הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך גולגולתית והדמיית תהודה מגנטית

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61272

⸱

7 ביוני 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University, 3Department of Veterinary Biosciences, The Ohio State University, 4Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

מידול גרורות מוח תוך גולגולתי מסובך על ידי חוסר יכולת לפקח על גודל הגידול ותגובה לטיפול בשיטות מדויקות ובזמן. המתודולוגיה שהוצגה זוגות הזרקת גידול תוך גולגולתי עם ניתוח הדמיית תהודה מגנטית, אשר בשילוב, מטפח זריקות מדויקות ועקביות, ניטור משופר של בעלי חיים, ומדידות מדויקות של נפח הגידול.

תקציר

התפשטות גרורתית של סרטן היא תוצאה מצערת של התקדמות המחלה, תת סוגים אגרסיביים של סרטן, ו / או אבחון מאוחר. גרורות מוח הן הרסניות במיוחד, קשה לטיפול, ולעצות פרוגנוזה גרועה. בעוד השכיחות המדויקת של גרורות במוח בארצות הברית נשאר קשה להעריך, זה צפוי לגדול כמו טיפולים מחוץ לגולגולת ממשיכים להיות יעילים יותר בטיפול בסרטן. לכן, יש צורך לזהות ולפתח גישות טיפוליות חדשניות לטיפול ב גרורות באתר זה. כתוצאה מכך, הזרקה תוך גולגולתית של תאים סרטניים הפכה לשיטה מבוססת היטב שבה מודל גרורות במוח. בעבר, חוסר היכולת למדוד ישירות גידול צמיחה כבר מכשול טכני למודל זה; עם זאת, הגדלת הזמינות ואיכות של מודאליות הדמיה בעלי חיים קטנים, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), משפרים במידה רבה את היכולת לפקח על גידול צמיחה לאורך זמן להסיק שינויים בתוך המוח במהלך תקופת הניסוי. בזאת, הזרקה תוך גולגולתית של תאי גידול ממין ממין לתוך עכברים חיסוניים ואחריו MRI מדגים. גישת ההזרקה המוצגת משתמשת בהרדמה isoflurane והתקנה סטריאוטיפית עם מבוקר דיגיטלית, הזרקת מקדחה ומחט אוטומטית כדי לשפר את הדיוק, ולהפחית שגיאה טכנית. MRI נמדד לאורך זמן באמצעות מכשיר טסלה 9.4 באוניברסיטת אוהיו מדינת ג'יימס מקיף סרטן מרכז הדמיה בעלי חיים קטנים משאב משותף. מדידות נפח הגידול מדגימים בכל נקודת זמן באמצעות ImageJ. בסך הכל, גישה זו הזרקה תוך גולגולתית מאפשרת הזרקה מדויקת, ניטור היום-יומי, ומדידות מדויקות של נפח הגידול, אשר בשילוב לשפר מאוד את השירות של מערכת מודל זו כדי לבדוק השערות רומן על הנהגים של גרורות במוח.

מבוא

גרורות המוח נפוצות פי 10 מאשר גידולים במערכת העצבים המרכזיתלמבוגרים 1, ודווחו כמעט בכל סוג גידול מוצק עם סרטן ריאות, סרטן השד, מלנומה המציגה את השכיחות הגבוההביותר 2. ללא קשר לאתר הגידול העיקרי, התפתחות גרורות המוח מוביל פרוגנוזה עניה הקשורים לעתים קרובות עם ירידה קוגניטיבית, כאבי ראש מתמידים, התקפים, התנהגותי ו / אושינויי אישיות 1,,3,,4,,5. במונחים של סרטן השד, היו התקדמות רבות במניעה וטיפול במחלה. עם זאת, 30% מהנשים שאובחנו עם סרטן השד ימשיך לפתח גרורות, ואלה עם מחלת שלב IV, כ 7% (SEER 2010-2013) יש גרורות מוח6,,7. אפשרויות הטיפול הנוכחיות עבור גרורות במוח כרוכות בניתוח כירורגי, רדיוכירורגיה סטריאוקטית ו/או הקרנות מוח שלמות. עם זאת, גם עם טיפול אגרסיבי זה, ההישרדות החציוני עבור חולים אלה הוא קצר 8-11 חודשים7,8,9. נתונים עגומים אלה תומכים מאוד בצורך בזיהוי ויישום של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות ויעילות. לכן, כמו עם כל סוגי הסרטן גרורות למוח, זה חיוני כדי מודל כראוי סרטן השד הקשורים גרורות המוח (BCBM) במעבדה כדי להבטיח התקדמות משמעותית בתחום.

עד כה, החוקרים השתמשו במגוון מתודולוגיות כדי ללמוד מנגנונים של גרורות למוח, כל אחד עם יתרונות ומגבלותברורות 10,11. שיטות גרורות ניסיוניות כגון ורון זנב והזרקת תוך לב להפיץ תאים סרטניים בכל הגוף, יכול לגרום לנטל גידול עצום באתרים גרורתיים אחרים בהתאם לתאים מוזרקים. תוצאות אלה הן אז מבלבל אם במיוחד ללמוד גרורות למוח. שיטת הזרקת עורק intracarotid הוא יתרון כפי שהוא במיוחד מטרות הזרעת המוח של תאים סרטניים, אבל מוגבל כפי שהוא יכול להיות קשה מבחינה טכנית לבצע. פירוק הגידול הראשי אורתוטופי נחשב לעתים קרובות המודל הרלוונטי ביותר מבחינה קלינית של גרורות כפי שהוא מסכם את כל מפל גרורתי. עם זאת, גישה זו כרוכה תקופות המתנה ממושכות גרורות ספונטניות להתרחש עם שיעור נמוך באופן דרמטי של גרורות במוח בהשוואה לאתרים גרורתיים אחרים כגון בלוטת הלימפה, הריאה והכבד. לעתים קרובות, בעלי חיים יש להסיר מחקרים בשל נטל הגידול באתרים גרורתיים אחרים אלה לפני התפתחות גרורות המוח. שיטות אחרות המערבות קווי תא טרופי במוח יעילים גרורות למוח; עם זאת, מודלים אלה מוגבלים בכך שהם לוקחים את הזמן לפתח ולעתים קרובות לאבד את הטרופיזם שלהם עם התפשטות. בהתחשב במגבלות אלה, החוקרים השתמשו באופן שגרתי בשיטת הזרקה תוך גולגולתית כדי מודלגרורות סרטן למוח 11,12,13,14 עם מתודולוגיות שונות15,16,17,18,19. הוא הודה כי גישה זו יש מגבלות באופן דומה, והכי חשוב בכך שהוא אינו מאפשר חקירה של צעדים גרורתיים מוקדמים כולל תוך תוך תוך תוך תוך תחקור מתוך הגידול העיקרי, חודרה דרך מחסום המוח בדם, והקמת בתוך המוח. עם זאת, זה מאפשר לחוקרים לבדוק (1) מה הגידול נגזר גורמים לתווך צמיחה בתוך המוח (למשל, מניפולציה גנטית של גורם oncogenic בתאים סרטניים), (2) איך שינויים microenvironment גרורתי לשנות את הצמיחה סרטן באתר זה (למשל, השוואה בין עכברים טרנסגניים עם רכיבים סטרומה שונה) ו (3) יעילות של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות על צמיחה של lesions הוקמה.

בהתחשב בכלי השירות הפוטנציאלי של מודל הזרקה תוך גולגולתית, זה בהחלט הכרחי כדי להפחית את השגיאה הטכנית במהלך ההזרקה ולפקח במדויק על צמיחת הגידול לאורך זמן. השיטה המתוארת בזאת כרוכה מינון מתמשך של הרדמת גז בשאיפה, השתלה ישירה של תאים סרטניים לתוך parenchyma המוח באמצעות מקדחה סטריאוטיפית ועמדה הזרקה. מתן הרדמה בגז מאפשר כוונון עדין של עומק ואורך ההרדמה, כמו גם הבטחת התאוששות מהירה וחלקה. מערכת הזרקת מקדחה ומחטים מבוקרת דיגיטלית משפרת את דיוק אתר ההזרקה ומפחיתה שגיאה טכנית שנגרמה לעתים קרובות על ידי קידוח ושיטות הזרקה ביד חופשית. השימוש בהדמיית תהודה מגנטית (MRI) מגביר עוד יותר את הדיוק בניטור גידול, נפח הגידול, תגובת רקמות, נמק גידול, ותגובה לטיפול. MRI הוא מודאליות הדמיה של בחירה עבור רקמותרכות 20,,21. טכניקת הדמיה זו אינה משתמשת בקרינה מיוננת ומועדפת על פני טומוגרפיה ממוחשבת (CT), במיוחד עבור הפעלות הדמיה מרובות במהלך המחקר. MRI יש מגוון גדול הרבה יותר של ניגודיות רקמות רכות זמין אז CT או הדמיית אולטרסאונד (USG) ומציג אנטומיה בפירוט רב יותר. זה יותר רגיש וספציפי לחריגות בתוך המוח עצמו. MRI יכול להתבצע בכל מטוס הדמיה מבלי להזיז פיזית את הנושא כפי שהוא במקרה 2D USG או הדמיה אופטית 2D. חשוב לציין כי הגולגולת אינה להחכיר את אות ה-MRI כמו בהדמיות אחרות. MRI מאפשר הערכה של מבנים שעשויים להיות מוסתרים על ידי חפצים מעצם CT או USG. יתרון נוסף הוא כי ישנם סוכני ניגוד רבים זמינים עבור MRI, אשר משפר את מגבלת זיהוי נגע, עם רעילות נמוכה יחסית או תופעות לוואי. חשוב לציין, MRI מאפשר ניטור בזמן אמת בניגוד להערכה היסטולוגית בזמן necropsy, אשר מוגבל בפענוח נפח הגידול. תוחם הדמיה אחרות, כגון הדמיה ביולומים, הם אכן יעילים לגילוי מוקדם של גידול וניטור לאורך זמן; עם זאת, שיטה זו דורשת מניפולציה גנטית (למשל, תיוג luciferase/GFP) של קווי תא ואינה מאפשרת מדידות נפחיות. MRI הוא יתרון נוסף כפי שהוא משקף ניטור המטופל וניתוח נפח במורד הזרם של תמונות MR ידוע להיות מאוד בקורלציה לגודל הגידול ההסטולוגי ב necropsy22. ניטור סדרתי עם הקרנת MRI גם מגביר את הניטור הקליני של ליקויים נוירולוגיים, אם הם מתעוררים.

בסך הכל, השיטה המוצגת של הזרקת גידול תוך גולגולתי סטריאוטיפי ואחריו MRI סדרתי מאפשר לנו לייצר אמין, צפוי, ותוצאות מדידות כדי ללמוד מנגנונים של גרורות במוח בסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות בזאת אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ולשימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אוהיו (P.I. Gina Sizemore; פרוטוקול #2007A0120). כל ניתוחי הישרדות מכרסמים IACUC מדיניות הם אחריו, כולל שימוש בטכניקות סטריליות, אספקה, מכשירים, כמו גם הסרת פרווה והכנה סטרילית של אתר החתך.

1. הזרקה תוך גולגולתית של תאים סרטניים בשד

הערה: השיטה המתוארת בזאת השתמשה בקו תא גידול מאמין DB7 נגזר גידול MMTV-PyMT ראשי 23. מחקרים קודמים קבעו הזרקה תוך גולגולתית של תאי DB7 כמודל של BCBM עם היסטרולוגיה המחקה את זה של המחלההאנושית 12. חשוב לציין, עכברי FVB/N הכשירים למערכת החיסון משמשים למודל זה כתאי DB7 נגזרו מזן זה של העכבר. כמו זה מודל סרטן השד, עכברים נקבה בוגרת משמשים עבור מחקרים אלה.

  1. הכן תאים.
    1. במכסה מנוע סטרילי, לשאוף מדיה מצלחת תרבות התא באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
    2. לשטוף תאים עם DPBS אחד ו trypsinize באמצעות פרוטוקול היצרן.
    3. הוסף אמצעי אחסון מתאים של מדיה המכילה FBS כדי לעצור את תגובת trypsin ולקבוע את ריכוז התאים באמצעות hemocytometer או שיטה מועדפת.
    4. כדורי ב 300 x g עבור 4 דקות ב 4 ° C.
    5. שאפפו מדיה, שטפו עם DPBS אחד, סובבו מחדש ב-300 x g למשך 4 דקות ב-4°C.
    6. תאים מחדש ב DPBS 1x לריכוז המתאים, כ 50,000 תאים לכל נפח להזרקה של 2 μL.
      הערה: מספר התא תלוי באגרסיביות של הקו וצריך להיקבע על ידי החוקר. אנו משתמשים באופן שגרתי 2 μL, אבל השימוש אמצעי אחסון <6 μL מדווח15,16,17,,18,19. נפחים נמוכים הם קריטיים כדי לשמור על דיוק.
    7. מניחים תאים מחדש על קרח עד להזרקה כדי לשמור על הכדאיות.
  2. הכן עכברים לניתוח.
    1. לעכברים עם פרווה: מוציאים פרווה מהגולגולת, בין אם על ידי קרם/קרם דפילציה או על ידי גילוח. לעשות זאת בתוך 24-48 שעות לפני הניתוח כמו ביצוע שלב זה קרוב מדי לניתוח יכול להפריע לאיכות העור וכוח תפר.
      הערה: עכברי FVB/N נשיים במשקל של כ 25 גרם שימשו עקב המחקר של סרטן השד גרורתי, מחלה נשית בעיקר.
    2. ניהול משכך כאבים כפי שנקבע על ידי IACUC ווטרינר נוכח: הזרקה תת עורית של Buprenorphine SR-LAB (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג מינון, מניית Buprenorphine: 0.5 מ"ג/מ"ל עבור מינון של 0.0025-0.088 מ"ל) לפחות 24 שעות לפני הניתוח כדי לספק עד 72 ש', אשר עשוי לחזור על 48-72 שעות לאחר המנה הראשונה, במידת הצורך. גם לנהל NSAIDs (20% איבופרופן בשתייה מים למשל, 1 מ"ג/5 מ"ל) לפחות 24-48 שעות לפני הניתוח ולהמשיך 2-7 ימים לאחר הניתוח כדי לספק מינימום 72 שעות לאחר הניתוח משכך כאבים.
      הערה: באוניברסיטת אוהיו, Buprenorphine SR-LAB מנוהל על ידי צוות וטרינרי משאבי בעלי חיים מעבדה של אוניברסיטת כפי שהוא חומר מבוקר.
  3. הכן יחידות סטריאוטיפיות לניתוח.
    1. הפעל את כל מכונות ההרדמה, סולמות Vernier דיגיטליים, ומזרקים דיגיטליים.
      הערה: יש לנקות ולחטא את כל הכלים הכירורגיים כראוי לפני הניתוח.
    2. השתמש במכונות הרדמה עם חיבור תא אינדוקציה בארונות בטיחות ביולוגיים(איור 1A).
    3. ודא שכל הצינורות מכונות ההרדמה מחוברים למסגרות הסטריאוטיפיות (איור 1B, inset 1C) והמלחציים על הצינורות פתוחים לכל היחידות בהן נעשה שימוש. סגור את כל המלחציים על צינורות הולך מסגרות סטריאוטיפיות שלא ישמשו לניתוח.
    4. הגדר מכונות הרדמה ליצרן מומלץ קצב זרימת קונוס האף בהתבסס על משקל העכבר (למשל, 25 גרם משקל בעלי חיים: קצב זרימת חנוס האף 34 מ"ל/דקה).
      הערה: בעל הראש הכלול בהגדרה סטריאוטיפית זו מומלץ רק לעכברים בוגרים. ודא שהמלצות היצרן הכלולות בהגדרה הסטריאוטיפית יבוצעו.
    5. ודא כי ההרדמה המתאימה (למשל, isoflurane) ממולא מראש במזרק מחובר למכונה ההרדמה(איור 1B).
      הערה: יתר על המזרק יכול לגרום להרדמה רבה מדי כדי להימסר לעכברים במהלך הניתוח ולגרום מנת יתר של הרדמה.
    6. הכן את המקדחים על-ידי סיבוב נעילת הבמה, הכנסת מתאם סיביות מקדחה וסיביות מקדח 1 מ"מ לתוך כל מקדחה ולנעול את המקדחה על-ידי הידוק ידני של נעילת הסיביות.
    7. חבר מקדחות למסגרות הסטריאוטיפיות (איור 1C).
    8. מזרקים המילטון נקי עם 5 שטיפה לסירוגין של 1x DPBS, אז 70% אתנול, ואז שוב ב 1x DPBS. מניחים בצד עד שהחיה מוכן להזרקה.
    9. הגדר מזרק דיגיטלי כדי לספק בקצב של 0.4 μL/min ויעד של 2 μL. קצב זה ונפח מאפשרים מבוא איטי של תאים סרטניים לתוך המוח, אשר מפחית את הלחץ ואת הנזק הקשורים.
  4. מניחים עכברים על מסגרות סטריאוטיפיות.
    1. עכברים מברינדים (לדוגמה, isoflurane) באמצעות תא האינדוקציה הנ"ל.
    2. לשמור על עכברים לאורך כל ההליך בהרדמה עמוקה. ההרדמה % הניתנת על ידי המכונה תלויה במספר גורמים, כולל: קצב זרימה, מידת גירוי וטמפרטורת גוף. עקוב אחר העכברים לעתים קרובות לאורך כל ההליך לעומק של הרדמה על ידי הערכת נשימה קצבית (בעלי חיים אינו מתנשף); חוסר רפלקס פלפרל (רפרוף העפעפיים כאשר מגורה עם אפליקטור קצה כותנה); וחוסר צביטה בהון (נסיגה של איבר על הגירוי המחוסר טעם של צביטת ההונות).
      הערה: זנים שונים של עכברים תהיה תגובה שונה להרדמה.
    3. לאחר שעכברים נמצאים במישור הרדמה מתאים ועמוק, העבר את העכברים ליחידה הסטריאוטיפית. השתמש במשטח חימום בזמן שהעכבר נמצא על המכונה הסטריאוטיפית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ומישור הרדמה מתאים.
      הערה: כדי להשיג פרופיל נמוך אנו משתמשים מחממי ידיים המופעלים באוויר הממוקמים בתוך תיבת קצה פיפטה הפוכה (תיבת הגבהת עכבר באות 1D).
    4. פתח את פיו של העכבר והנח את השיניים באבוס של בר הפה הממוקם על פיסת האף על המסגרת הסטריאוטיפית(איור 2A). החלק את קונוס האף מעל האף/פיה של העכבר(איור 2B).
      1. מניחים עכברים עם ראש מורם על הפה. פתח בעדינות את הפה עם הקצה הקהה של אפליקטור קצה כותנה והחלק למקומו. ודא שקוסנוס האף נמצא באופן מלא מעל האף של העכבר או שההרדמה לא תישלח כראוי. קונוס האף לא יעסוק באף אם השיניים אינן יושבות בתוך החריץ הזה (איור Inset איור 2א).
    5. בעזרת ספוגית כותנה סטרילית, מניחים חומר סיכה לעיניים על כל אחת מעיני העכבר. יישום של חומר סיכה לעיניים מפחית את ייבוש הקרנית ומפחית את הסיכוי לנזק בקרנית וסיבוכים לאחר הניתוח הקשורים לטראומה בקרנית.
    6. לייצב את גולגולת העכבר על ידי מדכא את מוט האוזן השמאלית מול canthus המדאלי של האוזן השמאלית, נעילתו במקום באמצעות הבורג על המסגרת הסטריאוטיפית. לאחר מכן החלק את סרגל האוזן הימנית כנגד התותוס המדל של האוזן הימנית ובורג חזק על המסגרת הסטריאוטיפית(איור 2B).
      הערה: ודא כי ראש העכבר מאוזן וישר בעת הצבת פסים באוזן. אם הראש עקום או בזווית, הזריקה תהיה במקום הלא נכון במוח. יש להדק את הסורגים באוזן רק עד שהגולגולת משותקת על גירוי עם חידוד ידני מתון.
  5. תכין חלון קלברי.
    1. הכן ונקה את הקרקפת עם 3x לסירוגין עובר כל תמיסת בטאדין ו 70% אתנול. בשל הקרבה של האתר הכירורגי לעיניים, השתמש בתמיסת הבטאדין על קרצוף הניתוח.
    2. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך 3 מ"מ דרך העור לאורך ההיבט החציוני המרכזי של הגולגולת (בעקבות קו התפר sagittal). דימום בחתך צריך להיות מינימלי. במקרה זה, להחיל עקבי, לחץ מוצק באתר של דימום עם אפליקטור קצה כותנה סטרילית במשך >30 שניות.
    3. זהה וכוון את המקדחה בניצב ל-bregma (איור 2C), תוך הקפדה לאפס את קנה המידה הדיגיטלי Vernier לאפס.
    4. מעבירים את המקדחה 2 מ"מ להמשך התפר הסגיטל ו-1 מ"מ קדמיים לתפר הקורונה (איור 2C). לרבייה, ודא שהמיקום משמאל או מימין לקו התפר של הקשת נשאר עקבי עבור כל בעלי החיים.
    5. הפעל את המקדחה למהירות הגבוהה ביותר שלו. ודא שהעור מתרחק ממקדחה כדי למנוע נזק לרקמות הנגרמות על ידי החלק המסתובב וליזום בזהירות את המקדחה על הגולגולת. לקדוח חור בערך 0.5 מ"מ עמוק דרך calvaria, וכתוצאה מכך חלון calvarial. תיזהר לא להוריד את המקדחה רחוק מדי או שהוא לקדוח לתוך המוח. הטלת תמיסת מלח סטרילית באתר המקדחה בזמן שהמקדחה בתנועה יכולה לקזז כל חום שנוצר על ידי המכונה, מה שעשוי לגרום לנזק תרמי לרקמות שמסביב.
    6. לאחר שחלון הקלבריה עשוי, הרם בזהירות את המקדחה והסר אותו מהמסגרת הסטריאוטיפית.
    7. לנקות את פיסות המקדחה באמצעות 70% אתנול ולהוות בצד אם נעשה שימוש שוב. אם לא, הסר סיביות מקדחה ולשקוע ב 70% אתנול.
  6. הזרקת תאים סרטניים למוח
    1. חבר את יחידת המזרק האוטומטית למערכת הסטריאוטיפית(איור 1D).
    2. למשוך למעלה >2 μL של תאים ביסודיות מחדש 1x DPBS במזרק המילטון נקי. הקפד לתחל מחדש תאים מיד לפני מילוי המזרק כדי להפחית את היווצרות גוש ולהבטיח slurry תא הומוגני. זה אידיאלי למשוך את 6-8μL של נפח התא כדי להבטיח שאין כיסים אוויר / בועות.
    3. מניחים את מזרק המילטון על מתקן המזרק, ולהרים את המחט להזרקה על ידי חלוקת כמות קטנה של נפח על וילונות סטריליים חד פעמיים כדי להבטיח את המזרק עובד כראוי. מנגבים את המזרק עם 70% אתנול עם אפליקטור קצה כותנה(איור 1D, inset). זה מסיר תאים סרטניים מהחבית החוץ של פיר המחט מפחית את הסיכון של תא גידול זריעה לאורך מערכת ההזרקה.
    4. יישר את קצה המחט למרכז חלון הקלברי, וכמעט נגע במחשוף החשוף.
    5. אפס את קנה המידה הדיגיטלי של Vernier לאפס.
    6. לאט להכניס את המחט לעומק של 3 מ"מ לתוך המוח ולאפשר למחט להישאר במוח לפחות 60 שניות לפני שתמשיך. מסגרת זמן זו מאפשרת parenchyma המוח להתאים סביב המחט, אשר מפחית את לחץ הגב וגירוש פוטנציאלי של תאים סרטניים לאורך מערכת המחט.
    7. בחר הפעל במסך המזרק כדי להתחיל במסירת תאים לאתר ההזרקה. זה ייקח כ 5 דקות כדי להזריק אמצעי אחסון זה. הזמן הממושך עבור צעד זה הוא להפחית נזק משני שנגרם על ידי כוח הזרקה על parenchyma במוח.
    8. לאחר פרוטוקול ההזרקה הוא סיים, לאפשר את המחט לנוח במוח לפחות 3 דקות, שוב מאפשר parenchyma המוח להסתגל לזריקה.
    9. לאחר 3 דקות לפחות, להעלות את המחט מהמוח בקצב של 0.75 מ"מ / דקות. לעשות את זה בצורה איטית ועקבית מאוד כדי להפחית את לחץ הגב ואת הגידול מעקב את מערכת המחט.
    10. ברגע שהמחט יצאה מהמוח, הסירו בזהירות את מזרק המילטון מהמזרק ונקיו כמתואר בשלב 1.2.8.
    11. למרוח שעוות עצם חמה על חלון הקלברי באמצעות ספוגית כותנה סטרילית. שעוות העצם משמשת כמחסום פיזי כדי לשמור על הגידול בתוך הגולגולת.
    12. סגור את החתך (לדוגמה, 5-0 PDS תפרים בלתי תמיסים בדפוס פשוט קטעים או קליפים תפירה, מה שהכי נוח למנתח).
    13. להפסיק את ניהול ההרדמה ולהסיר את העכבר מהמנגנון על ידי ביטול נעילה וגלישה החוצה את הסורגים האוזן, הזזת קונוס האף מהעכבר, ונתק את השיניים מפס הפה.
    14. מקם את העכבר בכלוב נקי הממוקם על סט חם יותר של 37 °C להחלמה. לפקח על עכברים במהלך ההחלמה, אשר מתרחשת בדרך כלל 10-15 דקות לאחר ההרדמה הופסקה.
    15. לאחר שחזור העכבר, לפקח על קריטריוני הסרה מוקדמת כפי שנקבע על ידי IACUC של המוסד המארח.

2. הדמיית תהודה מגנטית

  1. ניהול סוכן ניגוד מבוסס גדוליניום (100 μL/20 גרם עכבר משקל גוף של 0.1 M MultiHance) לעכברים על ידי הזרקה תוך-פריטוניתסטנדרטית 24 10-20 דקות לפני ההדמיה. לאחר מכן הרדמה באמצעות תא אינדוקציה עם הרדמה בשאיפה (למשל, isoflurane) מעורבב עם 95% O2 ו 5% CO2 (כלומר, גז אוויר בחדר מסופק).
  2. מניחים את העכבר על מחזיק מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. אבטחו את הראש עם ציצי אוזניים ובר נשיכה, ומחזיק מקום במגנט 9.4 T המצויד בסיליל של מוח העכבר. לשמור על הרדמה במהלך זמן הדמיה, מחקר בדרך כלל לוקח כ 20 דקות לכל עכבר. נטר את קצב הנשימה וקצב הלב (כ-70 bpm) לאורך כל ההליך באמצעות כרית פנאומטית ומערכת ניטור בעלי חיים קטנה.
  3. להשיג תמונת localizer ולאחר מכן תמונה מוח העכבר באמצעות רצף נדיר משוקלל T2 (TR = 3500-4228 ms, TE = 12 ms, RARE Factor = 8, FOV = 2.0 x 2.0 ס"מ, גודל מטריצה = 256 x 256, 1 מ"מ או 0.5 מ"מ פרוסות עובי, NA = 2-4, 15-30 פרוסות רציפות) ופוסט מבוסס קיום T1 משוקלל T1 (TR = 1200 ms, TE = 7.5 ms, RARE Factor = 4 FOV =2.0 x 2.0 ס"מ, גודל מטריצה = 256 x 256, 1 מ"מ או 0.5 מ"מ פרוסות עובי, NA = 2-4, 15-30 פרוסות רציפות).
  4. לאחר ההדמיה, מניחים את העכבר בכלוב על סט חם יותר ל-37°C להחלמה.

3. מדידות גידול נפח

  1. קבלת נפח גידול כולל
    1. פתח את קובץ הנתונים MRI DICOM ב- ImageJ, תוכנת עיבוד תמונה הזמינה להורדה בחינם דרך המכונים הלאומיים לבריאות (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
      הערה: ImageJ מאפשר צפייה של קבצי DICOM, אשר נדרש להשתמש בממדים פיקסל מוטבע עבור חישובי נפח הגידול (ראה תמונה , מאפיינים שבהם "יחידת אורך" ניתן להגדיר כרצונך (למשל, מ"מ).).
    2. השתמש בכלי בחירות יד חופשית כדי לצייר קו מתאר סביב הגידול. בצע בחירות אלה בחדר חשוך כדי לשפר את הניראות. אין לכוונן את הבהירות/הניגודיות כדי לשמור על עקביות בין הפעלות.
    3. תחת הכרטיסיה ניתוח, בחר מידה כדי להשיג את האזור של האזור הנבחר. אם יחידת מילימטרים נבחרה בשלב 3.1.1., שטח יינתן במילימטרים מעוקבים. אם תרצה, הטבע את הבחירה ביד חופשית על-ידי בחירה באפשרות ctrl+D. שנה את צבע הפלט על-ידי כך שתמשיך לערוך | אפשרויות | צבע. המרת התמונה לתדמית RGB (תמונה | סוג | צבע RGB) לפני שמירה כקובץ .tif.
    4. המשך במדידת כל הפרוסות המכילות גידול עבור עכבר בודד והעתק ערכים לתוכנת ניתוח נתונים מתאימה (לדוגמה, Microsoft Excel או מנסרה של GraphPad).
    5. לסכם את האזורים מכל פרוסה כדי לקבל נפח גידול כולל. הקפד לתקן את האזור בהתבסס על עובי פרוסה (אזור/עובי).
    6. שלבים מלאים 3.1.1.-3.1.5. עד שלכל העכברים יהיה נפח גידול כולל. בהתחשב באופי סובייקטיבי במקצת של התוויה של הגידולים, זה אידיאלי אם אותה מתודולוגיה חוזרת על עצמה מספר פעמים בממוצע כדי להפחית שגיאה טכנית.
    7. כדי להגדיר סולות קנה מידה, פתח את קובץ הנתונים של DICOM ולעבור אל נתח | כלים ומידע | סרגל קנה מידה. מאחר שהמדים כבר מוטבעים בקובץ DICOM, פשוט בחר את האורך/רוחב הרצויים. כיסוי לתדמית RGB (תמונה | סוג | צבע RGB) לפני שמירה כקובץ .tif.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 3 סקירות כימות נפח הגידול עבור עכבר יחיד בשתי נקודות זמן (היום 7 ויום 10) לאחר הזרקה של תאי גידול מאמין murine. לניסוי זה, 50,000 תאי DB7 הוזרקו, והמוח של החיה הוערך על ידי MRI. עבור כל סריקה, נתפסו 30 פרוסות (עובי 0.5 מ"מ). הערכה של 30 פרוסות לסריקה גילתה כי ביום 7 לאחר ההזרקה, 5 פרוסות הציגונטל גידול (איור 3A)וביום 10 לאחר ההזרקה, 9 פרוסות הציגו נטל גידול(איור 3B). כל תמונה הוערכה עבור אזור הגידול כמתואר ואת האזור עבור כל מסג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הניצול של הזרקה תוך גולגולתית ואחריו ניטור סדרתי עם MRI מספק את היכולת הייחודית לדמיין גידול צמיחה עם דיוק נפח הגידול לאורך זמן. היישום של ניתוח הדמיה דיגיטלית מאפשר פרשנות של נגעים במוח עבור נפח הגידול, דימום, נמק, ותגובה לטיפול.

כמו בכל הליך, ישנם שלבים מרכזיים שיש לבצע להצלחה. ראשית, התקנה זהירה של המכשירים הסטריאוטיפיים היא הכרחית להצלחת טכניקה זו. בשל הגודל הקטן של הגולגולת murine, אי התאמה קלה יכולה לגרום להשפעות שונות באופן דרמטי על קצב גידול ולקחת בעלי חיים ניסיוניים. ככזה, הכשרה נכונה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין שום גילויים.

תודות

נתוני הנציגות מומנו באמצעות המכון הלאומי לסרטן (K22CA218472 ל-G.M.S.). זריקות תוך גולגולתיות מבוצעות באוניברסיטת אוהיו מקיף סרטן מרכז יעד יעד אימות משאב משותף (מנהל – ד"ר רינה שאקאיה) ו MRI הושלמה באוניברסיטת אוהיו מקיף סרטן מרכז סרטן קטן הדמיה משאב משותף (מנהל – ד"ר קימרלי פאוול). שני המשאבים המשותפים ממומנים באמצעות OSUCCC, מענק התמיכה של מרכז הסרטן OSUCCC מהמכון הלאומי לסרטן (P30 CA016058), שותפויות עם המכללות והמחלקות של אוניברסיטת אוהיו, ומערכות chargeback מבוססות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חומרים כירורגיים חזקים>
BetadinePurdue מוצרים19-027132פובידון-יוד, 7.5%
שעוות עצםהתמחויות כירורגיות903שעוות דבורים סטרילית וניתנת לעיבוד ואיזופרופיל פלמיטט
Buponorphine SR-LabZooPharmN/Aמשכך כאבים הניתן להזרקה ארוך טווח 5 מ"ל (0.5 מ"ג/מ"ל) פורמולציה פולימטרית
אפליקטורים לקצה כותנהפוריטן25-806 10WCאפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה ארוך גבעול
משחת עינייםPuralube17033-211-38משחת עיניים על בסיס פטרולאטום ושמן מינרלי
מחממי ידייםHothandsHH2חבילות חום המופעלות באוויר
IbuprofenUp & עד094-01-0245100 מ"ג לכל 5 מ"ל בתרחיף נוזלי
איזופלורןהנרי שיין INC1182097הרדמה נוזלית לשימוש במכשיר אידוי הרדמה
אזמלאינטגרה Miltex4-41010 להב אזמל חד פעמי
דבק עורVetbond1469SBדבק פצעים בטוח לעור
חבישה סטריליתמוצריTIDI 25-517וילונות סטריליים ארוזים בנפרד
תפרCovidienSP5686G 45 ס"מ תפר מונופילמנט 5-0 מונופילמנט פוליפרופילן תפר
<חזק>יחידה סטריאוטקסית
מקדחה במהירות גבוהה (קדמה)קופףדגם 1474מקסימום של 38,000 סל"ד
עכבר גז הרדמה מחזיק ראשKopfדגם 923-Bמוט פה עם חור שיניים וחרוט אף
מוטות אוזניים ללא קרעKopfדגם 922מוטות אוזניים מתאימים ליישומי עכבר
מכשיר סטריאוטקסיKopfדגם 940מכלול לוחית בסיס, מסגרת וקנה מידה ליניארי עם צג
<מזרק חזק>מזרק
מזרק ומזרקהמילטון80366מחט 26 מד, אורך מחט 51 מ"מ ו-10 μ מזרק נפח L
Legato 130A משאבת מזרק אוטומטיתKD ScientificP/N: 788130בסיס מסך מגע הניתן לתכנות עם מזרק
<חזק>מכונת הרדמה חזקה
SomnoSuite וופורייזר דיגיטלי בזרימה נמוכהKent ScientificSS-01מכונת הרדמה דיגיטלית
SomnoSuite ערכת התחלה לעכבריםKent ScientificSOMNO-MSEKITכוללת תא אינדוקציה, 2x מזרקי הרדמה, צינורות 18 אינץ', אף מפלסטיק, 2x מיכלי גז פסולת אנשזיה
# קריאה דיגיטלי אוטומטי

מקורות

  1. Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
  2. Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
  4. Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
  5. Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
  6. Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
  7. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  8. Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411(2017).
  9. Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
  10. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  11. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  12. Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
  13. Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006(2018).
  14. Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
  15. Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397(2012).
  16. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017(2014).
  17. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).
  18. Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  20. Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
  21. Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
  22. Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
  23. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  24. Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
  25. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  26. Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
  27. Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ImageJMRI 9 4
מידול גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך גולגולתית והדמיית תהודה מגנטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.