מאמר שיטה

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

DOI:

10.3791/61281

⸱

10 ביולי 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Chemical Sciences, New York Institute of Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Chemistry, Hunter College, City University of New York, 4Department of Computer Science, New York Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (<35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות ריצוף מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS) הוכחו כשימושיות בריצוף ישיר של RNA ללא צורך במתווך DNA משלים (cDNA). עם זאת, גישות כאלה מיושמות לעתים רחוקות כשיטת ריצוף RNA דה נובו , אלא משמשות בעיקר ככלי שיכול לסייע באבטחת איכות לאישור רצפים ידועים של דגימות RNA חד-גדיליות מטוהרות. לאחרונה, פיתחנו שיטת ריצוף RNA ישירה על ידי שילוב אסטרטגיית תיוג קצה הידרופובית של זמן שימור מסה דו-ממדית בריצוף מבוסס MS (2D-HELS MS Seq). שיטה זו מסוגלת לרצף במדויק רצפי RNA בודדים כמו גם תערובות המכילות עד 12 רצפי RNA נפרדים. בנוסף לארבעת הריבונוקלאוטידים הקנוניים (A, C, G ו-U), לשיטה יש את היכולת לרצף אוליגונוקלאוטידים של RNA המכילים נוקלאוטידים ששונו. זה אפשרי מכיוון שלנוקלאובסיס השונה יש מסה ייחודית מהותית שיכולה לסייע בזיהויו ובמיקומו ברצף ה-RNA, או שניתן להמיר אותו למוצר בעל מסה ייחודית. במחקר זה, השתמשנו ב-RNA, תוך שילוב שני נוקלאוטידים שעברו שינוי מייצג (פסאודורידין (Ψ) ו-5-מתילציטוזין (m5C)), כדי להמחיש את יישום השיטה לריצוף דה נובו של אוליגונוקלאוטיד RNA יחיד כמו גם תערובת של אוליגונוקלאוטידים של RNA, כל אחד עם רצף שונה ו/או נוקלאוטידים ששונו. הנהלים והפרוטוקולים המתוארים כאן לרצף RNA מודל זה יהיו ישימים לדגימות RNA קצרות אחרות (<35 nt) בעת שימוש במערכת LC-MS סטנדרטית ברזולוציה גבוהה, וניתן להשתמש בהם גם לאימות רצף של אוליגונוקלאוטידים RNA טיפוליים ששונו. בעתיד, עם פיתוח אלגוריתמים חזקים יותר ועם מכשירים טובים יותר, שיטה זו תוכל לאפשר ריצוף של דגימות ביולוגיות מורכבות יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות ריצוף מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS), כולל MS מלמעלה למטה ו-MS טנדם 1,2,3,4, פותחו לריצוף ישיר של RNA. עם זאת, טכניקות פיצול באתרן לייצור יעיל של סולמות RNA באיכות גבוהה בספקטרומטרי מסה לא ניתן ליישם כיום על ריצוף דה נובו 5,6. יתר על כן, זה לא טריוויאלי במיוחד לנתח את נתוני הטרשת הנפוצה המסורתיים החד-ממדיים (1D) לריצוף דה נובו של אפילו רצף RNA מטוהר אחד, וזה יהיה מאתגר עוד יותר עבור ריצוף MS של דגימות RNA מעורבות 7,8. לכן, פותחה שיטת ריצוף RNA דו-ממדית (2D) מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS, המשלבת ייצור של סולמות זמן שימור מסה דו-ממדיים (tR) להחלפת סולמות מסה חד-ממדיים, מה שמקל בהרבה על זיהוי רכיבי הסולם הדרושים לריצוף דה נובו של RNAs8. עם זאת, שיטת ריצוף ה-RNA הדו-ממדית המבוססת על LC-MS מוגבלת בעיקר ל-RNA קצר סינתטי מטוהר, מכיוון שהיא אינה יכולה לקרוא רצף שלם המבוסס אך ורק על סולם אחד, אלא חייבת להסתמך על שני סולמות סמוכים הקיימים במקביל (סולמות 5'- ו-3')8. ליתר דיוק, גישה זו דורשת קריאות קצה זוגיות דו-כיווניות לקריאת נוקלאובסיסים סופיים באזור המסה הנמוכה8. המורכבות הנוספת של קריאת הקצה הזוגי מביאה לכך ששיטה זו אינה ניתנת לריצוף של תערובות RNA מכיוון שנוצר בלבול באיזה שבר סולם שייך לאיזה סולם עבור הדגימות הלא ידועות.

כדי להתגבר על המחסומים שהוזכרו לעיל בגישות ריצוף RNA מבוססות MS ולהרחיב יישומים כאלה בריצוף RNA ישיר, יש לטפל בשתי בעיות: 1) כיצד ליצור סולם מסה איכותי שניתן להשתמש בו לקריאת רצף שלם, מהנוקלאוטיד הראשון ועד האחרון בגדיל RNA, ו-2) כיצד לזהות ביעילות כל סולם RNA/מסה במערך נתונים מורכב של MS. יחד עם פירוק חומצה מבוקר היטב, פיתחנו שיטת ריצוף חדשה על ידי הכנסת אסטרטגיית תיוג קצה הידרופובי (HELS) לטכניקת הריצוף המבוססת על MS, וטיפלנו בהצלחה בשתי הבעיות הללו על ידי הוספת תג הידרופובי בקצה 5 ו/או 3 של ה-RNA לריצוף9. שיטה זו יוצרת סולם רצף "אידיאלי" מ-RNA - כל שבר סולם נובע מחשוף RNA ספציפי לאתר אך ורק בכל קשר פוספודיאסטר, והפרש המסה בין שני שברי סולם סמוכים הוא המסה המדויקת של שינוי הנוקלאוטיד או הנוקלאוטיד במיקום זה 8,9,10. זה אפשרי מכיוון שאנו כוללים שלב הידרוליזה חומצי מבוקר מאוד, המפרק את ה-RNA, בממוצע, פעם אחת לכל מולקולה, לפני שהוא מוזרק למכשיר. כתוצאה מכך, כל תוצר של שבר פירוק מזוהה בספקטרומטר המסה וכל השברים יחד יוצרים סולם ריצוף 8,9,10. אסטרטגיה חדשה זו מאפשרת קריאה מלאה של רצף RNA מסולם אחד בודד של גדיל RNA ללא קריאת קצה מזווג מהסולם השני של ה-RNA, ובנוסף מאפשרת ריצוף MS של תערובות RNA עם מספר גדילים שונים המכילים שינויים נוקלאוטידים קומבינטוריים9. על ידי הוספת תג בקצה ה-5 ו/או ה-3 של ה-RNA, שברי הסולם המסומנים מציגים עיכוב משמעותי של tR, מה שיכול לעזור להבחין בין שני סולמות המסה זה מזה וגם מהאזור הרועש בעל המסה הנמוכה. הסטת Mass-tR הנגרמת על ידי הוספת התג ההידרופובי מקלה על זיהוי סולם מסה ומפשטת את ניתוח הנתונים ליצירת רצף. יתר על כן, הוספת התג ההידרופובי יכולה לסייע בזיהוי הבסיס הסופי בגדיל על ידי מניעת שבר הסולם המתאים לולהיות באזור R הרועש בעל המסה הנמוכה-t עקב עליית המסה וההידרופוביות הנגרמת על ידי התג, ובכך לאפשר זיהוי של הרצף השלם של RNA מסולם יחיד; אין צורך בקריאות קצוות מזווגות. כתוצאה מכך, הדגמנו בעבר ריצוף מוצלח של תערובת מורכבת של עד 12 גדילים נפרדים של RNA ללא שימוש באלגוריתם ריצוף מתקדםכלשהו 9, מה שפותח את הדלת לריצוף דה נובו MS של RNA המכיל נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כאחד והופך אותו לאפשרי יותר לריצוף של דגימות RNA מעורבות ומורכבות יותר. למעשה, באמצעות 2D-HELS MS Seq, אפילו רצפנו בהצלחה אוכלוסייה מעורבת של דגימות tRNA10 ומרחיבים באופן פעיל את היישום שלה לדגימות RNA מורכבות אחרות.

כדי להקל על 2D-HELS MS Seq לרצף ישירות מגוון רחב יותר של דגימות RNA, כאן נתמקד בהיבטים הטכניים של גישת ריצוף זו ונסקור את כל השלבים החיוניים הדרושים בעת יישום הטכניקה לקראת ריצוף ישיר של דגימות RNA. דוגמאות ספציפיות ישמשו להמחשת טכניקת הריצוף, כולל רצפי RNA בודדים סינתטיים, תערובות של מספר רצפי RNA מובחנים ו-RNA מותאמים המכילים נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כגון פסאודורידינים (ψ) ו-5-מתילציטוזין (m5C). מכיוון שכל ה-RNA מכילים קשרי פוספודיאסטר, כל סוג של RNA יכול לעבור הידרוליזה בחומצה כדי ליצור סולם רצף אידיאלי עבור 2D-HELS MS Seq בתנאים אופטימליים 8,9. עם זאת, זיהוי כל שברי הסולם של RNA נתון תלוי במכשיר. ב-LC-MS סטנדרטי ברזולוציה גבוהה (40K), כמות הטעינה המינימלית לריצוף דגימת RNA קצרה מטוהרת (<35 nt) היא 100 pmol לריצה. עם זאת, נדרש חומר נוסף (עד 400 pmol לדגימת RNA) כאשר יש לבצע ניסויים נוספים (למשל, להבחין בין שינויים בבסיס איזומרי החולקים מסות זהות). הפרוטוקול המשמש לריצוף המודל של RNA סינתטי שונה יהיה ישים גם לריצוף דגימות RNA רחבות יותר, כולל דגימות RNA ביולוגיות עם שינויי בסיס לא ידועים. עם זאת, נדרשת כמות דגימה גדולה עוד יותר, כגון 1000 pmol לריצוף tRNA (~76 nt) באמצעות מכשיר LC-MS סטנדרטי, כדי לרצף את ה-tRNA השלם עם כל השינויים, ויש לפתח אלגוריתם מתקדם לריצוף דה נובו 10 שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון אוליגונוקלאוטידים של RNA

  1. תכנן אוליגונוקלאוטידים של RNA סינתטי באורכים שונים (19 nt, 20 nt ו-21 nt), כולל אחד (RNA #6) עם נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כאחד. ψ משמש כמודל לשינויים שאינם משני מסה, וזה מאתגר עבור ריצוף MS מכיוון שיש לו מסה זהה ל-U.m 5C נבחר כמודל לשינויים משני מסה כדי להדגים את החוסן של הגישה.

    RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
    RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
    RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
    RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUCUCUUUAU-OH-3'
    RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
    RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm5CUGAG-OH-3'
     
  2. ממיסים כל RNA סינתטי במים שטופלו בדיאתיל-פירוקרבונט (DEPC) נטולי נוקלאז (מבוטא כ-H2O שטופל ב-DEPC אלא אם צוין אחרת) כדי לקבל תמיסת מלאי RNA של 100 מ"מ. פתרונות מלאי מאוחסנים לטווח ארוך בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. כדי למנוע השפלה אפשרית של דגימת RNA, השתמש באספקה ניסיונית ללא RNase כולל מים שטופלו ב-DEPC, צינורות מיקרו-צנטריפוגה וקצות פיפטה. נגב לעתים קרובות משטחים של ציוד מעבדה באמצעות מגבונים לסילוק RNase.

2. סמן את 3'-קצה ה-RNA בביוטין

  1. פרוטוקול תגובה דו-שלבי (אדנילציה וקשירה)
    1. הוסף 1 מיקרוליטר של מאגר תגובת אדנילציה פי 10 המכיל 50 מ"מ נתרן אצטט, pH 6.0, 10 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ דיכלורודיפנילטריכלורואתאן (DTT), 0.1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 1 מיקרוליטר של 1 מ"מ ATP, 1 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר ציטידין ביספוספט ביוטיניל (pCp-ביוטין), 1 מיקרוליטר של 50 מיקרומטר Mth RNA ליגאז, ו-6 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC (נפח כולל של 10 מיקרוליטר) לתוך צינור PCR דק דופן ללא RNase של 0.2 מ"ל.
      הערה: אחסן את הריאגנטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני התגובה הדו-שלבית. מפשירים את הריאגנטים בטמפרטורת החדר ומערבבים היטב על ידי מערבולת וצנטריפוגה לפני הוספה לתגובה.
    2. דגרו את התגובה במכונת PCR בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת והשביתו את התגובה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. בצע את שלב הקשירה בצינור PCR נטול RNase, בעל דופן דקה של 0.2 מ"ל המכיל 10 מיקרוליטר של תמיסת תגובה מהשלב הקודם על ידי הוספת 3 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ligase המכיל 50 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן (Tris)-HCl, pH 7.8, 10 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ DTT, 1.5 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מ"מ של ה-RNA שיש לרצף, 3 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) כדי להגיע ל-10% (v/v), 1 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-11.5 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC (לנפח כולל של 30 מ"ל). דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
      הערה: שלב רכיבי תגובה בטמפרטורת החדר עקב נקודת הקיפאון הגבוהה של DMSO (18.45 מעלות צלזיוס).
    4. דגרו את התגובה למשך הלילה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.
    5. להרוות ולטהר את התגובה על ידי טיהור עמודות להסרת אנזימים ושחרור pCp-ביוטין באמצעות Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). מאגר קשירה של אוליגו, מאגר שטיפת DNA, עמודות ספין וצינורות איסוף מסופקים בערכה. הוסף 20 מ"ל של H2O שטופל ב-DEPC לתמיסת התגובה כדי להגיע לנפח דגימה של 50 מ"ל לפני הוספת מאגר הכריכה.
    6. הוסף 100 מ"ל של מאגר מחייב לכל תמיסת תגובה. מוסיפים 400 מיקרוליטר אתנול, מערבבים על ידי פיפטינג ומעבירים את התערובת לעמודה. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
    7. הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר שטיפת DNA לעמודה. צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם ומהירות מרבית למשך 30 שניות ודקה אחת, בהתאמה.
    8. העבירו את העמודה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 15 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC לעמודה ולצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 30 שניות כדי לסלק את תוצר ה-RNA.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשלב זה עד לביצוע השלב הבא.
  2. פרוטוקול תגובה חד-שלבי
    1. בצע תגובת תיוג בשלב אחד על ידי שילוב של 2 מיקרוליטר של 150 מיקרומטר אדנוזין-5'-5'-דיפוספט-{5'-(ציטידין-2'-O-מתיל-3'-פוספט-TEG}C-ביוטין (AppCp-biotin), 3 מיקרוליטר של מאגר תגובת ליגאז פי 10, 1.5 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מ"מ של ה-RNA לרצף, 3 מיקרוליטר של DMSO נטול מים כדי להגיע ל-10% (v/v), 1 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-19.5 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC (לנפח כולל של 30 מ"ל) בצינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל.
    2. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
    3. בצע טיהור עמודות כמתואר לעיל בשלבים 2.1.5-2.1.8.
      הערה: הכן צינור תגובה נפרד/בלעדי לכל דגימת RNA (סולם 150 pmol של RNA). ייתכן שיהיה צורך בתיוג של קצה 5' של ה-RNA(ים) עם סולפו-ציאנין3 (Cy3) או Cy3 (למשל, לאימות ריצוף דו-כיווני). השיטה שונה מזו של 3'-biotinylation ומתוארת בפרסום קודם9.

3. ללכוד דגימת RNA ביוטינילית על חרוזי סטרפטווידין

  1. הפעל 200 מיקרוליטר של חרוזי מגנט סטרפטווידין C1 על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר B&W 1x (5 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 מ"מ EDTA, 1 M NaCl) בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase של 1.5 מ"ל. מערבל את התמיסה הזו והנח אותה על מעמד מגנט למשך 2 דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט על ידי הוצאת התמיסה בזהירות.
  2. שטפו את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של תמיסה A (0.1 M NaOH שטופל ב-DEPC ו-0.05 M NaCl שטופל ב-DEPC) ופעם אחת ב-200 מיקרוליטר של תמיסה B (0.1 M NaCl שטופל ב-DEPC). עבור כל שלב כביסה, מערבל את התמיסה והניח אותה על מעמד מגנט למשך 2 דקות, ולאחר מכן השלכת הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של 2x מאגר שחור-לבן (10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 1 מ"מ EDTA, 2 מ"מ NaCl).
  3. הוסף מאגר שחור-לבן אחד לדגימת ה-RNA הביוטיניל עד לנפח 100 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף תמיסה זו לחרוזים השטופים המאוחסנים ב-100 מיקרוליטר של מאגר שחור-לבן פי 2. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר פלטפורמת נדנדה ב-100 סל"ד. הנח את הצינור על מעמד מגנט למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט.
  4. שטפו את החרוזים המצופים 3 פעמים במאגר שחור-לבן 1x ומדדו את הריכוז הסופי של סופרנטנט בכל שלב שטיפה על ידי Nanodrop לניתוח התאוששות, כדי לוודא שמולקולות ה-RNA המטרה נשארות על החרוזים.
  5. דגרו את החרוזים ב-10 מ"מ EDTA, pH 8.2 עם 95% פורממיד ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות במכונת PCR. שמור את הצינור על מעמד המגנט למשך 2 דקות ואסוף את הסופרנטנט (המכיל את ה-RNA הביוטיני המשתחרר מחרוזי הסטרפטווידין) על ידי פיפט.
    הערה: שלב הפרדה פיזי זה לפני פירוק חומצה משמש רק לריצוף של RNA#1 באיור 1c, ואינו חובה עבור 2D-HELS MS Seq מכיוון שתווית הביוטין ההידרופובית עלולה לגרום לשברי הסולם המסומנים ב-3' להיות בעלי tR מאוחר משמעותית במהלך מדידת LC-MS, מה שיכול להבחין בבירור בין שברי סולם 3' המסומנים לבין שברי סולם 5' הלא מסומנים בתרשים 2D mass-tR .

4. הידרוליזה חומצית של RNA ליצירת סולמות טרשת נפוצה לריצוף

  1. חלקו כל דגימת RNA לשלוש נקודות שוות. לדוגמה, חלקו דגימת RNA בנפח של 15 מיקרוליטר דגימת RNA לשלוש נקודות של 5 מיקרוליטר.
  2. הוסף נפח שווה של חומצה פורמית כדי להשיג 50% (v/v) חומצה פורמית בתערובת התגובה 8,9.
  3. דגרו את התגובה ב-40 מעלות צלזיוס במכונת PCR, כאשר תגובה אחת פועלת במשך 2 דקות, אחת למשך 5 דקות ואחת למשך 15 דקות, בהתאמה.
  4. להרוות את פירוק החומצה על ידי הקפאה מיידית של הדגימה על קרח יבש לאחר סיום כל תגובה.
  5. השתמש ברכז ואקום צנטריפוגלי כדי לייבש את הדגימה. הדגימה מיובשת לחלוטין בדרך כלל תוך 30 דקות, וחומצה פורמית מוסרת יחד עם H2O במהלך תהליך הייבוש מכיוון שלחומצה פורמית יש נקודת רתיחה (100.8 מעלות צלזיוס) הדומה לזו של H2O (100 מעלות צלזיוס).
  6. השעו ושלבו בסך הכל שלוש דגימות מיובשות ב-20 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC למדידת LC-MS.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשלב זה בזמן ההמתנה למדידת LC-MS.

5. המרת ψ לחיבור CMC-ψ

  1. הוסף 80 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל המכיל 0.0141 גרם של N-cyclohexyl-Nʹ-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (CMC) ו-0.07 גרם אוריאה. הוסף 10 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מיקרומטר של ה-RNA לרצף, 8 מיקרוליטר של מאגר ביצין 1 M (pH 8.3) ו-1.28 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA. הוסף H2O שטופל ב-DEPC כדי להגיע לנפח כולל של 160 μL. הריכוזים הסופיים הם 0.17 M CMC, 7 M אוריאה ו-4 mM EDTA ב-50 מ"מ bicine (pH 8.3)11.
    הערה: פרוטוקול זה חל על רצף RNA סינתטי יחיד או על תערובות RNA.
  2. חלקו את תמיסת התגובה של 160 מיקרוליטר לארבע נקודות שוות בצינורות PCR נטולי RNase עם קירות דקים של 0.2 מ"ל ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במכונת PCR.
    הערה: 50 מיקרוליטר לצינור הוא נפח התגובה המרבי שניתן להשתמש בו במכונת PCR.
  3. הרוו כל תגובה עם 10 מיקרוליטר של 1.5 M נתרן אצטט ו-0.5 מ"מ EDTA (pH 5.6).
  4. בצע טיהור עמודות עם ארבע עמודות ספין מקבילות כדי להסיר מגיבים מוגזמים בהתאם לנוהל כמתואר בשלבים 2.1.5-2.1.8. ממיסים את המוצר המטוהר ב-15 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC בכל צינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל.
  5. העבירו את המוצר המטוהר לארבעה צינורות PCR נטולי RNase ובעלי קירות דקים של 0.2 מ"ל. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר 0.1 M Na2CO3 (pH 10.4) לכל 15 מיקרוליטר של מוצר מטוהר והוסף H2O שטופל ב-DEPC כדי ליצור נפח סופי של 40 מיקרוליטר לכל צינור תגובה (בסך הכל ארבעה צינורות). דגרו את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים במכונת PCR.
  6. להרוות ולטהר את התגובה על ידי טיהור עמודות עם ארבע עמודות ספין מקבילות כמתואר בשלב 2.1.5. הוצא את המוצר המומר ψ CMC לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נטולת RNase בנפח 1.5 מ"ל כל אחת עם 15 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC.
  7. שלב את הדגימה המטוהרת של CMC-ψ מארבעה צינורות איסוף לצינור אחד. בצע פירוק חומצה פורמית ב-50% (v/v) על פי הנהלים המתוארים בשלבים 4.1-4.6 ליצירת סולמות טרשת נפוצה לריצוף.

6. מדידת LC-MS

  1. הכן שלבים ניידים למדידת LC-MS. שלב נייד A הוא 25 מ"מ hexafluoro-2-propanol עם 10 מ"מ דיאיזופרופילאמין במים בדרגת LC-MS; שלב B נייד הוא מתנול.
  2. העבר את הדגימה לבקבוקון דגימת LC-MS לניתוח. כל נפח הזרקת דגימה הוא 20 מיקרוליטר המכיל 100-400 pmol של RNA.
  3. השתמש בתנאי ה-LC הבאים: טמפרטורת עמודה של 35 מעלות צלזיוס, קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה; שיפוע ליניארי מ-2-20% שלב B נייד במשך 15 דקות ואחריו שלב כביסה של 2 דקות עם 90% שלב B נייד.
    הערה: עבור תוויות קצה הידרופוביות יותר כגון Cy3 ו-sulfo-Cy3 כפי שהוזכר בסעיף 2, ייתכן שיהיה צורך באחוז גבוה יותר של ממס אורגני לפליטת דגימה (כלומר, ניתן להשתמש בשיפוע דומה אך עם טווח אחוזים מוגבר של שלב B נייד). לדוגמה, 2-38% שלב B נייד במשך 30 דקות עם שלב כביסה של 2 דקות עם 90% שלב B נייד.
  4. הפרד ונתח דגימות בספקטרומטר מסה Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) יחד עם מערכת LC המצוידת בדגימה אוטומטית ומערכת MS HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים). עמודת LC היא עמודת C18 בגודל 50 מ"מ x 2.1 מ"מ עם גודל חלקיקים של 1.7 מיקרומטר. השתמש בהגדרות MS הבאות: מצב יונים שליליים; טווח, 350 m/z עד 3200 m/z; קצב סריקה, 2 ספקטרים לשנייה; זרימת גז ייבוש, 17 ליטר לדקה; טמפרטורת גז ייבוש, 250 מעלות צלזיוס; לחץ נבולייזר, 30 psig; מתח נימי, 3500 וולט; ומתח פרצנטור, 365 וולט. שימו לב שפרמטרים אלה ספציפיים לסוג או לדגם של ספקטרומטר המסה בו נעשה שימוש.
  5. רכוש נתונים באמצעות תוכנת הרכישה Agilent MassHunter. השתמש בזרימת עבודה של חילוץ תכונות מולקולאריות זריזות (MFE) כדי לחלץ מידע מורכב כולל מסה, זמן שמירה, נפח (שפע MFE עבור מיני היונים המתאימים) וציון איכות וכו'. השתמש בהגדרות MFE הבאות: "פורמט נתונים מרכזי, מולקולות קטנות (כרומטוגרפיות), שיא בגובה ≥ 100, עד מקסימום 1000, ציון איכות ≥ 50".
    הערה: מטב את הגדרות MFE כדי לחלץ תרכובות פוטנציאליות רבות ככל האפשר, עד 1000 לכל היותר, עם ציוני איכות של ≥ 50.

7. אוטומציה של יצירת רצף RNA על ידי אלגוריתם חישובי

הערה: הליך זה מוצג רק עבור RNA #1 באיור 1c.

  1. מיין תרכובות שחולצו MFE לפי סדר ירידה בנפח (עוצמת שיא)ו-tR. בצע בחירה מוקדמת של נתונים באמצעות 1) הגדרת tR בין 4 ל-10 דקות כדי לבחור את שברי ה-RNA המסומנים על ידי הביוטין, מכיוון שה-tRשל רכיבי סולם המסה המסומנים בביוטין מועברים לחלון tR זה (4 דקות עד 10 דקות), ו-2) תוך שימוש בסדר גודל גבוה יותר של תרכובות קלט ממספר שברי הסולם לחישוב אלגוריתם כדי להפחית את כמות הנתונים על סמך נפח. לדוגמה, עבור 20 nt RNA, 20 רכיבי סולם mass-tR מסומנים יידרשו לריצוף של 20 nt RNA, וכך, 200 תרכובות מקובץ הנתונים MFE ייבחרו על סמך נפח. שימו לב שחלון tR עשוי להיות שונה כאשר נעשה שימוש בסוג או דגם אחר של ספקטרומטר מסה.
  2. בצע עיבוד נתונים ויצירת רצף של RNA #1 באמצעות גרסה מתוקנת של אלגוריתם שפורסם8. קודי המקור של האלגוריתם המתוקן תוארו קודם לכן (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)9.
  3. בנוסף לאוטומציה של יצירת רצף באמצעות האלגוריתם, חשב ידנית את הפרשי המסה בין שני רכיבי סולם סמוכים לקריאת בסיס. ניתן לקרוא לכל הבסיסים ב-RNA באופן ידני ולהתאים אותם לבסיסים התיאורטיים במסד הנתונים של נוקלאוטידים ושינוי RNA8; לפיכך, ניתן לקרוא במדויק את הרצף המלא של גדיל ה-RNA באופן ידני, המשמש לאישור הדיוק של קריאת הרצף המדווח על ידי האלגוריתם. מבנים נוספים של שינויים ב-RNA ניתן למצוא במאגרי שינוי RNA12, והמסות התיאורטיות המתאימות להם מתקבלות על ידי ChemBioDraw. בטבלאות S1-S2, הפרש המסה של ppm (חלקים למיליון) מוצג כאשר משווים את המסה הנצפית למסה התיאורטית שלה עבור רכיב סולם ספציפי, וערך קטן מ-10 ppm נחשב להתאמה טובה עבור כל קריאת בסיס.

8. רצף תערובות RNA

  1. סמנו תערובת של חמישה גדילי RNA (RNA #1 עד #5) ב-3'-00 שלהם עם A(5')pp(5')Cp-TEG-biotin באמצעות פרוטוקול חד-שלבי המתואר בשלב 2.2. בנפח כולל של תמיסת תגובה של 150 מיקרוליטר, הוסף 15 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ליגאז, 1.5 מיקרוליטר מכל גדיל RNA (מלאי 100 מיקרומטר של RNA #1 עד #5, בהתאמה, לנפח כולל של 7.5 מיקרוליטר), 10 מיקרוליטר של 150 מיקרומטר A(5')pp(5')Cp-TEG-ביוטין, 15 מיקרוליטר של DMSO נטול מים, 5 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-97.5 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC. מחלקים באופן שווה את תמיסת התגובה לחמש אליקוטות. כל צינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase מכיל 30 מיקרוליטר של תמיסת תגובה.
  2. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
  3. בצע טיהור עמודות על פי הנוהל כמתואר בשלבים 2.1.5-2.1.8 עם חמש עמודות ספין מקבילות. יש להוציא דגימת תערובת של 5 גדילי RNA 3'-biotinylated (תערובת של RNA #1 עד #5) לצינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל כל אחד עם 15 מיקרוליטר של H2O שטופל ב-DEPC.
  4. שלב את דגימות התערובת המטוהרות מחמשת צינורות האיסוף לצינור אחד. בצע פירוק חומצה פורמית על פי ההליך המתואר בסעיף 4.
  5. מדוד דגימות לפי LC-MS כמתואר בסעיף 6, ונתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים עם הגדרות MFE ממוטבות כדי לחלץ נתונים המכילים מסה, tR ונפח כמתואר בשלב 6.5. אלגוריתם העיבוד וקריאת הבסיס הטיפוסי אינו מיושם בשל מורכבות הנתונים המוגברת משמעותית הנובעת מהתערובת. כל הבסיסים ב-RNA של הדגימה המעורבת נקראים ידנית בשיטה הדומה לסעיף 7.3 ותואמים היטב את הבסיסים התיאורטיים במסד הנתונים של נוקלאוטידים ושינויים של RNA8, וכך הרצפים המלאים של כל חמשת גדילי ה-RNA בדגימה המעורבת נקראים במדויק. בטבלאות S7-S11, כל המידע מפורט כולל מסה נצפית, tR, נפח, ציון איכות והפרש מסה ppm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצגת תג ביוטין לקצה ה-3 של ה-RNA כדי לייצר סולמות Mass-tR הניתנים לזיהוי בקלות. זרימת העבודה של גישת 2D-HELS MS Seq מודגמת באיור 1a. תווית הביוטין ההידרופובית שהוצגה לקצה ה-3 של ה-RNA (ראה סעיף 2) מגדילה את המסותוה-tR של רכיבי הסולם המסומנים ב-3' בהשוואה לאלו של עמיתיהם הלא מסומנים. לפיכך, עקומת הסולם 3' מוסטת לערכי ציר y גדולים יותר (עקב הגידול ב-tRs) ומועברת לערכי ציר x גדולים יותר (עקב הגידול במסות) בתרשים המסה הדו-ממדית שלT . <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניגוד לפיצול MS מבוסס טנדם, הידרוליזה חומצית מבוקרת מאוד משמשת בגישת 2D-HELS MS Seq כדי לפצל את ה-RNA לפני הניתוח עם ספקטרומטר מסה 9,10. כתוצאה מכך, ניתן לזהות כל שבר מושפל בחומצה על ידי המכשיר, ויוצר את המקבילה לסולם ריצוף. בתנאים אופטימליים, שיטה זו יוצרת סולם רצף "אידיאלי" מ-RNA דרך, בממוצע, מחשוף RNA ספציפי לאתר אחד לכל מולקולה אך ורק בקשר פוספודיאסטר 8,9,10...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הגישו פטנט זמני הקשור לטכנולוגיה הנדונה בכתב יד זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למענק R21 מהמכונים הלאומיים לבריאות (1R21HG009576) ל-S.Z. ו-W.L. ומענקי התמיכה המוסדית למחקר ויצירתיות של המכון הטכנולוגי של ניו יורק (NYIT) ל-S.Z., שתמך בעבודה זו. המחברים רוצים להודות לדוקטורנט Xuanting Wang (אוניברסיטת קולומביה) על הסיוע ביצירת דמויות, ולפרופ' Michael Hadjiargyrou (NYIT), לפרופ' Jingyue Ju (אוניברסיטת קולומביה), לד"ר ג'יימס רוסו, שיב קומאר, Xiaoxu Li, Steffen Jockusch, ולחברים אחרים במעבדת Ju (אוניברסיטת קולומביה), לד"ר Yongdong Wang (Cerno Bioscience), Meina Aziz (NYIT) ול-Wenhao Ni (NYIT) על דיונים מועילים והצעות לכתב היד שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת 5 'DNA Adenylationאינגלנד BiolabsE2610S50uM ריכוז
6550 Q-TOF ספקטרומטר מסהAgilent Technologies5991-2116ENבשילוב עם מערכת 1290 Infinity LC
A(5´)pp(5&אקוטי;)Cp-TEG-ביוטין-3&&חריף;ChemGenes91718HPLC מטוהר
ATPγ SSigma-Aldrich11162306001מלח ליתיום
BicineSigma-AldrichB8660BioXtra, ≥ 99% (טיטרציה)
ביוטין מלימידמעבדות וקטורSP-1501זרוע ארוכה
C18 עמודמים18600353250 מ"מ ופעמים; 2.1 מ"מ עמוד Xbridge C18 עם גודל חלקיקים של 1.7 μ m
רכז ואקום צנטריפוגליLabconcoRefrig 115v/60hz 7310022Labconco CentriVap
ChemBioDrawPerkinElmerChemDraw Primeצור מבנה כימי ונתוני מאפיינים של מבנים ושברים
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)Sigma-Aldrich2491-17-095% טיהור
Cyanine3 maleimide (Cy3)Lumiprobe11080בלתי מסיסים במים
שטופלו ב-DEPCThermo Fisher ScientificAM9906
דיאיזופרופילאמין (DIPA)Thermo Fisher Scientific108-18-999% Alfa Aesar
DMSOSigma-Aldrich276855דימתיל סולפוקסיד נטול מים, 99.9%
EDTASigma-AldrichE6758נטול מים, גבישי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
חומצה פורמיתMerck64-18-698-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Fisher Scientific920-66-199% Acros Organics
LC-MS בקבוקוני דגימהThermo Fisher ScientificC4000-11בקבוקוני הברגה מפלסטיק
LC-MS מכסי בקבוקוןThermo Fisher ScientificC5000-54Aמכסי בורג בקבוקון דגימה אוטומטית
Na2CO3 מאגרSigma-Aldrich88975BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & רכזZymo ResearchD4060עמודת ספין
OriginLabOriginLabOriginProתוכנת ניתוח נתונים וגרפים
pCp-biotinTriLink BioTechnologiesNU-1706-BIO20 ul (1 mM)
RNA #1--#6טכנולוגיות DNAמשולבות RNA אוליגוס מותאם אישית19nt-21nt RNA חד-גדילי, בשימוש ללא טיהור נוסף
נדנדה שייקר פלטפורמהVWRשייקר אורביטלי סטנדרטי 1000טווח מהירות 40 עד 300 סל"ד
סטרפטווידין חרוזים מגנטייםתרמו פישר מדעי88816מחייב כ. 55ug ארנב ביוטיניל lgG לכל מ"ג חרוזים
ציאנין סולפונטי 3 maleimideLumiprobe11380מסיס במים
T4 DNA ligase 1ניו אינגלנד BiolabsM0202S400 יחידות/uL
T4 פולינוקלאוטיד קינאזסיגמא-אולדריץ'T4PNK-ROמפאג T4 am N81 pse T1 נגוע Escherichia coli BB
Tris-HCl מאגרSigma-AldrichT6455Tris-HCl Buffer, pH 10, 10&, אנטיגן רטריבר
אוריאהסיגמא-אולדריץ'81871אוריאה לסינתזה. CAS מס' 57-13-6, מספר EC 200-315-5.
ניו מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).
  2. Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).
  3. McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).
  4. Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).
  5. Taucher, M., Breuker, K. Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).
  6. Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. Detection of RNA modifications. RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).
  7. Thomas, B., Akoulitchev, A. V. Mass spectrometry of RNA. Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).
  8. Bjorkbom, A., et al. Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms. Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).
  9. Zhang, N., et al. A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures. Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).
  10. Zhang, N., et al. Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications. ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).
  11. Bakin, A., Ofengand, J. Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique. Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).
  12. Cantara, W. A., et al. The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNALC MSRNARNA5

מאמרים קשורים