הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61163

⸱

11 במאי 2020

 ,  ,  , 
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

תקציר

עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

מבוא

עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכתהנשימה 3,4,5. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעותכרוניות רבות 6,7,8. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD9. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותהגבוהה יותר 10,11. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי12. החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי עלהחברה 13.

דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימההתחתיות 14,15. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום16. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים17. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתלריאות 18. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאיאפיתל ריאות 19,20. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתלריאות באמצעות 21,22. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.

דו"ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה23. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת CSE 100%

  1. צייר 10 מ"ל של מדיה של תרבות תאים ללא סרום (DMEM/F12 עבור תאי BEAS-2B; אוויר אפיתל תא בסיס בינוני עבור תאי HSAEC) לתוך מזרק 60 מ"ל.
  2. חבר הפוך קצה פיפטה 1 מ"ל גזוז כראוי לתרסיס המזרק כמתאם להחזיק את הסיגריה (3R4F).
  3. הסר את המסנן של הסיגריה. חבר סיגריה לפטיפטי מתאם ובעצר את הסיגריה.
  4. משוך 40 מ"ל של אוויר המכיל עשן לתוך 10 מ"ל של מדיה ללא סרום. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי רעד נמרצות (30 שניות לכל תיקו).
  5. חזור על שלב 1.4 על 11x ב ~ 7 דקות עד הסיגריה נשרף לחלוטין.
  6. לסנן את 10 מ"ל של מדיה מעושנת עם מסנן 0.22 μm כדי לא לכלול כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מסיסים. העברה לצינור סטרילי סגור. הכן את 100% CSE לא יותר מ- 30 דקות לפני ההסכם הבא.

2. תרבות פסאודומונס

  1. לחסן קפוא P. aeruginosa (זן PAO1) או P. פלואורסצן מיגולה (זן PAO143) לתוך מרק סטיטי (TSB) צלחת אגר לתרבות לילה ב 37 °C.
    הערה: כדי להשיג מספיק חיידקים לקולטה, להפיץ חיידקים רבים ככל האפשר על צלחת אגר TSB ככל האפשר.
  2. לאסוף מריחה חיידקית דגירה ב 20 מ"ל של TSB עם 5% של גליצטרול כמקור הפחמן.
  3. לנער את המתלים חיידקים ב אינקובטור 37 °C ב 200 סל"ד עבור 1 שעה עד OD600 ערך = 0.6.
    התראה: אין לתת למהירות הרעידות לעלות על 200 סל"ד. מהירויות רועדות גבוהות יותר עלולות לפגוע מורפולוגיה של פלאגלה חיידקים ולהשפיע על הפלישה חיידקים לתוך אפיטליה ריאות. כמו כן, להגביל את זמן הרעידות 1 שעות כדי להשיג חיידקים פולשניים מאוד. למדוד את ערך OD600 כדי להעריך את מספר החיידקים. OD600 = 1 מתאים ~ 109 מושבה יצירת יחידות (CFU)/mL.

3. תרבות תאי אפיתל ריאות אנושיים וטיפול CSE

  1. תרבות תאי BEAS-2B אנושיים במדיום HITES (500 מ"ל של DMEM/F12, 2.5 אינסולין מ"ג, 2.5 מ"ג transferrin, 2.5 מ"ג נתרן סלניט, 2.5 מ"ג transferrin, 10 μM הידרוקורטיזון, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES, ו 2 mM L-גלוטמין) בתוספת עם 10% סרום מבקרים עובריים (FBS) כפי שתוארקודם לכן 24.
  2. תרבות תאי אפיתל דרכי הנשימה העיקריים של דרכי הנשימה (HSAEC) במדיום תרבות תאי האפיתל בדרכי הנשימה (500 מ"ל של תאי אוויר בינוני בסיס, 500 μg/mL HSA, 0.6 μM חומצה לינולאית, 0.6 μg/mL לציטין, 6 mM L-גלוטמין, 0.4% לחלץ P, 1.0 μM אפינפרין, 5 μg /mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL הידרוקורטיזון, rh EGF 5 ng/mL, ו 5 μg/mL rh אינסולין). דגירה התאים ב 37 °C ב 5% CO2.
  3. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות עד התאים להתנתק לחלוטין מתחתית הצלחת.
  4. להוסיף 10 מ"ל של HITES שלם מדיום כדי לנטרל טריפסין ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
    התראה: בזהירות לפקח על הזמן לעיכול נסהפסין על ידי מיקרוסקופיה, כי עיכול יתר עלול לגרום למוות של תאים.
  5. בטל את supernatant וssuspend התאים ב 2 מ"ל של HITES בינוני עם 10% FBS.
  6. Pipette 10 μL של מתלה התא לעיל על הלוח ולהכניס אותו לתוך מונה תא אוטומטי כדי להשיג את הריכוז בתאים / מ"ל.
  7. צלחת BEAS-2B תאים בריכוז של 3 × 105 תאים / מ"ל לתוך 6 צלחות גם בנפח כולל של 2 מ"ל ב HITES בינוני בתוספת עם 10% של FBS לתרבות לילה.
  8. לטפל בתאים בכ 80% confluency, או 5 x 105 תאים / מ"ל, עם 4% CSE עבור 3 שעות. לפני טיפול CSE, לשנות את המדיום עם HITES בינוני עם 1% של FBS.

4. זיהום חיידקי

  1. הוסף P. aeruginosa או P. פלואורסצנים מיגולה (~ 1 ×10 7 CFU / מ"ל) לכל באר של תאים שטופלו CSE דגירה עבור 1 שעה ב 37 ° C ב 5% CO2.
  2. שאף את supernatants ולהחליף עם 2 מ"ל של HITES טרי בינוני לטיפול עם 4% CSE ו 100 μg / מ"ל gentamicin.
    הערה: Gentamicin משמש כי הוא אינו מסוגל לחדור קרום תאי אפיתל ריאות אנושיות. לכן, זה יכול להרוג את כל החיידקים במדיום אבל לא את אלה שפלשו לתאי אפיתל הריאה.
  3. לאחר 1 שעה של CSE / gentamicin טיפול ב 37 °C ב 5% CO2, לשאוף את supernatants ולשטוף את התאים 3x עם PBS לקביעת ריכוז חיידקים הבאים.
    הערה: כדי לאשר את החיידקים הפנימיים, תאים נגועים GFP תווית P. פלואורסצנים מיגולה נצפו תחת מיקרוסקופ פלורסנט.

5. קביעת ריכוז חיידקים בשיטת צלחת הטיפה

  1. כדי לקבוע עומס חיידקים בתאים נגועים בשיטת צלחת טיפה, לשטוף את התאים שטופלו gentamycin 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. הוסף 1 מ"ל של מאגר סיס תא (0.5% triton X-100 ב PBS) לכל באר.
  3. לדלל את התא המכיל את החיידקים הפנימיים בהדרגתי (1:10, 1:100, 1:1,000 ו- 1:10,000) עבור החיסונים הבאים לצלחת אגר TSB.
  4. לאחר 16 שעות של דגירה, להשיג את התוצאות של CFU על ידי ספירת המושבות חיידקים.

6. RT-qPCR זיהוי של חיידקים 16S rRNA

  1. לטפל בתאי אפיתל ריאות נגועיםפסאודומונס (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כמתואר לעיל. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. מוסיפים 0.35 מ"ל של מאגר הליזה של גאנידיום תיוציאניאט לבאר של צלחת באר 6. לאסוף את התאים עם מגרד תא. פיפט lysate לתוך צינור microcentrifuge ולערבב בעדינות עם פיפטה.
  3. מוסיפים את אותו נפח (0.35 מ"ל) של אתנול טרי 70% לתוך lysate ומערבבים היטב. העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור אוסף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב- 10,000 x g עבור 30 s ב 20-25 ° C. לאחר מכן, מחק את המאגר בצינור האוסף.
  4. שטוף את העמודה עם 0.7 מ"ל של מאגר כביסה 1. צנטריפוגה בעמודה ב- 10,000 x g עבור 30 s. יש לשטוף את העמודה 2x עם 0.5 מ"ל של חוצץ כדי לשטוף את RNA מאוגד קרום. חזור על הצנטריפוגה ב- 10,000 x g למשך 2 דקות.
  5. מקם את העמודה בצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל. מוסיפים 30-50 μL מים ללא תסה. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת. לאסוף את הזרימה דרך למדוד את ריכוז RNA.
  6. בצע תגובת שעתוק הפוכה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לערבב 1 μg של RNA הכולל עם 10 מ"ל של מאגר תגובה, 1 μL של תעתיק הפוך, ומים ללא RNase לתגובה 20 μL. לבצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 ° C עבור 1 שעות ולאחר מכן 95 ° C במשך 5 דקות.
  7. לערבב יחד את תבניות cDNA (1 μL של כל תגובה שעתוק הפוך לעיל), 5 μL של תערובת מאסטר המכיל צבע SYBR, μL 1 של כל פריימרים ספציפיים 200 nM, ומים בתערובת 20 μL לניתוח PCR הבא, על פי המלצות היצרן.
    הערה: להלן פריימרים מיקוד 16S rRNA של P. aeruginosa: קדימה 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGAGAGCG-3′; הפוך 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH שימש כפקד טעינה עם פריימרים הבאים: קדימה: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; הפוך: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. השתמש בשיטת CT השוואתית כדי לקבוע את הביטוי.

7. זיהוי פסאודומונס פלורסנט עם ציתום זרימה

  1. לטפל פלואורסצנט פסאודומונס -נגוע תאיאפיתל ריאות (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כפי שתואר קודם לכן. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. נתח את הדגימות עם ציטומטר זרימה באורך גל של 509 ננומטר לזיהוי GFP. סיים כל קריאה ב-100,000 אישומים. נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנה קשורה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיאגרמה משמשת להמחשת הפרוטוקול באות 1. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו CSE ואתגרו עם פסאודומונס. פסאודומונס במדיום התרבות נהרגו על ידי gentamycin הוסיף ואת התאים היו נתונים לצלחת טיפה, RT-qPCR זיהוי של פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריית זרימה. בהשוואה לבקרה, טיפול CSE גדל באופן משמעותי זיהום חיידקי בשיטות צלחת טיפה(איור 2). בהתאמה, CSE מושפע עומס חיידקי ב HSAEC (איור 3). הכדאיות בתא לא השתנה באופן משמעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפל ליישב את התאים אם הם בהצלחה לברוח מנגנוניהגנה סלולרית 25,26. גישות לתצפית על זיהומים חיידקיים במיקרופגים ריאות פותחו זמן רב אבל עם ידע מוגבל של תאי אפיתל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 מענקים HL125435 ו HL142997 (ל CZ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 50 מ"לBD Biosciences
אפיתל בדרכי הנשימה מדיום בסיסיATCCPCS-300-030
שייקר חיידקיםThermoFisher Scientific
ערכת צמיחת תאי אפיתל סימפונותATCCPCS-300-040
מונה תאיםBio-Rad
CFX96 מערכתPCR בזמן אמתBio-Rad
קיבולת גבוהה RNA-to-DNA KITThermoFisher Scientific4387406
HITES בינוניATCC ATCC30-2004
תאי BEAS-2B אנושייםATCCATCC CRL-9609
תאי אפיתל של דרכי הנשימה הקטנות הראשוניות האנושיותATCCATCC PCS-300-030
LSRII זרימה ציטומטרBD Biosciences
מיקרוסקופ קונפוקלי Nikkon
קורא ODארה"ב
PCRITD
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC 47085PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens MigulaATCC ATCC27853P.aeruginosa GFP
סיגריות בדרגת מחקר (3R4F)אוניברסיטת קנטקיTP-7-VA
RNeasy מיני קיטQiagen74106
Transprent PET Transwell הכנסקורנינג קוסטאר
מרק סויה טריפטיBD Biosciences
תא פריימרים מדעיים

מקורות

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784(2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26(2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125(2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

qRT PCRRNA
מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.