את הפרדיגמה הניסיונית MADM לניתוח פונקציונלי של יחידות RGP שבטים. שיבוט התת-מוטציות יכול ליצור את אוכלוסיית המיעוט (A) או הרוב (B). (C-E) ניתוח היפותטי MADM שבטים התוצאות כאשר כימות שליטה MADM (ברים לבנים), ג'ין-x madm microcephaly (ברים אפורים) ו -ג'ין-x madm מקרוצפליה שחור ברים) אסימטרי שיבוטים. (ג) קוונפיקציה של גודל אוכלוסיית הרוב. (ד) קוונפיקציה של גודל אוכלוסיית המיעוט. (ה) קוונפיקציה של הגודל האוניטרי של שיבוטים נוירוגניים אסימטריים. ערכים היפוטטיים יכולים לייצג את הממוצע ± SEM. S = תרחיש היפותטי שבו ההפרש במספר התאים המשניים של השכפול עשוי להגיע למשמעות, יחסית לשליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שולחן 1: לימודי שבטים MADM בספרות. סיכום של מחקרים בספרות המכילה MADM השושלת שבטים ניסויים, כולל Creer^T2 מנהל התקן בשימוש, מינון TM, ואת זמן ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Discussion

שיטה להשתמש MADM לעקוב אחר השושלת הסלולרית של RGPs בודדים בvivo בקליפת המוח המתפתחת מתוארת. בשילוב עם TM-inducible Creer^T2, אירועים madm יכול להיות בדיוק מתוזמן, מתן בדיקה חזותית איכותית מאוד כמותית של דפוסי החלוקה של תא גזע ברמת התא בודד. על ידי titrating המינון של TM מועברת, במצב אידיאלי ממוצע של פחות משיבוט אחד לחצי הכדור הקליפת המוח ניתן להשיג, מתן הפרדה מרחבית נאותה להבדיל חד משמעית שיבוטים בודדים. על ידי שמירה על שלמות רקמות, שיטה זו גם לוכדת מידע חיוני לגבי מיקום, מורפולוגיה, ומספרי תאים מוחלטים. קלטות madm על Chr^{. 11,11,12,46,56,57}, על chr. 7⁵¹, ואת madm המקורי ב Rosa26^47,53,59 שימשו במחקרים madm שבטים. ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים מספק תובנה חסרת תקדים לתוך המבנה והקשר שבטיים של תאים ביתי ומאפשרת הדמיה חיה של תאי גזע מתרבים ושיבוטים המתעוררים^46,52.

ניתוח קיסרי וטיפוח הגורים לניתוח של שיבוטים בשעת לידה פוסט לידה הוא צעד הכרחי וקריטי בפרוטוקול. בהתאם למצב הבריאותי של הסכר בהריון TM שטופלו, ייתכן שלא יהיה צורך לבצע ניתוח קיסרי. עם זאת, העלאת גורים עם אמא אומנת עדיין נדרש, כי האם TM מטופלים יכול להיות בעייתי מנקה. הבדלים לא נצפו בצורך לטפח עם נהגים שונים של Creer^T2 . שני קווי MADM ואמהות מאמצות נשמרים על רקע CD-1 החוצה. אם ניתוח קיסרי אינו הכרחי, הסכר TM שטופלו בהריון בשימוש כדי לייצר כלבלבים ניסיוני ניתן לעשות שימוש חוזר עבור ברים ניסיוניים נוספים בהתאם לעקרונות של 3R (לשים לב כי זה יכול להיעשות רק אם רישיונות בעלי חיים לאשר לאשר בפרקטיקה זו). אמהות מאמצות יכולות לשמש לטיפוח הגורים בתוך יומיים לאחר שילדו, אך שיעורי הצלחה גבוהים יותר נצפו כאשר אמהות מאמצות נותנות לידה באותו היום כמו העכברים הניסיוניים שחייבים להיות מאומצים. לכן, חשוב להגדיר מתגים מתוזמנים עבור אמהות מאמצות במקביל למטגים ניסיוניים בשלב 1.1. שמירה על מספר המלטה דומה המלטה של אמא אומנת המקורי יכול לשפר את שיעור ההישרדות של הגורים הטיפחו, ולכן הסרה של חלק כל המלטה המקורי עשוי להיות הכרחי. צעדים נוספים העשויים לשפר את הטיפוח כוללים לשפשף את כפפות הניסויים בפסולת ומזון (כדי להסיר את ניחוח הכפפות); לשפשף בעדינות את הגורים לאחר ניתוח קיסרי עם שברי המלטה המלוכלכת של אמא אומנה, לקנן; והצבת הגורים במגע הקרוב עם גורי האם המאמצת לפני מיקומם בכלוב העכבר המאומץ.

כמו בשיטות אחרות המבוססות על כתב היוחסין, שיקול זהיר יש לנקוט בעת בחירת הנהג האופטימלי של Creer^T2 עבור ניסויים שבטים madm. ראשית, היזם צריך להביע את הrecombinase הן זמנית באופן זמני באוכלוסייה הקדמון של העניין. מציאת מיזם זה יכול להיות מאתגר, משום שיזמים מסוימים עשויים לשנות דפוסי ביטוי או להיות מושתקים בשלבים שונים של התפתחות. כדי לשפר את סוג התא הספציפי recombinases ספציפיים לאתר, כל אחד מהם מונע על ידי היזמים נפרדים, נעשה שימוש. כאשר אחד או שניהם recombinases מבוטאים באותו תא, זה מתייג את התא ואת צאצאה עם כתבת פלורסנט^74,75,76,77. לסיכום, חשוב לבחור את מנהל ההתקן של Creer^T2 הספציפי לאוכלוסיה של ושלתי מנותח.

השלב הקריטי ביותר בשיטה זו הוא זיהוי של שיבוט, מכיוון שעל כל התאים להיות נגזרים באופן חד משמעי מאירוע שילוב מחדש יחיד (שלב 8.1). טיטור של ריכוז TM מבטיח פחות מאשכול אחד של תאים אדומים/ירוקים לחצי הכדור המוח ומגדיל את ההסתברות לנתח שיבוט יחיד (שלב 2.2)^7,11. יש להיפטר ממשובטים אם אשכולות שכנים של תאים מתרחשים בתוך 500 יקרומטר של שיבוט של ריבית. לכן, חשוב לבחון מספר סעיפים לפני ואחרי הופעתו של שיבוט כדי להבטיח כי אין אירועים נוספים שילוב מחדש בקרבת מקום. בשל האות החלשה של fluorophores, יש צורך לבצע אימונוהיסטוכימיה עבור eGFP ו tdT ב שיבוטים עובריים (ראה סעיף 6). זה מומלץ רק בשיבוטים למבוגרים אם אנטיגנים נוספים יהיו מיופילים. כאשר הדמיה שיבוטים, חשוב ללכוד את הרוחב כולו של קליפת המוח שבו השיבוט ממוקם (כלומר, ממשטח pial כדי callosum קורפוס; ראה שלב 8.4) כדי לא להחמיץ תאים. פעולה זו מקלה גם על יישור תמונה במהלך עיבוד תמונה (סעיף 9). סעיף 8 של הפרוטוקול דורש מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, אבל ניתן להתאים בהתאם לכיוונון המיקרוסקופ זמין. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, אך מיקרוסקופיה קונפוקלית מומלצת משום שזה מוביל לירידה בזיהום האור מחוץ למישור המיקוד. חשוב גם שעוצמת הלייזר והרווח מותאמים כך שניתן יהיה לזהות את התאים הירוקים, האדומים והצהובים. ללא קשר לכיוונון, מומלץ להשתמש במטרה של 20x לפחות כדי להבטיח הפרדה מרחבית מלאה של תאים ממוקמים היטב. בנוסף להקלטה של עומק קליפת המוח של כל התאים (שלב 8.6), אזורים קורטיקליים שבהם המשובטים ממוקמים חייב להיות מזוהה באמצעות אטלס המוח כגון אטלס המוח אלן או מפות קואורדינטות סטריאוטקאית אחרת. הפרדיגמה למתן שמות לקבצים צריכה להיות גם מאומצת כדי לוודא שתמונות שיבוט ניתנות לזיהוי בקלות. ניתן לכלול את המידע הבא בשמות הקבצים: מזהה תמונה ייחודי, תמונת תאריך צולמה, גנוטיפ של בעל חיים, גיל אינדוקציה, גיל ניתוח, מספר תמונה ביחס לשאר התמונות מאותו שיבוט.

הקדמה של מוטציה בתוך הקלטת madm אחד באופן מאפשר את הדור של פסיפסים גנטיים⁷¹ ומאפשר את הניתוח של הרגולטורים המולקולריים של השושלת ואת סוג התאים השונות ברמה שבטיים^7,11,46,62. כדי ליצור פסיפס גנטי עם MADM, את הקלטות MADM חייב להיות מקושר באופן דומה לכרומוזום זהה כמו גן העניין (ראה איור 2 לצורך רבייה). זה מגביל את ניתוח המשובטים הנוכחי עם MADM לגנים הממוקמים Chr. 7⁵¹, chr. 11⁴⁶, chr. 12⁵¹, ו Chr. 6 הRosa26 לוקוס⁴⁷. מחקרים עתידיים ישתמשו בקלטות MADM ממוקדות כל כרומוזום, המתיר ניתוח פסיפס של כמעט כל הגנים של הגנום העכבר ברמת המשובטים.

לבסוף, MADM אינו מוגבל לניתוח של תאים מחולל קדמון בקליפת המוח המתפתחת. המחקר של נישות רבות של תאי גזע יכול להפיק תועלת מהיכולת לפתור הסדרים זמן של תאים קשורים. על-ידי החלת madm לאזורים אחרים של המוח, תנאי מחלה (למשל, סרטן), או ברקמות אחרות^{47,50,51,52,53,54,55,56,57,58, 59,, מחקרים}חשפו שושלת היוחסין קשרים במשובטים נגזר מכיתות מגוונות של מחולל שבטים ותאי גזע (ראה שולחן 1 לרשימה עוד יישום מעניין בעתיד של MADM היא לשלב אותו עם כתבים פונקציונליים או subcellular נוספים, אשר יגדיל את מידת המידע שניתן לרכוש מן המשובטים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מזרק טוברקולין 1 מ"ל (Omnifix Luer Lock)	בראון	9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO)	Roth	0718.2
מזרק 10 מ"ל (Omnifix Luer Lock)	בראון	8508429N
15 מ"ל צנטריפוגה חרוטית	Sarstedt	65.554.502
24 כלים מרובי בארות	Roth/Greiner Bio-one	CE56.1
27- מד x 3/4 מחט (Sterican)	Braun	16010256E
שמן תירס	Sigma	C8267-500ML
כיסויים (24 x 60 מ"מ #1)	Thermo Fisher Scientific (Menzel)	15747592
Cryostat Cryostar NX70	Thermo Fisher Scientific	957000H
עט Dako (סמן שעווה)	Agilent	S200230-2
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)	Invitrogen	D1306
להב מיקרוטום חד פעמי (MX35 Ultra)	Thermo Fisher Scientific	705830
מלקחיים עדינים (Dumont #5)	כלי מדע עדינים (FST)	11254-20
צלחת זכוכית נגד גלגול	היסטוקום	M 449980
גליצרול	סיגמא	G5516
LSM 800 Confocal	Zeiss
מדיום			25 מ"ג/מ"ל DAPCO, 6 גרם גליצרול, 2.4 גרם Mowiol 4-88, 6 מ"ל dH2O, 12 מ"ל 0.2 מ' Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88	Roth	0713.2
סרום חמור רגיל	מחקר חדשני	IGDNSER100ML
Paraformaldehyde	Sigma	441244-1KG
משאבה פריסטלטית 323E/D 400 סל"ד	ווטסון-מרלו	036.3124.00A
סוכרוז	סיגמא	S8501-5KG
Superfrost בתוספת שקופיות זכוכית	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNT
Tamoxifen	Sigma	T5648
תבנית הטמעת רקמות T-12 (22 מ"מ מרובע)	Polysciences Inc.	18986-1
Tissue-Tek O.C.T	Sakura	4583
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Trizma hydrochloride	Sigma	93363
Tween-20	Sigma	P9416-100ML
תוכנה ותוספים:
Fiji	1.52p	Fiji
MultiStackReg	1.45	קישור להורדה
aTurboReg		EPFL Bioimaging
Zen Blue	2.6	Zeiss
מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/זנים:
Mouse: Emx1-CreER	מעבדת ג'קסון	JAX:027784
עכבר: MADM-11-GT	מעבדת ג'קסון	JAX:013749
עכבר: MADM-11-TG	מעבדת ג'קסון	JAX:013751
<חזק>נוגדנים ראשוניים:
עוף נגד GFP 1:500	Aves Labs	GFP-1020
עז נגד tdTomato 1:500	נוגדנים	לסיגןAB8181-200
ארנב נגד RFP 1:500	MBL	PM005
<חזק>נוגדנים משניים:
חמור נגד עוף Alexa Fluor 488 1:500	Jackson Immuno Research	715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500	Jackson Immuno Research	705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500	מחקר חיסוני ג'קסון	711-165-152