הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61259

⸱

1 באוגוסט 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

במאמר זה

סיכום

המסך הגנטי הקדמי מבוסס על Ca2 + העלאת כקריאה החוצה מוביל זיהוי של רכיבים גנטיים מעורבים התלויים סידן מסלולים איתות בצמחים.

תקציר

מסכים גנטיים הקדמי היו כלים חשובים בזיהוי משוחדת של רכיבים גנטיים המעורבים מסלולים ביולוגיים מספר. הבסיס של המסך הוא ליצור אוכלוסיית מוטציה שניתן להקרין באמצעות פנוטיפ של עניין. EMS (אתיל מתאן סולולאט) הוא סוכן al, המשמש בדרך כלל לגרימת מוטציה אקראית במסך הקלאסי קדימה גנטי כדי לזהות גנים מרובים המעורבים בכל תהליך נתון. סידן ציטוסולג (Ca2 +) העלאת הוא מפתח מוקדם איתות במסלול המופעל על תפיסת המתח. עם זאת, הזהות של קולטני, ערוצים, משאבות ומובילים של Ca2 + הוא עדיין חמקמק במערכות לימוד רבות. Aequorin הוא חלבון כתבת הסידן התאי מבודד מ aequorin ויקטוריה ובאופן מאוד מבוטא באריידאופזיס. אנו מנצלים את המצב הגנטי הקדמי. בו אנו מוטגנים את הטרנסאוגניים הזרעים של צמחי מוטציה נאספו (M1) והקרנה עבור הפנוטיפ של עניין נעשה בפנקסי (m2) אוכלוסיה. באמצעות פרוטוקול Ca2 + מדידה של 96-היטב, מוטציות הרומן מספר ניתן לזהות כי יש תגובת סידן משתנה והם נמדדים בזמן אמת. המוטציות עם הפנוטיפ של עניין חולצו והופץ עד homozygous מוטציה האוכלוסייה הצמח מתקבל. פרוטוקול זה מספק שיטה עבור מסכים גנטיים מתקדמים ברקע של Ca2 + עיתונאי ולזהות הרומן ca2 + מוסדר מטרות.

מבוא

שינוי בסידן ציטוסולג (Ca2 +) הריכוז על תפיסת של גירוי ביוטי או אביוטיים הוא אירוע מוקדם ללמוד איתות המפעיל הרבה1מסלולים איתות 1,2,3,4. תא במצב מנוחה בסיס שלו שומר על הנמוך ca2 + ריכוז ב ציטוזול ו-העודפים ca2 + ב אורגאואותאים שונים מוליך המוביל האחרון של ca תלולה2 + הדרגתי5,6. עם תפיסת האות, Ca2 + רמות עלייה ציטוסול בשל זרם של ca2 + מתוך החילוץ ו/או מקורות תאיים וליצור גירוי מסוים סידן חתימה7,8,9. Ca2 + הגבהים ב ציטוסול מופעלים על ידי גירויים רבים, אבל הייחוד מתוחזק על ידי חנויות נפרדות שחרור Ca2 +, Ca ייחודי2 + חתימה המתאים חלבונים חיישן10,11.

השימוש בסוכן אלקיטינג, אתיל-מתאן סולולאט (EMS) עבור מוטאוסיס הוא כלי רב עוצמה במסכים הגנטיים הקלאסיים הקדמיים כדי לזהות גנים עצמאיים מרובים המעורבים בתהליך. EMS הוא מוטגנים כימיים בעיקר גרימת C ל T ו-G כדי מעברים באופן אקראי ברחבי הגנום ומייצרת 1 שינוי bp ב כל 125 kb של הגנום. EMS מוטארסיס יהיה לגרום ≈ 1000 משני זוגות בסיס יחיד שינויים, ההכנסה/מחיקות (InDel) או בודד פולימורפיזם (SNP) לכל גנום12. מוטציות בהשפעת EMS הן מוטציות בנקודות מרובות עם תדר מוטציה הנע בין 1/300 ל 1/30000 לוקוס. זה מפחית את מספר M1 צמחים הדרושים כדי למצוא מוטציה בגן נתון. טווח של אוכלוסיית M1 הזרע של 2000-3000 משמש בדרך כלל כדי להשיג מוטציות של עניין ב arabidopsis thaliana13,14.

Aequorin transgenics הם Arabidopsis קולומביה-0 (Col-0) צמחים אקולוגיים המבטא p35S-apoaequorin (pMAQ2) ב ציטוסול15. Aequorin הוא חלבון Ca2 + מאגד המורכב האפופרוטאין וקבוצה תותבת המורכבת של מולקולה לוציב, קומרכאזין. הכריכה של Ca2 + כדי aequorin, אשר יש שלוש Ca2 + מאגד הידיים האתרים, התוצאות בתוך מחזוריות החיידקים והמחזוריות כדי לתת את dioxetanone ביניים, ואחריו שינוי מאוד של החלבון מלווה על ידי שחרורו של פחמן דו חמצני ו זינגתן-נרגש קוקונב16. Coelenteramide כל כך המיוצר פולט אור כחול (λmax, 470 nm) כי ניתן לזהות על ידי לומימטר17. מהיר ביותר Ca2 הגבהים יכולים ובכך להיות נמדד בזמן אמת, ומנוצלת מהירה קדימה מסכי גנטיות. פרוטוקול זה נועד להשתמש בספציפיות של תגובת הסידן כדי לזהות נגני מפתח חדשניים המעורבים בחתימת Ca2 + . כדי להשיג משימה זו, אנו משתמשים במוטזיס EMS בתוך הטרנסגניים aequorin ומזהים את ה-SNPs המשויך ל-Ca2 + איתות שהשתנה. הפרוטוקול מזהה מוטציות שאינן מראות או מופחת Ca2 + הגבהים על תוספת הגירוי. לאחר מכן ניתן למפות מוטציות אלה כדי לזהות את הגנים האחראים על Ca2 + תגובה. השיטה ישימה לכל סוג של גירוי נוזלי בצמחים שתוצאתו Ca2 + העלאה. מאז Ca2 + העלאה היא אחת התגובות הראשונות במסלול ההגנה הצמח איתות, זיהוי של רכיבי תגובה במעלה הזרם יכול לספק מועמדים הנדסה גנטית לפתח צמחים גמישים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מוטזיס EMS ואוסף זרעים יחיד המבוסס על אילן יוחסין (1-3 חודשים)

  1. שוקל 150 מ ג של זרעים (~ 7500) של aequorin עבור מוטארסיס EMS (M0 זרעים). שוקלים עוד 150 מ ג של זרעים לשמש כפקד.
  2. להעביר את הזרעים לצינור 50 mL ולהוסיף 25 מ ל 0.2% EMS (v/v) (התראה) (לטיפול) או 25 מ ל של מים אוטומטיים (עבור שליטה).
    הערה: אתיל-מתאן סולולאט הוא סוכן כימי לחומרים צמחיים מוטוניים.
  3. אטום את הצינור עם parafilm ולעטוף אותו רדיד אלומיניום. סובב את הצינור קצה-מעל-קצה עבור 18 h בטמפרטורת החדר.
  4. . הניחו לזרעים להתיישב הסר את הפתרון EMS בקפידה ולהשליך במיכל פסולת המכילה 1 M NaOH בנפחים שווים (NaOH מסייע לנטרל/inactivate EMS מה שהופך אותו בטוח להשליך). התעלם מכלי הפלסטיק המשמשים בפתרון של 1 מ-NaOH.
    הערה: לאחר 24 שעות, להיפטר ממחיקה על פי נוהלי מעבדה חומרים מסוכנים.
  5. שטוף את זרעי המוטמושים ביסודיות עם 40 מ ל של מים אוטוקלבים לפחות 8 פעמים. התעלם מהאמס המכיל מים במיכל פסולת NaOH כפי שהוזכר לעיל.
  6. עבור השטיפה הסופית, להוסיף 40 mL של 100 mM הנתרן תיוסולפט ולשטוף 3 פעמים כדי להסיר עקבות של EMS.
  7. להשרות את הזרעים ב 40 mL של מים אוטוקלשים עבור ~ 1 h כדי לפזר EMS מתוך הזרעים ולאחר מכן למקם אותם על נייר סינון עד יבש לחלוטין.
  8. העבירו את הזרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את הזרעים ב -4 ° c ב-40 mL של מים אוטוקלבים במשך 2-4 ימים. זה עוזר לשבור את הזרעים הזרע ומבטיח צמיחה הומוגנית.
  9. העברת הן את זרעי המוטטזים (M0) ואת הזרעים לשלוט על הקרקע (הרכב הקרקע: אגרופט: soilrite, 1:1) ולהעביר אותם חדרי צמיחה עם 16 h אור/8 h photoperiod כהה, עוצמת אור של 150μ:∙ M 2∙ s-1 ו ~ 70% לחות יחסית.
  10. כדי לקבוע אם מוטגנזה הצליחה, חפש מהירות נביטה מופחתת צמיחה שתיל, ו כלורופיל sectoring18 (איור 1a). השוו את הצמחים המוטוטניים למפעלי הבקרה כדי לזהות את ההבדלים הפיסיולוגיים וההתפתחותיים.
    הערה: ניתן להשתמש בשיטות שונות לקצירת זרעים מצמחי M1 . בפרוטוקול זה, השתמשנו בשיטת איסוף הזרעים המבוססת על אילן יוחסין אחת. כל מפעל M1 מוענק מספר ייחודי, החל A1 ל A3500.
  11. שמור על צמחים ממוספרים בנפרד כקווי צמחים נפרדים (איור 1B).
  12. עם התבגרות, הקציר זרעים מן הצמחים האלה בודדים מוטציה ולאחסן כמו M1 קווים (איור 2). מן האוסף המבוסס על אילן יוחסין אחד, הגענו סביב 5000 M1 שורות מתוך אשר 3500 M1 קווים הוקרן.

2. הקרנת תפוקה גבוהה כדי לבחור מוטציות (8 חודשים)

  1. לזהות מוטציות הרומן מבוסס על Ca2 + תגובה לגירוי שנבחר. . הנה, השתמשנו ב-2או2 כדוגמה
  2. לזיהוי מוטציות, להקרין את הדור M2 . מאז המוטנטיםהרצתיים ביניהם בשנת 1/8 תדירות ב-M 2 דור על מוטזיס EMS14, הקרנה של 8-12 m2-פנקסי צמחים מכסה אחד מ1 קו ומזהה מוטציה homozygous רצסיבי (באמצעות 12 שתילים מגביר את ההסתברות של מציאת מוטציה). מכל קו1 עצמאי, לבדוק 12 m2 שתילים עבור Ca2 + תגובה H2O2 (12 m2 שתילים לכל שורה1 ).
  3. השתמש בתפוקה גבוהה של זרע סירוס ועיקור ידרופוני צמח פרוטוקול19. מקום כמעט 12-15 M2 זרעים לכל M1 קו בארות בודדות של לוח 24-היטב של הרקמה התרבותית ולעקר באמצעות גז כלור (40 mL של 12% נתרן רדמה ו חומצה הידרוכלורית, 3:1, v/v) ב desiccator עבור 4 h ב מכסה המנוע. לאחר ההליך, לפתוח את הdesiccator ולהשאיר לילה על הגז כלור להתאדות.
  4. לאחר עיקור, להביא צלחות החוצה ולהוסיף נוזלי 1/2 MS מדיה (למחצה כוח MS ללא אגר) בארות בודדות. חותם את הצלחות עם parafilm ו stratify את הזרעים עבור 2-4 ימים ב 4 ° צ' ולאחר מכן להעביר זרעים לחדר גידול עם 10 h אור/14 h photoperiod כהה ב 20-22 ° צ' עם 70% לחות יחסית.
  5. לאחר השתילים הם 8-12 ימים, מקום 12 M2 שתילים מכל שורה בנפרד בלוח 96-ולומימטר. למדידת Ca 2+ תגובה H2O2, השתמש בקורא צלחת לומילומטר.
  6. לאחר העברת שתיל, להוסיף 150 μL של 5-10 μM הפתרון האוטומטי (מדולל במים אוטוקלשים מ 5 מ"מ מלאי ב מתנול) (זהירות) בבארות בודדים באזור כהה/נמוך אור לאחסן בחושך ב 21 ° c עבור 8 h.
    הערה: קומנטראטין היא קבוצה תותבת הקושרת אל איי-אאקוורין ומהווה אותה מחדש ל-aequorin תפקודית. קונטראטין הוא רגיש באור ולכן מאוחסן בבקבוקים בצבע כהה, מוגן מפני אור.
  7. למחרת, לבצע מסך מוטציה באמצעות 10 מ"מ H2O2 הגירוי ולמדוד Ca2 + תגובה הבאים.
  8. עבור מדידה בו של 24 בארות, ליצור תוכנית קינטית אוטומטית המודד את הרקע עבור 1 דקות, ואחריו תוספת גירויים (40 μL) ומדידה עבור 10 דקות, ואחריו פריקה הכולל aequorin (2 M CaCl2 ב 150 μl 20% אתנול) עבור 1-2 דקות.
    הערה: הפריקה הסופית עבור aequorin סה כ נדרש כדי לכמת את Ca נמדד2 + וכתוספת בקרת aequorin פונקציונלי. הפריקה הסופית היא ריצה קצרה של 1-2 דקות ואינו גורם מוות צמחי משמעותי. לחילופין, אם הצמחים למות לאחר הפריקה צעד, ואז לחדש את המסך הספציפי1 קו והצלה ללא השחרור. מוטציות כאלה ניתן אישר ב M3 ו-m4 הדורות באמצעות צעד פריקה.
  9. השתמש בשיטת סריקה בתבנית 24 שעות המודד כל שורה במרווח של 7 עם 300 ms זמן האינטגרציה לכל נקודת מדידה. השתמש שתיל מסוג פראי כמו שליטה בכל שורה להשוואה והערכה של המוטציות.
    הערה: יחידה 96 הבאר המכילה M2 שתילים יכסה 8 הפרט m1 קו (8 M1* 12 = 96 M2) ניתן לוקרן ב 2.5 h ו כל יום 32 M1 קווים יהיה מוקרן, 640 m1 צמחים לחודש. כל תהליך ההקרנה לאחר הצמחים מוכנים ייקח בערך 8 חודשים.
  10. זיהוי מוטציות מבוסס על אובדן או מופחת Ca2 + תגובה עם H2O2. להציל את המוטציות שנבחרו באמצעות תהליך כביסה המבוסס על אנטיביוטיקה. לשטוף את שתיל עם 25 מ"ג/L cefo, פתרון פעמיים ולאחר מכן להעביר לאמצעי הצלה המכיל 25 מ"ג/L cefoסעה בשנת 1/2 MS אגר.
  11. לגדל את לוחיות באור 10 h/14 h photoperiod כהה כדי להשיג צמח מוטציה. שטיפת הצ מסייעת להסרת כל מיקרו אורגניזמים מזיקים על שתיל. מאז שתילים לאחר החוקה נשמרים בלתי אטום, למזער זיהום כאשר מועבר חזרה למצב סטרילי.
  12. להעביר את המפעל מוטציה קרקע להשגת homozygous M3 אוכלוסיה.

3. ניתוח נתונים וזיהוי מוטציה (1-3 חודשים)

הערה: הקריאות שסופקו מהשיטה הנ ל הן יחידות אור יחסיות (RLU).

  1. לחישוב [Ca2 +] הריכוזcyt , השתמש במשוואה הריכוז הבאה20.
    pCa = 0.332588 (למטה-יומן (L/Lmax) + 5.5593
    ספירות לומינסנציה () וספירות שנותרו (מקסימום).
  2. המר את ערכי ה-pCa שהתקבלו ל [Ca2 +] ערכיcyt ב-μm על-ידי הכפלה ב-106. לאחר מכן להתוות באופן גרפי נגד aequorin (הטרנסגניים Col-0 aequorin) בקרה לזיהוי הבנה H2O2 מוטציות כדי Ca2 + תגובה.
  3. שתילי הצלה מראה אובדן או מופחת התגובה H2O2 יישום שחולצו.
  4. עם התבגרות, הקציר זרעים מן המוטציות שחולצו והמסך מחדש עבור תגובה H2O2 ב M3 שתילים. אם כל 12 M3 שתילים להראות Ca2 + תגובה דומה לצמח האם, לשקול את האוכלוסיה להיות homozygous M3 מוטציה אוכלוסיה. אם כל 12 שתילים לא מראים תגובה כזאת, לאחר מכן לקחת אותם כדי4 הדור והמסך מחדש כדי להשיג homozygous אוכלוסיה.
  5. לאחר קו צמח homozygous הושג, לזהות את הגן המוביל שונה פנוטיפ באמצעות רצף הדור הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אוכלוסיית EMS הוקרן עבור H2O2 המושרה Ca2 + העלאת. כפי שהוזכר קודם לכן, 12 שתילים בודדים מ2 הוקרן מכל קו M1 . באיור 3, אחד כזה שורה M1 מותווים עם כל פאנל המציג 12 בודדים M2 שתילים. Aequorin מסוג פראי משמש כשליטה להשוואת והערכת תגובת המוטציות. ביחס של 1:7 (חשבונאי: לא מוטציה). כאשר ההקרנה 12 שתילים בודדים לשורה M1 , אנחנו יכולים לזהות 1 או 2 מוטציות בכל שורה. זיהינו 2 מוטציות בפוטוטיבית מ 12 M2 ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מוטגנזה EMS היא כלי רב עוצמה להפקת מוטציות באוכלוסיה. המסכים הקלאסי קדימה הגנטי באמצעות EMS כבר כלי יעיל כדי לזהות גנים הרומן שתי סיבות עיקריות: ראשית, הם לא דורשים כל הנחות מראש על זהות גנטית ושנית, הם לא מציגים כל הטיה. ישנן מספר שיטות ליצירת אוכלוסיות הקרנה כמו EMS, T-DNA הוספות, רדיוציות וכו '. מתוך כל השיטות, מוטזיס המבוסס על EMS מספר יתרונות בשיטות אחרות. ראשית, קל יותר ליצור אוכלוסיית מוטציה באמצעות חשיפה ל-EMS כפי שמתואר בפרוטוקול הנוכחי21,22. שנית, ניתן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לאומי המכון לחקר הגנום צמח-פיטוטרון מתקן לצמיחת הצמח, בומביי באזור עבור לירות וידאו, ואת המחלקה לביוטכנולוגיה-eLibrary Consortium עבור מתן גישה משאבי e. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הודו באמצעות המכון הלאומי למחקר הגנום צמח מענק הליבה, מקס פלאנק Ge, הודו הקבוצה השותפים התוכנית; ו-CSIR-זוטר מלגת מחקר (ל-D. M ו-S. M) והמחלקה למלגות ביוטכנולוגיה-זוטר (ל-R. P).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית רקמות 24 בארJetbiofil11024לגידול שתילים
96 באר cliniplate לבןThermo Scientific9502887למדידות לומינומטר
Aequorin
AgropetLab Chem Indiaלגידול צמחים
סידן כלוריפישר סיינטיפיק12135לפריקה תמיסה
CoelenterazinePJK55779-48-1קבוצה תותבת לאקורין
Ehtylmethane sulfonateSigma AldrichM0880-5Gלמוטגנזה של זרעים
אתנולמגיב אנליטי1170לתמיסת פריקה
חומצה הידרוכלוריתMerck Life Sciences1.93001.0521תמיסת עיקור
מי חמצןפישר סיינטיפיק15465כגירוי לעליית סידן עליית
לומינסקאןתרמו סיינטיפיק5300172מדידת זוהר AEQUORIN
MES מאגרHimediaRM1128-100Gגידול צמחים
Murashige ו-skoog mediaHimediaPT021-25Lגידול צמחים
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיק27805לנטרול EMS
נתרן היפוכלוריטMerck Life Sciences1.93607.5021תמיסת עיקור
נתרן תיוסולפטפישר סיינטיפיק28005לשטיפת זרעים בשלב 1.6
soilriteLab Chem Indiaלגידול צמחים
עציצים מרובעיםLab Chem Indiaלגידול צמחים
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S0389גידול צמחים
טקסיםאלקם7180720להצלת שתילים

מקורות

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362(2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

EMSAequorinCoelenterazineHigh Throughput ScreeningArabidopsis thaliana
המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.