לימוד מכונה ללימוד למחצה של דנ א של מסחטות בפקאוסולפטיס

Summary

במהלך מוות תאי הוא proinflammatory ותורם לדלקת. מדידת ecDNA באתר פציעה יכולה לקבוע את היעילות של הטיפול הטיפולי באיבר היעד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכלי למידה של מחשב כדי להפוך את המדידה של ecDNA ברקמת הכליות.

Abstract

מוות של תאים פקוניים הוא תכונה פתולוגית של myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic נוגדן הקשורים דלקת כלי דם (MPO-AAV). חומצת מסחטות (ecDNA) שוחררה במהלך צורות שונות של מוות תאים, כולל אפופטוזיס, נמק, נקרופסיס, מלכודות נויטרופילים ופירופסיס. מדידה של מוות זה תא הוא זמן רב עם מספר סמנים שונים הנדרשים כדי לזהות את הצורות הביוכימי השונים של מוות תאים. מדידה של ecDNA מתנהל בדרך כלל סרום ושתן כמו פונדקאית עבור נזק לכליות, לא באיבר היעד בפועל שבו הפציעה הפתולוגית מתרחשת. הקושי הנוכחי בחקירת ecdna בכליה הוא חוסר שיטות עבור הרקמה הקבועה של פורמלין מוטבע רקמת פרפין (ffpe) הן בניסויים והן בארכיון ביופסיה של כליות האדם. פרוטוקול זה מספק סיכום של השלבים הדרושים לכתם עבור ecDNA ברקמת FFPE (הן של האדם וגם murine), כיבוי באופן אוטומטי ולמדוד את ecDNA בתמונות וכתוצאה מכך באמצעות כלי למידה מכונה מתוך הזמין בפומבי הקוד הפתוח הפנויה ImageJ תוסף trainable Weka פילוח. פילוח Trainable Weka מוחל על ecDNA בתוך הפקאולי היכן התוכנית לומדת לסווג ecDNA. מסווג זה מוחל על תמונות כליות שנרכשו לאחר מכן, ומפחית את הצורך ביאורים ידניים של כל תמונה בודדת. הסתגלות של פילוח Weka trainable מוצג עוד יותר ברקמת הכליות מפני הניסוי הנסיוני האנטי-MPO של מורלין (GN), כדי לזהות רשתות וecMPO, תורמים פתולוגיים שכיחים לאנטי MPO GN. שיטה זו מספקת ניתוח אובייקטיבי של ecDNA ברקמת כליות המדגימה בבירור את היעילות שבה trainable Weka התוכנית פילוח יכול להבחין ecDNA בין רקמת כליה נורמלית בריאה ורקמות הכליה החולה. ניתן להתאים בקלות פרוטוקול זה לזיהוי ecDNA, רשתות וecMPO באיברים אחרים.

Introduction

הנוגדן Myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic הקשורים דלקת כלי דם (MPO-aav) היא מחלה אוטואימונית כי תוצאות אי ספיקת כליות מפציעה פתולוגית משמעותית עם מוות תאים משמעותי ושחרור של חומצה deoxyribonucleic (DNA)^1,2. הדנ א יכול להפעיל את המערכת. החיסונית בכך שהוא מתפקד כאות סכנה בתנאים בריאים נורמליים, המיקום הגרעיני של דנ א מציע הגנה מפני חשיפה למערכת החיסונית. Self-DNA כי הוא שוחרר extracellularly במהלך תהליכים פתוגניים או חסינות אוטומטית נתפסת על ידי המערכת החיסונית כמו נזק proinflammatory הקשורים מולקולרית חלבון מולקולרי (לח)³. נוסף DNA הסלולר (ecdna) הוא שוחרר מן התאים המתים באמצעו....

Protocol

שיטה זו מאפשרת זיהוי של פאן ecDNA מכל צורות של מוות תאים. אותה שיטה ונוגדנים משמשים לרקמת ביופסיה של האדם (משלב 4). כל החיות והנושאים האנושיים היה אישור האתיקה מאוניברסיטת מונש, ומונש בריאות, קלייטון, ויקטוריה, אוסטרליה.

1. צביעת עבור ecDNA עם DAPI ו β-Actin

1. לגרום 20 יום מודל של אנטי myeloperoxidase פקניתיים (anti-MPO-GN) ב 8-10 שבוע הישן C57/Bl6 עכברים, עם פקדים⁹.
   1. להרוג את העכברים האנושי באמצעות חדר CO₂ .
   2. הסרת הכליות על ידי ביצוע החתך הקדמי באמצע העור עם מספריים, ולאחר מכן בזהירות לחתוך את צפק ואת הסיכה חזרה על לוח לנתיחה. באמצעות מלקחיים לדחוף בצד את fascia הכליה הקדמית צפק ה....

Results

תמונות אלה מייצגות את השלבים המרובים הדרושים כדי להשתמש בהצלחה פילוח Weka trainable כדי למזער את המדידה הידנית של העבודה אינטנסיבית של ecDNA ברקמת כליות FFPE ויטראז ' מתוך עכבר עם המושרה anti-MPO GN. שלבים אלה מסוכמים באיור 1 ובאיור 2 עם תמונות שצולמו ישירות מתוכנית פילוח של weka, לחלוקה לרמות של כל שלב בתהליך הניתוח. מדידות מניתוח זה מוצג לאחר מכן באיור 3 להפגין את היכולת של התוכנית כדי לקבוע את כמו.......

Discussion

פרוטוקולים מרובים קיימים כי למדוד סמנים proinflammatory בסרום ושתן של שני חולים ומודלים של העכבר של glomerulonephritis. הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של המוצרים של מוות תאים (ecDNA, רשתות ו-ecMPO) בתוך הפקולוס ישירות. הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם הכנת רקמות והדמיה. האלמנט העיקרי הגבלת שימוש בשיטת פלורסנט מכתים לניתוח הוא הרקמה האוטומטית של רקמות. Formalin קבוע רקמת פרפין כפוף לקרינה אוטומטית שיכול לטשטש כתמים פלורסנט ספציפי. השלב האחרון בשיטה הצביעת שבו שקופיות שקועים בסודאן שחור, מחליש את הצבע האוטומטי של הרקמה,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סרום בקר אלבומין	SIGMA	A2153	תמיסות של 5% ו-1% מורכבות ב-PBS, ניתן להכין בכמויות גדולות ולהקפיא - להשליך לאחר ההפשרה.
עוף נגד עיזים IgG (H+L) נוגדן נספג צולב Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	סובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע כל צימוד חופשי בקוקטייל הנוגדנים שלך
עוף נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן נספג צולב, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	סובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע כל צימוד חופשי בקוקטייל
הנוגדנים שלךעוף נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן נספג צולב Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	סובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע כל צימוד חופשי בקוקטייל הנוגדנים שלך
סרום עוף	SIGMA	C5405	מורכב ב-1% BSA/PBS
Coverslips 24 x60 מ"מ	Azerscientific	ES0107222	#1.5 זה לא עובי סטנדרטי - מיועד לשימוש במיקרוסקופיה
קונפוקליתEDTA 10mM	SIGMA	E6758	הוסף TRIS ו-EDTA יחד במים מזוקקים ו-pH ל-9, לאחזור אנטיגן, ניתן להרכיב בתמיסה פי 10
אתנול 30%, 70% ו-100%	אספקת כימיה	UN1170	מסופק כ-100% אתנול לא מפורק- מדלל ל-30% ו-70% באמצעות פורמלדהיד מים מזוקקים
, 4% (10% פורמלין ניטרלי חוצץ)	TRAJAN	NBF-500	הכליה מוכנסת לתוך שפופרת של 5 מ"ל המכילה 3 מ"ל פורמלין למשך 16 שעות ב-RT, יש להשתמש בפורמלין במכסה אדים
שקופיות היסטולוגיה מזכוכית- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0 מ"מ	TRAJAN	J3800AM4	שימוש בשקופיות מצופות טעונות חיובית הוא חיוני. אנו לא ממליצים להשתמש בפולי-L-ליזין לציפוי שקופיות כאשר רקמות מתנתקות משקופיות במהלך שלב אחזור האנטיגן
עז אנטי אדם/עכבר נוגדן MPO	R& D	AF3667	Aliquot והקפאה במינוס 80 מעלות עם ההגעה
היסטוזול	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	משומש מסודר, במיכלי מתלה צביעה של 200 מ"ל, השתמש במכסה אדים
עט הידרופובי	VECTOR Labs	H-400	השתמש כדי לצייר עיגול סביב רקמת הכליה
עכבר אנטי אדם/עכבר פפטידיל ארגינאז 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquot והקפאה במינוס 80 מעלות עם ההגעה
ראש לייזר סריקה קונפוקלי של Nikon C1 מחובר למיקרוסקופ הפוך, מיקרוסקופ	קוהרנטי, קוהרנטי		מדעי והקפאה במינוס 80 מעלות עם ההגעה
פוספט חוצץ	מי מלח SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl איפור 5 ליטר בכל פעם
סיר לחץ 6L Tefal מאובטח 5 ניאו נירוסטה	Tefal	GSA-P2530738	נרכש בחנות כלי הבית המקומית
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	למרוח טיפות ישירות על כיסוי
ארנב אנטי אדם/עכבר בטא אקטין נוגדן	ABCAM	ab8227	Aliquot ולהקפיא במינוס 80 מעלות עם ההגעה ארנב
אנטי אדם/עכבר נוגדן H3Cit	ABCAM	ab5103	Aliquot ולהקפיא במינוס 80 מעלות עם ההגעה
מתלה מכתים 24 שקופיות	ProScitech	H4465	מתלה הצביעה שנבחר צריך להיות מסוגל לעמוד ברתיחה בלחץ ודגירה בתנור 60 מעלות
סודאן שחור B	SIGMA	199664	0.3% הוסף 3 גרם לבקבוק 1 ליטר באתנול 70%, סנן והגן מפני האור היציב למשך 6 חודשים בטמפרטורת החדר
Tris 10mM	SIGMA	T4661	הוסף TRIS ו-EDTA יחד במים מזוקקים ו-pH ל-9, לאחזור אנטיגן, ניתן להרכיב בתמיסה פי 10
קסילן	טריאן	XL005/20	יש להשתמש בשימוש במכסה אדים