עליות הנגרמות על ידי מתח ברמות הגלוקוז עלולות לבלבל את הפרשנות של נתונים שמקורם בבדיקת סבילות לאינסולין תוך-צפקי מודעת בעכברים. במאמר זה אנו מתארים שיטה להתאקלמות העכברים לטיפול, זריקות ודגימת דם לפני ביצוע בדיקת סבילות לאינסולין על מנת להגביל היפרגליקמיה הנגרמת על ידי עקה.
מאמר שיטה
הסתגלות לפני בדיקת סבילות לאינסולין תוך צפקי להפחתת היפרגליקמיה הנגרמת על ידי מתח בעכברים בהכרה
במאמר זה
סיכום
תקציר
בדיקת הסבילות לאינסולין משמשת בדרך כלל במחקרים מטבוליים להערכת רגישות לאינסולין בכל הגוף במכרסמים. זוהי בדיקה פשוטה יחסית הכוללת מדידת רמות הגלוקוז בדם לאורך זמן לאחר הזרקה תוך-צפקית אחת של אינסולין. בהתחשב בכך שהוא מבוצע במצב מודע ודם נאסף לעתים קרובות באמצעות חיתוך זנב, יש לו פוטנציאל לעורר תגובת לחץ מבעלי חיים עקב חרדה הקשורה לטיפול ואיסוף דם. ככזה, עלולה להתרחש עלייה ברמת הגלוקוז בדם כתוצאה ממתח, מה שמקשה על זיהוי ופירוש מדד הקצה העיקרי, כלומר ירידה בתיווך אינסולין בגלוקוז בדם. זה נצפה בזני עכברים רבים, והוא שכיח למדי בעכברים סוכרתיים db/db, שם רמות הגלוקוז יכולות לעלות, במקום לרדת, לאחר מתן אינסולין. כאן אנו מתארים שיטה להתאקלמות עכברים לטיפול, זריקות ודגימת דם לפני ביצוע בדיקת הסבילות לאינסולין. אנו מוצאים כי זה מוריד היפרגליקמיה הנגרמת על ידי מתח ומביא לנתונים המשקפים בצורה מדויקת יותר את הרגישות לאינסולין בכל הגוף.
מבוא
בדיקות מטבוליות במכרסמים מבוצעות באופן שגרתי כדי להעריך פרמטרים שונים המווסתים את הומאוסטזיס הגלוקוז1. תקן הזהב להערכת פעולת האינסולין של כל הגוף in vivo הוא מהדק היפר-אינסולינמי-אוגליקמי2. בדיקה זו כוללת מתן אינסולין להעלאת רמות האינסולין במחזור הדם בזמן שהגלוקוז מוזרק לשמירה על אאוגליקמיה. קצב עירוי הגלוקוז הנדרש לשמירה על אאוגליקמיה מעיד על פעולת האינסולין. למרות שמדובר בכלי רב עוצמה במחקר מטבולי, טכניקת המהדק בעכברים מאתגרת מבחינה טכנית ועתירת עבודה, ולכן אינה מתאימה ככלי סינון ראשוני באפיון פנוטיפ מטבולי. מסיבות אלה, לעתים קרובות נבחרת בדיקת הסבילות התוך-צפקית הפשוטה יותר לאינסולין (ITT).
ה-ITT מבוצע במצב מודע לאחר תקופת צום (בדרך כלל 4-6 שעות). בולוס של אינסולין ניתן תוך צפק, ולאחר מכן מנוטר הגלוקוז בדם לאורך פרק זמן שנמשך בדרך כלל 60 דקות. רמות הגלוקוז בדם צפויות לרדת בשל יכולתו של האינסולין להקל על ספיגת הגלוקוז לרקמות הרגישות לאינסולין; המידה שבה זה קורה מעידה על פעולת אינסולין בכל הגוף. במקרים מסוימים, הוכח כי רמות הגלוקוז עולות באופן פרדוקסלי, במקום לרדת, לאחר מתן אינסולין. תופעה זו מיוחסת ככל הנראה לתגובת לחץ. טיפול, זריקות ודגימת דם יכולים כולם לגרום למתח 3,4,5, וכתוצאה מכך להפעיל את ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA) ומערכת העצבים האוטונומית (ANS)6,7,8. ידוע היטב שגם ה-HPA וגם ה-ANS תורמים לעלייה ברמות הגלוקוז במחזורהדם 9,10,11. נוכחות של היפרגליקמיה הנגרמת על ידי מתח בתחילת ITT היא בעייתית, מכיוון שהיא מפריעה לקצב ולעוצמת הירידה בגלוקוז עם מתן אינסולין12. זה יכול להוביל למסקנות שגויות לגבי נוכחות תנגודת לאינסולין. לפיכך, כדי להפחית את ההשפעה המבלבלת של לחץ על רמות הגלוקוז במהלך ITT, פיתחנו שיטה להתאקלמות עכברים לטיפול, זריקות ודגימת דם לפני ביצוע ה-ITT.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מערכת הבריאות VA Puget Sound.
הערה: הדרישות המקומיות לניטור ו/או התערבות של בעלי חיים הסובלים מהיפוגליקמיה עשויות להיות שונות מאלה המתוארות כאן.
1. צום (t= -210 דקות)
- לאחר סיום מחזור החושך, העבירו עכברים לכלוב חדש עם מצעים לא מזינים כמו תאית או מצעי נייר (לא מצע קלחי תירס, שישפיע על נקודות הקצה המטבוליות אם נצרך על ידי עכברים13). ספק לעכברים גישה אד ליביטום למים לאורך כל תקופת הצום. היו עקביים עם שעת הצום ביום ומשך הזמן בין קבוצות עכברים. עבור הנתונים המוצגים, המזון הוסר בין השעות 07:00 ל-08:00, כלומר 1-2 שעות לאחר סיום מחזור החושך.
- העבר כלובים למיקום שבו יבוצע ה-ITT. זה צריך להיות מרחב שקט שבו גורמי לחץ כמו טמפרטורה, רעש, אור או תנועה ממוזערים.
2. התאקלמות (t= -150 עד -60 דקות)
חשוב: טפל בעכברים בעדינות ככל האפשר. הימנע משימוש בהתקן ריסון במידת האפשר.
- ב-150 דקות, יש למדוד את משקל הגוף. זה ישמש לחישוב נפח האינסולין שיינתן עבור ה-ITT.
- הרם את העכבר בעדינות בזנב והנח על משטח שולחן שטוח תוך אחיזה עדינה בזנב. השתמש במחט 20 גרם (או במספריים כירורגיים) כדי לבצע חתך קטן בקצה הזנב. טיפת דם אמורה להתחיל להיווצר במקום.
- הנח את העכבר על משטח חלק וקשיח ורסן את העכבר בעדינות בזנבו.
- כדי לתעד את רמת הגלוקוז בדם בשלב זה, הנח טיפת דם מקצה הזנב על רצועת הבדיקה של גלוקומטר כף יד. במידת הצורך, עסו בעדינות רבה את הזנב כדי לקבל טיפת דם.
- שאב 100 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים למזרק אינסולין. הרם את העכבר באמצעות קשקוש עדין והזריק תוך צפק. רשום את זמן הזרקת מי המלח.
- אם נחקרים מספר עכברים, הזריק לעכברים מי מלח במרווחים של דקה אחת כדי לאפשר זמן לשלבים הבאים להלן.
- 15 דקות לאחר הזרקת מי מלח, הרם את העכבר בעדינות בזנב. השתמש בגזה כדי לעקור בעדינות כל קריש דם בקצה הזנב.
- אופציונלי: רשום שוב את רמת הסוכר בדם בשלב זה כמתואר בשלב 2.3.
- לאחר 30 דקות לאחר הזרקת מי המלח הרם בעדינות את העכבר בזנב. אם תרצה, קבל מדידת סוכר נוספת בדם כמתואר בשלב 2.3.
- החזר את העכבר לכלוב וחזור על הפעולה עבור עכברים אחרים לפי הצורך. השאירו עכברים ללא הפרעה עד -90 דקות.
- לאחר -90 דקות, חזור על שלבים 2.3 עד 2.6, כולל מדידת רמות הגלוקוז בדם אם תרצה.
- החזר את העכבר לכלוב, חזור על הפעולה עבור עכברים אחרים לפי הצורך. השאירו את העכברים ללא הפרעה עד ל-ITT (שעבורו מדידת הגלוקוז בדם הבסיסית נעשית ב-5 דקות).
3. מבחן סבילות לאינסולין (t= -5 עד +60 דקות)
- הכינו תמיסת עבודה של אינסולין רגיל (זהירות) במי מלח סטריליים, כך שניתן יהיה להזריק את המינון הרצוי במשקל גוף של 4 מיקרוליטר/גרם.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת טיפול באינסולין מכיוון שהזרקה בשוגג עלולה לגרום להיפוגליקמיה. - הכן תמיסת דקסטרוז של 25% (v/v) במי מלח סטריליים שתהיה בהישג יד למקרה שעכברים יפתחו היפוגליקמיה הדורשת התערבות.
- לאחר -5 דקות, הרם את העכבר בעדינות בזנב. קבע את רמת הגלוקוז בדם הבסיסית בשלב זה, על ידי הנחת טיפת דם מקצה הזנב על רצועת הבדיקה של גלוקומטר כף יד. במידת הצורך, עסו בעדינות רבה את הזנב כדי לקבל טיפת דם.
- הכניסו תמיסת אינסולין למזרק אינסולין (4 מיקרוליטר/גרם משקל גוף, לטווח מינון טיפוסי של 0.5-2.0 יחידות לק"ג). הרם את העכבר באמצעות קשקוש עדין והזריק תוך צפק. זמן תיעוד של הזרקת אינסולין.
- אם מספר עכברים נחקרים, הזריק לעכברים אינסולין במרווחים של דקה אחת כדי לאפשר זמן לדגימת דם ורישום נתונים בהמשך.
- 15 דקות לאחר הזרקת האינסולין, הרם את העכבר בעדינות בזנבו. השתמש בגזה כדי לעקור בעדינות כל קריש דם בקצה הזנב. קבע שוב את רמת הגלוקוז בדם בשלב זה כמתואר בשלב 3.3.
- החזירו את העכבר לכלוב ועקבו אחר סימני היפוגליקמיה (למשל, עייפות יתר). אם עכברים מפתחים תסמינים של היפוגליקמיה, יש למדוד את רמת הגלוקוז בדם כמתואר בשלב 5 ולתת דקסטרוז במידת הצורך. עכבר שעובר התערבות דקסטרוז יוסר מפרוטוקול ITT בשלב זה.
- חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 כ-30 דקות לאחר הזרקת האינסולין.
- חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 לאחר 45 דקות לאחר הזרקת האינסולין.
- חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 כ-60 דקות לאחר הזרקת האינסולין.
- החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם, המכיל כמה כדורי מזון על רצפת הכלוב כדי לסייע בהתאוששות מה-ITT. המשך לעקוב במשך 30 דקות ואם העכברים לא חזרו לפעילות/התנהגות רגילה, בצע את ההליך המתואר בשלב 3.6.
הערה: איור 1 מסכם את נוהל ההתאקלמות וה-ITT.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2A ואיור 3A הם נתונים מייצגים (נתונים אישיים וממוצעים, בהתאמה) המראים עלייה פרדוקסלית ברמות הגלוקוז בדם בעכברים סוכרתיים db/db ב-15 הדקות שלאחר מתן אינסולין, בהתאם להיפרגליקמיה הנגרמת על ידי מתח. שימו לב, לא נצפתה עלייה ברמת הגלוקוז בדם אצל קבוצת הביקורת שאינה סוכרתית (db/+ או +/+) שעברו את אותו ההליך. כדי לקבוע אם ההסתגלות להליך ה-ITT הייתה יעילה בהפחתת העלייה הזו בגלוקוז בדם, אותם עכברים עברו את פרוטוקול ההתאקלמות שתואר לעיל. כל שלב משמעותי מסומן על ידי ק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המהדק ההיפר-אינסולינמי-אוגליקמי נחשב לתקן הזהב להערכת פעולת האינסולין in vivo. שינויים במתודולוגיה לביצוע המהדק הביאו לכך שהטכניקה נעשית בעכברים מודעים וחסרי מעצורים2 שעברו צנתור בעבר באמצעות מערכת דו-צנתרית14 כדי לאפשר דגימת דם דרך עורק הצוואר ועירויים דרך וריד הצוואר. זה מגביל את הצורך לטפל או לרסן עכברים במהלך ההליך, ובכך להפחית את תגובות הלחץ2. ידוע היטב שמתח יכול לבלבל מדדי קצה שונים במחקרים מטבוליים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות P30 DK-017047 (המרכז לחקר הסוכרת של אוניברסיטת וושינגטון, Cell Function Analysis Core), והמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארצות הברית, מערכת הבריאות של וירג'יניה פיוג'ט סאונד (סיאטל, וושינגטון). התוכן של כתב יד זה אינו מייצג את העמדות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב או של ממשלת ארצות הברית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הזרקות דקסטרוז-50 | פייזר | 00409-6648-16 | לשימוש אם העכבר חווה היפוגליקמיה. |
| רפידות גזה | פישר סיינטיפיק | 22037907 | לעקור קריש דם בקצה הזנב. |
| גלוקומטר | Accu-Chek | M001_us | למדידת רמת הגלוקוז בדם. |
| סולם | למדידת משקל גוף. | ||
| אינסולין (נובולין R) | נובו נורדיסק | 0169-1833-11 | להזרקה. |
| מזרקי אינסולין | VWR | BD-329461 | לזריקות. |
| טיימר | |||
| סטרילי 20 גרם מחט | VWR | BD-305175 | לחיתוך זנב. |
| מגן הצלה | סטרילי עם מי מלח | 1261699 | להזרקות. |
| מספריים כירורגיים | כלי מדע עדינים | 14088-10 | לחיתוך זנב. |
| רצועות בדיקה | Accu-Chek | 06908217001_us | למדידת רמת הגלוקוז בדם. |
מקורות
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Tabata, H., Kitamura, T., Nagamatsu, N. Comparison of effects of restraint, cage transportation, anaesthesia and repeated bleeding on plasma glucose levels between mice and rats. Lab Animal. 32 (2), 143-148 (1998).
- Olfe, J., Domanska, G., Schuett, C., Kiank, C. Different stress-related phenotypes of BALB/c mice from in-house or vendor: alterations of the sympathetic and HPA axis responsiveness. BMC Physiology. 10, 2(2010).
- Ghalami, J., Zardooz, H., Rostamkhani, F., Farrokhi, B., Hedayati, M. Glucose-stimulated insulin secretion: Effects of high-fat diet and acute stress. Journal of Endocrinological Investigation. 36 (10), 835-842 (2013).
- Thorens, B. Brain glucose sensing and neural regulation of insulin and glucagon secretion. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13, Suppl 1 82-88 (2011).
- Pekow, C. Defining, measuring, and interpreting stress in laboratory animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 41-45 (2005).
- Chan, O., Inouye, K., Riddell, M. C., Vranic, M., Matthews, S. G. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis. Minerva Endocrinol. 28 (2), 87-102 (2003).
- Rosmond, R. Role of stress in the pathogenesis of the metabolic syndrome. Psychoneuroendocrinology. 30 (1), 1-10 (2005).
- Nonogaki, K. New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia. 43 (5), 533-549 (2000).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Zahorsky-Reeves, J., LW, C. Housing mice on corncob bedding versus hardwood chip may confound research models. American Association for Laboratory Animal Science. , AALAS Scientific Session (10 October) (2010).
- Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. Journal of Biological Chemistry. 272 (36), 22570-22575 (1997).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Barrett, A. M., Stockham, M. A. The effect of housing conditions and simple experimental procedures upon the corticosterone level in the plasma of rats. Journal of Endocrinology. 26, 97-105 (1963).
- Heinrichs, S. C. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 34 (5), 808-815 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהתגיות
