אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) מכילים לעתים קרובות חומרים מיקרוביאלית המפעילים תגובות החיסונית מולדים לווסת דלקת אלרגית. הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש את הזיהוי של מינים dsRNA ב אלרגנים HDM ואפיון של הפעילות החיסונית שלהם בדלקת ריאות אאוזינופילית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי ואפיון של מינים החיסוני של RNA ב-HDM אלרגנים לווסת דלקת ריאות אאוזינופילית
במאמר זה
סיכום
תקציר
אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) הם לעתים קרובות בצורות מורכבות המכילות גם חלבונים אלרגיים כי כונן מסוג שני תגובות וחומרים מיקרוביאלית לגרום לתגובות החיסונית מולדים. הרכיבים הקשורים לאלרגן בתחום החיידקים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות ההתפתחות של מצבים דלקתיים מסוג 2 כגון אסתמה אלרגית. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים נשארים בלתי מוגדרים ברובו. הפרוטוקול המוצג כאן קובע את המאפיינים המבבניים ובפעילות vivo של האלרגן הקשורים חיסוני מגירוי RNA. במיוחד, אלרגנים נפוצות נבדקים לנוכחות של כפול תקוע RNA (dsRNA) מינים שיכולים לעורר תגובות IFN בריאות ולרסן את ההתפתחות של הריאה הקשה אאוזינווליה במודל העכבר של אסטמה מושרה HDM. הנה, כללנו את שלושת: המילים הבאות שאומרות נקודה חשופה להראות את מבנים dsRNA בסך הכל RNA מבודדים אלרגנים כולל מינים HDM, RT-qPCR כדי למדוד את הפעילויות של ה-RNA HDM ב אינטרפרון מגרה גנים (ISGs) הביטוי בריאות העכבר ניתוח FACS כדי לקבוע את ההשפעות של ה-RNA HDM על מספר אאוזינופילים באל, בהתאמה
מבוא
מבוסס על השערת היגיינה המוצע במקור על ידי strachan1, החשיפה המוקדמת לגיל הסביבה גורמים מיקרוביאלית כגון אנדוטוקסין יכול להגן מפני פיתוח של הפרעות אלרגיות2,3. במהלך זיהומים מיקרוביאלית, למשל, זיהומים ויראליים, זיהוי החיסונית מולדת של חומצות גרעין זרות (RNA/DNA) מפעיל תגובות הביטחון מארח4,5,6. עם זאת, הקיום והשכיחות של חומצות גרעין החיסונית כגון כפול מסוג RNA (dsRNA) מינים של קרדית אבק הבית (HDM) או אלרגנים אחרים חרקים נשארים לא ידועים. פרוטוקול זה נועד לקבוע אם HDM או חרקים ואלרגנים שאינם חרקים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הליכים ניסיוניים שתוארו כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של אוניברסיטת טקסס בריאות סן אנטוניו.
1. כתם נקודה כדי להראות נוכחות של מבנים dsRNA ב-RNA הכולל של HDM
- סה כ בידוד RNA מאלרגנים, חרקים ואלרגנים שאינם חרקים
- לשים HDM, חרקים, או בעלי חיים שאינם חרקים שנאספו בחיים או השיגו מסחרית לתוך 50 mL צינורות, ובמהירות להקפיא עם נוזל N2. ואז לאחסן ב-70 ° c עבור בידוד הכולל RNA בהמשך.
הערה: בניסוי זה, HDM, חרקים, ובעלי חיים שאינם חרקים נבחרו משום שהם ידועים כמקורות נפוצים של אלרגנים. יתר על כן, תפקוד חיסוני של RNAs שלהם נשאר ברור. - העברת כמות ראויה (שווה ערך ל-100 μL בנפח או פחות) של HDM....
- לשים HDM, חרקים, או בעלי חיים שאינם חרקים שנאספו בחיים או השיגו מסחרית לתוך 50 mL צינורות, ובמהירות להקפיא עם נוזל N2. ואז לאחסן ב-70 ° c עבור בידוד הכולל RNA בהמשך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הנוכחות של מבנים dsRNA ארוך ב HDM, חרקים ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים נבדק על ידי אבן חשופה באמצעות העכבר הספציפי dsRNA נוגדן J2 (≥ 40bp). RNase III שימש כדי לעכל dsRNA לתוך 12-15 שברי הלחץ bp, אשר היו בלתי ניתן לגילוי על ידי J2 (איור 1).
היכולת של ה-RNA הכולל של HDM כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת בריאות העכבר באופן תלוי במינון היה מנותח על ידי RT-qPCR (איור 2, העליון). הטיפול RNase III ביטל את הפעילות החיסונית של ה-RNA הכולל של HDM, ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להעריך את תכונות הגירוי החיסוני של מיקרוביאלית הקשורים אלרגן-RNA וההשפעות שלהם על התפתחות דלקת ריאות אאוזינופילית במודל העכבר של אסתמה אלרגית. למרות dsRNAs ארוך ידועים כintermediates השכפול של וירוסים רבים שיכולים להפעיל בסיפוק אינטרפרון תגובות בתאי היונקים, הנוכחות שלהם באלרגנים HDM לא ידוע עד העבודה האחרונה שלנו15. השילוב של כתם RNA נקודה, RT-qPCR וניתוח FACS הציג כתב יד זה עשוי לספק דוגמה טובה כדי לנתח רכיבים מולדים כגון מינים dsRNA באלרגנים סביבתיים כי הם מעורבים באו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. אין לנו מה לגלות
תודות
אנו מודים לגב קרלה גורנה לקבלת סיוע טכני בזרימה ציטואסינסה. L.S. נתמכת על ידי מועצת המלגות סין והקרן לחדשנות מחוזי הונאן לתארים מתקדמים (CX201713068). H.H.A. נתמכת על ידי המחלקה למדעי המעבדה הקלינית, המכללה למדעי הרפואה היישומית, אוניברסיטת ג'ול, סאקקה, ערב הסעודית. X.D.L. נתמך על ידי בריאות UT סן אנטוניו בית הספר לרפואה הפעלה של הקרן מקס ו מינין Voelcker.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.40 ומיקרו; m מסננת תאי פלקון | תרמו פישר סיינטיפיק | 08-771-1 | |
| מזרקים 1 מ"ל | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| צינור 15 מ"ל | TH. גייר | 7696702 | |
| צינור 50 מ"ל | TH. גייר | 7696705 | |
| 70% אתנול | Decon Labs | 2701 | |
| ספירה מוחלטת חרוזים | Life Technologies Europe BV | C36950 | |
| ACK-RBC מאגר ליסינג | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ ממברנה | GE Healthcare | RPN203B | |
| נמלה | סן אנטוניו | ||
| (ראה טבלה 5 למתכון) | |||
| 200 דילול | |||
| נגד עכבר CD11c PE-Cy7 (שיבוט N418) | BioLegend | 117317 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר CD19 קמח Alexa 647 (שיבוט 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר CD3e APC (שיבוט 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר CD45 APC-Cy7 (שיבוט: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר ניתן לתיקון צבע eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר IgG (H+L), AP מצומד | Promega | S3721 | |
| נגד עכבר Ly-6G FITC (שיבוט RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 עד 200 דילול |
| נגד עכבר MHC II APC-eFluor 780 (שיבוט M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 עד 200 דילול |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (שיבוט E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 עד 200 דילול |
| BCIP/NBT מצע Thermo | Fisher Scientific | PI34042 | |
| חסימת מאגר | (ראה טבלה 5 למתכון) | ||
| Cannual, 20G X 1.5 אינץ' | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| צנטריפוגה | תרמו פישר 75004030 | ||
| CFX384 מגע בזמן אמת PCR מערכת זיהוי | Bio-Rad מעבדות Bio-Rad | 1855485 | |
| כלורופורם | תרמו פישר מדעי | C298-500 | |
| ג'וק | גריר מעבדות | B26 | |
| ספירת חרוזים | תרמו פישר מדעי | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| צלחות תרבית תאים של דנוויל עם מכסה, צלחת תרבית תאים 96 באר | תומס סיינטיפיק | 1156F03 | |
| אמבטיה יבשה דיגיטלית - ארבעה בלוקים | Universal Medical, Inc. | ||
| תולעת אדמה | סן אנטוניו | שנאספה | |
| (EDTA) | מאגר | ||
| FACS | (ראה מתכון בטבלה 5) | ||
| Biosciences | |||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| מלקחיים | Roboz מכשיר כירורגי | RS-5135 | |
| המוציטומטר | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb אנטי עכבר CD16/CD32 (שיבוט: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA ערכת סינתזה | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 נוגדן חד שבטי נגד dsRNA | SCICONS | 10010200 | |
| תמיסת | (ראה מתכון בטבלה 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 מ"ל שפופרת | MP ביומדיקל | מק"ט:116913100 | |
| עכברים (נקבה, 8-12 שבועות, C57BL/6J) | מעבדת ג'קסון | #000664 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | סיגמא-אולדריץ' | 30120.094 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | CK30 | |
| מיני-חרוזים | הומוגנייזרים | מקט צג:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific ספקטופופוטומטר Medex אספקת | מחט TSCND2000C | |
| , 21 גרם x 1 1/2 | ב-BD Biosciences | 305167 | |
| חלב ללא שומן | מעבדות Bio-Rad | 1706404 | |
| מחרוזת ניילון | Dynarex | 3243 | |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| מספריים | Roboz מכשיר כירורגי | RS-6802 | |
| שייקר או מערבל מעבדה קטן | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 עד 10 דילול |
| עכביש | סן אנטוניו | הערה: TBS | |
| (ראה מתכון בטבלה 5) | |||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | הערה: נאסף |
מקורות
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
