הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61282

⸱

9 בספטמבר 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

תקציר

אפנון אופטוגנטי של תת-אוכלוסיות נוירונים במוח אפשר לחוקרים לנתח מעגלים עצביים ב- vivo ו- ex vivo. זה מספק הנחת יסוד לקביעת התפקיד של סוגי נוירונים בתוך מעגל עצבי, ואת המשמעות שלהם בקידוד מידע ביחס ללמידה. כמו כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבדוק את המשמעות הפיזיולוגית של שני אזורי מוח מחוברים או יותר בבעלי חיים ערים ומורדמים. המחקר הנוכחי מדגים כיצד נוירונים גלוטמט VTA לווסת את קצב הירי של נוירונים פירמידליים putative ב CA1 (היפוקמפוס) של עכברים מרדימים. פרוטוקול זה משתמש וירוס הקשורים אדנו (AAV) תיוג תלוי של נוירונים גלוטמט VTA להתחקות אחר מסופי גלוטמט פרסינפטי VTA בשכבות של ההיפוקמפוס. ביטוי של אופסין מבוקר אור (channelrhodopsin; hChR2) וחלבון פלואורסצנטי (eYFP) המוחזק על ידי וקטור AAV מותר מעקב אנטרוגרד של מסופי גלוטמט VTA, ו photostimulation של גופי תאי נוירון גלוטמט VTA (ב- VTA). אלקטרודות סיליקון חריפות בעלותעכבה גבוהה הוצבו ב- CA1 כדי לזהות תגובות מרובות יחידות ויחידה אחת לתמונות VTA ב- vivo. תוצאות מחקר זה ממחישות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי גלוטמט VTA פרזינפטיים בהיפוקמפוס (CA1, CA3 ו- DG). כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA הגדיל את שיעור הירי ואת קצב פרץ של יחידות פירמידליות CA1 putative ב vivo.

מבוא

בעשור האחרון פותח מערך של כלים גנטיים כדי להגדיל את הספציפיות של אפנון מסוג נוירון, ואת המיפוי של רשתות עצביות מורכבות1. ראוי לציין, וירוסים נוירוטרופיים עם יכולת אינהרנטית להדביק ולשכפל בתאים עצביים נפרסו כדי לבטא או לנפח חלבונים ספציפיים בסוגי נוירון. כאשר מחסה חלבונים פלואורסצנטיים או אינדיקטורים פעילות סינפטית מקודדים גנטית, וקטורים AAV transfected תווית ומתווה רשתות עצביות על פני אזורי המוח2,3. הבחירה של מקדם במבנה AAV מכוונת את הביטוי של הווקטור בסוגי נוירונים עם רמה מסוימת של ספציפיות ( ביטויתלוי מקדם). עם זאת, באמצעות רקומבינציה Cre-lox, מבני AAV פרוסים עם ספציפיות רבה יותר עבור תיוג נוירון4,5,6,7. ראוי לציין, opsins מיקרוביאלי photoactivated וחלבוני פלואורסצנטיות ארוזים בווקטורים AAV יכולים לבוא לידי ביטוי בתת-סוגים שונים של נוירונים8, והם אידיאליים להדמיה, מעקב מעגלים מסוג נוירון, ו photomodulation9,10.

AAVs בונה סטריאוטקטי מוזרק לתוך אזור המוח (או גרעין) מניע את הביטוי של חלבון הכתב במסופי סומה, דנדריט ואקסונים. ביטוי עצבי של AAV מחסה גן כתב (eYFP) מקל על תיוג של גופי תאי נוירון ומעקב אנטומי של תחזיות אל ומכל אזורי מוח אחרים11,12,13,14. מבנים AAV-eYFP הנושאים אופסין מבוקר אור (למשל, hChR2), ניתן לפרוס ככלי להדמיה6,15 ומעקב פיזיולוגי מבוסס גירוי של תחזיות עצביות כדי למקד אזורי המוח ב vivo16. בהתאם לסרוטיפ AAV, הכיוון של תיוג נוירונים עשוי להיות anterograde או מדרדר11,12. מחקרים קודמים קבעו כי AAV5 נוסע אנטרוגרדית בנוירונים12. לכן, פוטוסטימולציה של גופים סלולריים המבטאים hChR2 מייצרת השפעות presynaptic במקומות אחרים במוח (יעד)17.

כאן, AAV (סרוטיפ 5) עם מקדם CaMKIIα שימש לבטא eYFP (כתב) ו hChR2 (אופסין) ב VTA גלוטמט נוירונים ותחזיות אקסונליות. תוצאות מחקר זה מדגימות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי קדם-גלוטמט VTA באזורי ההיפוקמפוס CA1, CA3 ו- DG. כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA גדל CA1 רב יחידות וחד יחידות ירי שיעורי ירי ב vivo בהשוואה לערכים בסיסיים. פרוטוקול זה משתמש בכלים סבירים ובתוכנות זמינות מסחרית שיכולות להגביר את איכות הנתונים המתקבלים מניסויי מעקב מעגלים עצביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של בית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת לואיזיאנה.

1. חיה ניסיונית

  1. יש להשתמש בעכברים בני 5-6 שבועות.
  2. בית 3-5 בעלי חיים לכלוב בתנאים סטנדרטיים של 12 שעות לסירוגין אור ומעגל כהה. יש לספק מזון ומים עד ליביטום.

2. גולגולת והכנת בעלי חיים

הערה: סעיף זה מתאר הליכים טרום ופרי-אופרטיביים עבור גולגולת עכבר. השתמש במנגנון סטראוטקטי סטנדרטי וקואורדינטות מתאימות (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML, ו Dorsoventral: DV). עיין אטלס מוח עכבר כדי לקבוע את הקואורדינטות עבור אזור המוח של עניין.

  1. עכברים מרדים על ידי קטמין intraperitoneal (100 מ"ג/ק"ג)/קסילאצין (10 מ"ג/ק"ג) הזרקת קוקטייל. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי להבטיח את היעדר התחושה לפני תחילת הניתוח.
    הערה: לחלופין, הרדמה Isoflurane עם תא האף המתאים יכול לשמש גם עבור צעד זה.
  2. תקן בעדינות את ראש החיה במנגנון הסטריאוטקסי.
    הערה: חשוב לטפל בבעלי חיים בזהירות במהלך תהליך זה. כמו כן, בדוק את קצב הנשימה ואת האיברים החיוניים האחרים לפני שתמשיך בניתוח. אפשר לחיה לנוח כ -7 דקות כדי להפחית את הלחץ.
    1. מניחים כרית חימום על המסגרת הסטריאוטקסית כך שגופו של החיה שוכב עליה. זה יעזור לשמור על טמפרטורת הגוף ולשמור על החיה חמה אם כי את ההליך. שמור על כרית החימום לטיפול לאחר הניתוח והתאוששות.
  3. השתמש קוצץ כדי להסיר את השיער על הקרקפת ולנקות את העור עם תמיסה יוד.
    1. יש למרוח לידוקאין אקטואלי כדי לחסום תחושה על הקרקפת.
    2. השתמש באזמל כדי לבצע הפחתת קרקפת בקו האמצע המשתרעת מהחזית לאזור העורף.
    3. לנקות את אזור ההסתה עם פתרון יוד, ולאחר מכן לחשוף את calvaria.
      הערה: כמות קטנה של 3% תמיסת מי חמצן ניתן להחיל כדי להסיר periosteum מן calvaria. זה יגדיל את הנראות של ציוני דרך (ברגמה ומבדה) ותפרים.
    4. באמצעות אטלס סטריאוטקטי במוח העכבר, קבעו קואורדינטות AP ו- ML ביחס לברגמה.
    5. להזרקת VTA, מקם מזרק מחט אולטרה-דק במיוחד (למשל, מזרק נוירוס) בקואורדינטות AP: -3.08 מ"מ /ML: 0.5 מ"מ ביחס לברזמה.
    6. השתמש בכלי קידוח כדי לבלום חור של 1 מ"מ (גולגולת) בגולגולת בקואורדינטת AP/ML המסומנת.
      הערה: שלב זה דורש רמה משמעותית של זהירות. לחץ מינימלי צריך להיות מופעל בעת הקידוח כדי למנוע את המקדחה מרסק את רקמת המוח. במחקר הנוכחי, המקדחה הייתה 0.8 מ"מ ומהירות הקידוח נקבעה ל-15,000 סל"ד.
      אזהרה: אם מי חמצן שימש לניקוי החתירה או calvaria, להבטיח הסרה מוחלטת של הפתרון או לאפשר יובש מלא לפני הקידוח.

3. הזרקת קוקטייל AAV

הערה: סעיף זה מתאר את התהליך עבור הזרקת AAV לתוך VTA של עכברי C57BL/6 מבוגרים (23-27 גרם). השיטה המתוארת יכולה לשמש להזרקת AAV לכל אזור במוח באמצעות מנגנון סטריאוטקטי סטנדרטי וקואורדינטות מתאימות. כדי להדגים פרוטוקול זה, eYFP ו- hChR2 באו לידי ביטוי בתאי עצב גלוטמט VTA באמצעות טרנספקטו בתיווך AAV5 תחת מקדם CaMKIIα (איור 1). רקומבינציה Cre-lox יכול לשמש גם עבור שלב זה.

  1. הר מזרק עם מחט אולטרה-דק (32 G; קיבולת 5 μL עם דיוק של 100 nL) על מזרק. תקן את מחזיק המזרק על מיקרו-מניפולטור.
    הערה: עבור הליך זה, נעשה שימוש במחזיק מזרק ידני, עם כיול 1.6 nL. מזרק אוטומטי יכול לשמש גם.
  2. ממלאים את המזרק במים מזוקקים כפולים לניקוי ובדיקת זרימת הנוזלים.
  3. הפשרת עליקוטים של קוקטייל AAV (סרוטיפ 5) על קרח. AAVs מאוחסנים בצורה הטובה ביותר ב -80 °C (80 °F) כדי לשמור על טיטר ויראלי לביטוי טוב.
  4. מלאו את המזרק הרכוב ב-1,000 nL של תמיסת AAV (10 מ"מ בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS), pH 7.4). מחלק 10 nL של פתרון AAV כדי לאשר את זרימת הנוזל לפני הורדת המחט לתוך אתר הזרקה.
  5. השתמש micromanipulator כדי להוריד את המחט סטריאוטקטי לתוך העומק הרצוי (קואורדינטות DV). לאחר הורדת המחט לעומק הרצוי, לאפשר למזרק להישאר במקום במשך 10 דקות לפני ההזרקה.
    הערה: עבור הליך זה, המחט הורדה לתוך VTA בעומק (DV) של 4.5 מ"מ מפני השטח pial של המוח. עבור אזורים אחרים במוח, השתמש בקואורדינטות דורסוונטל המתאימות (עיין אטלס מוח העכבר).
  6. הזרק 600-800 nL של AAV לתוך VTA. ניתן לכוונן את עוצמת ההזרקה בהתאם לגודל אתר היעד.
    1. ספק את פתרון AAV בקצב של 60 nL / min (מרווח של 3 דקות).
    2. כדי לבטא eYFP ו- hChR2 בנוירונים והקרנות גלוטמט VTA, הזרק AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      הערה: שיטת רקומבינציה Cre-lox ניתן להשתמש גם בהתאם למטרה של הניסוי.
    3. אפשר המחט להישאר במקום במשך 15 דקות לאחר הזרקת AAV. זה יפחית דיפוזיה וזרימה אחורית.
  7. משוך את מחט המזרק, ולאחר מכן לתבל את החתירה כדי לסגור את הפצע.
  8. מתן אנטיביוטיקה ומנטל שך כחלק מטיפול לאחר הניתוח. הנח את העכבר על פלטפורמות מרופדות חמות ונטר את החיה עד להתעוררות.
    הערה: לאחר 3 שבועות של הזרקה, ביטוי AAV ניתן לראות על ידי זיהוי פלואורסצנטיות של חלבון כתב (eYFP) בחלקי מוח העכבר. כמו כן, ניתן לבצע ניסויי פוטוטימולציה לאחר 3 שבועות(איור 2).

4. הגדירו להקלטות עצביות ב-vivo עם אופטוגנטיקה

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים להקלטה עצבית חריפה עם מעקב אופטוגנטי של מעגל המוח (הקרנת נוירון גלוטמט VTA ל- CA1). במידת הצורך, בדוק את המערכת (מגבר וחיבורים) לבעיות רעש חשמליות והארקה לפני תחילת שלב זה. ביצוע שלב זה בכלוב פאראדיי יכול לעזור לחסל רעש חשמלי בהקלטה.

  1. ב 3 שבועות לאחר הזרקת AAV, עכברים המרדים על ידי הזרקת אורתן תוך-איפריטוניאלי (0.2 מ"ג/ק"ג).
    זהירות: אורתאן הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות בעת לבישת ציוד מגן. כמו כן, מתן הרדמה אורתן בריכוז זה הוא לא הישרדות.
  2. הדביק את ראש החיה על מסגרת סטריאו-אטקטית כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2, איור 3A). בצעו גולגולת כדי לחשוף את הדורה (איור 3A). השתמש בכלי קידוח (גודל סיבית: 0.8 מ"מ, מהירות: 15,000 סל"ד) כדי להסיר חלק מהעצם הקודקודית.
    1. גולגולת צריך להיות על 3 מ"מ x 4mm רוחב. יש למרוח טיפות של נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) על אזור זה כדי למנוע יובש.
  3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה (דיגיטלי), השתמש בקצה מחט מכופף (27 G) כדי לבלום את הדורה החשופה. היזהר לא לפרק את כיסוי pial עדין ורקמות קליפת המוח באזור זה.
  4. נשא חור בעצם העורפית (גודל סיבית: 0.8 מ"מ, מהירות: 10,000 סל"ד) כדי להחזיק את בורג הקרקע (בורג פיליפס ראש פאן; M0.6 x 2.0 מ"מ).
  5. חבר חוט קרקע מפלדת אל-חלד.
    הערה: ניתן להשתמש גם בסוגים אחרים של חוטים (איור 3b).
  6. לשילוב פוטוטימולציה (VTA) והקלטה עצבית (CA1), השתמש במנגנון סטריאוטקסי מרובה מסילות המצויד במיקרו-מניפולטורים עדינים במיוחד (10 מיקרומטר או 1 מיקרומטר). הר את הסיב האופטי ואת הבדיקה העצבית הקלטה על 10 מיקרומטר טווח ו 1 מיקרו-מ"מ טווח מיקרו,בהתאמה.
    1. במידת הצורך, השתמש במתאם שלב-בדיקה ראשי(איור 3c).
      הערה: בפרוטוקול הנוכחי, שלב ראש בן 32 ערוצים צויד במתאם כדי להחזיק אלקטרודה הקלטה בת 4ערוצים (איור 3d). חוט הקרקע נירוסטה הולחם ליציאת חיבור הקרקע של המתאם.
  7. בקואורדינטות AP: -3.08 מ"מ ML: 0.5 מ"מ, להוריד את סיב אופטי בקוטר 400 מיקרומטר לתוך VTA.
    1. לפני הורדת הסיב האופטי, חבר את הפרולה לכבל סיבים אופטיים (עם נירוסטה או פרולה קרמית) המקושר למקור LED מצמיד סיבים.
      הערה: ודא שעוצמת האור והמיקוד מוגדרים לפי הרצון. הבחירה של מקור אור ה-LED צריכה להתאים לאופינים שמכוונים למטרה. כאן, מנהל התקן LED של 470 ננומטר (אור כחול) שימש לצילום hChR2(איור 4a).
    2. כדי לסנכרן את פעימת האור עם ההקלטה העצבית, חבר את מנהל ההתקן של ה- LED ואת יציאת IN הדיגיטלית של בקר ההקלטה לפולסר לוגיקה טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) (איור 4b). ניתן להשיג זאת באמצעות מפצל BNC.
      הערה: השימוש בפולסר TTL מספק את הגמישות של הגדרה דיגיטלית של תדירות ומשך הרכבת הרצויים. בפרוטוקול הנוכחי הופעלו פעימות אור של 10 מטר ב-50 הרץ18. עבור בקרת TTL במנהל ההתקן של ה- LED, עבור את מנהל ההתקן ל" גורם מפעיל ". במצב זה, עוצמת האור יכולה להיות מווסתת על ידי הפיכת "הידית". ניתן להתאים את תדירות הגירוי כך שתתאים למשתנים ניסיוניים ויכולה לנוע בין 1 ל-100 הרץ. עבור מעקב מעגל עצבי, תדר גירוי של >20 הרץ מומלץ.
    3. התאם את הידית כדי לקבוע את העוצמה האפקטיבית שיכולה ליצור תגובה מבלי לייצר חפצים פוטואלקטריים. במידת הצורך, למקם מחדש את הסיב האופטי כדי לחסלחפצים 19.
      הערה: מנהל ההתקן של ה- LED המשמש עבור הפרוטוקול הנוכחי מפיק הספק אור של ~ 21.8 mW.

5. הקלטה עצבית

  1. השתמש בדיקה עצבית חריפה עם שוק בעובי 15-50 מיקרומטר, מדידת לפחות 5 מ"מ אורך.
    הערה: הקלטה ממבנים עמוקים במוח תדרוש בדיקות עצביות עם שוק ארוך יותר. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בבדיקה עם אורך שוק של 20 מ"מ.
  2. חבר את שלב הראש לפני המגבר לבקר ההקלטה באמצעות כבל ממשק היקפי טורי (SPI). בדוק את תאורת הצבע של נוריות ה- LED ביציאות בקר ההקלטה. נוריות LED ירוקות וצהובות מצביעות על מתח מתאים בלוח המגבר המחובר. נורית LED אדומה מציינת בקרת במה פעילה של ראשתוכנה (איור 5b).
  3. באמצעות מיקרו-מניפולטור, למקם את אתרי הקשר אלקטרודה בשכבת התא הפירמידלי של CA1 (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 עד 1.2mm).
    הערה: הסיב האופטי והאלקטרודה יכולים להיות ממוקמים באזורי מוח רצויים אחרים לצילום והקלטה.

6. הגדרות מגבר ומסנן

  1. חבר את מערכת מגבר בקר ההקלטה למחשב באמצעות יציאת USB 3.0. חבר את שלב הראש למגבר באמצעות כבל SPI. הפעל את תוכנת הבקר. אם לא מחובר כראוי, המערכת תציג הודעת "התקן לא נמצא".
  2. לחץ על הפעל כדי להציג פעילות בערוצים. כל צורת גל מתוותת כמתח (ציר y) לעומת זמן (ציר x). בהתאם לאזור העניין, התאם את סולמות המתח והזמן כדי להתאים את תצוגת צורת הגל.
  3. אם רק ערוצים ספורים פעילים, הפוך ערוצים שאינם בשימוש ללא זמינים כדי להקטין את גודל הקובץ בדיסק האחסון.
  4. הגדר את קצב הדגימה ואת התדרים החתוכים על-ידי עריכת פרמטרי רוחב פס בתוכנת הרכישה. להקלטה ביחידה אחת, הגדר את תדרי הניתוק העליונים והתחתוניים ל- 300 הרץ ו- 5,000 הרץ בהתאמה. שנה את קצב דגימת המגבר ל- 30 kS/s.
    הערה: בחירת קצב דגימה גבוה תפיק גודל קובץ גדול יותר.
  5. לפני ההקלטה, בדוק את שלמות ערוצי האלקטרודה על-ידי מדידת עככת ב- 1,000 הרץ. ניתן לעשות זאת על-ידי הפעלת הפונקציה בממשק המשתמש (תוכנת בקר). לערוץ עבודה צריך להיות ערך עחובה הנע בין 0.1 ל- 5 MΩ.
  6. אם יציאת שמע (רמקול) מחוברת ליציאת ANALOG OUT, התאם רווח ומשתיק קול לצליל ספייק אופטימלי.
  7. כדי להציג את סמן הרכבת של פעימות TTL בהקלטת ספייק, הפעל את התצוגה עבור סמן ה- DIGITAL IN. כדי להקליט את חותמת הזמן של רכבת הדופק, הפעל את תצוגת הערוץ הדיגיטלית לפני הניסוי הראשי.
    הערה: בדרך כלל יש יותר מערוץ "DIGITAL IN" אחד (1 או 2). ודא שכבל BNC מפולס TTL מחובר ליציאת "DIGITAL IN" שנבחרה לתצוגה בתוכנת בקר ההקלטה.
  8. לצפייה בזמן אמת של צורת הגל של ספייק, פתח את חלון טווח הקו החדה והגדר סף באמצעות לחיצת העכבר.
  9. בדוק את רמת הרעש על ידי ניטור ריבוע שורש ממוצע (RMS ב- μV). להקלטת ספייק נקייה, עדיף כי סף ספייק עצבי הוא לפחות RMS 5x.
  10. לאחר השלמת ההתקנה, בחר את תבנית פלט הקובץ.
    הערה: כאן, ספייק עצבי CA1 נרשם בפורמט .rhd. ניתן גם לבחור תבניות קובץ אחרות (.rhs ו- .dat) כך שיתאימו לתבניות הקובץ המותרות על-ידי תוכנת הניתוח.

7. הקלטה והגדרות אופטוגנטיות של In vivo

  1. פתח את תוכנת בקרת הדופק (TTL) המציגה פרמטרי דופק מתכווננים שונים. בחר את יציאת COM המתאימה בתוכנה. הגדר פרמטרי דופק על-ידי התאמת הגדרות הרכבת והקבוצה.
    הערה: מצב הדופק צריך להיקבע על ידי התחשבות במשתנים ניסיוניים ועיצוב.
  2. בתוכנת בקר המגבר, לחץ על הפעל כדי לזהות קוצים עצביים בהיפוקמפוס או באזור המוח הרצוי. במידת הצורך, להתאים את עומק האלקטרודה כדי לזהות נוירונים קיימא ופעילים.
  3. לאחר זיהוי פעילות מתח חוץ-תאי, התבונן בקוצים בסיסיים במשך 15 דקות ונטר את האיברים החיוניים של החיה. כמו כן, בדוק את פעימת האור כדי לזהות נוירונים מגיבים בתוך CA1 או אזור היעד האנטומי הרצוי.
    הערה: בדוק אם קיימים ממצאים פוטואלקטריים וחסל על-ידי התאמת עוצמת האור או מיקום הסיב האופטי.
  4. הקלט את הפעילות הבסיסית למשך כ- 10 דקות לפני הפעלת פעימת האור בתדר הרצוי (איור 5a,b). זה יאפשר השוואה של שיעורי ירי או פרץ עם ובלי תאורה.
    הערה: במחקר הנוכחי, פעילות בסיסית נרשמה במשך 10 דקות ללא תאורה, ואחריו תאורה ב 50 הרץ (סרט 1).

8. ניתוח

  1. המר את קובץ ה- .rhd לתבנית פלט Nex5.
  2. עבד שם קובץ. קובץ Nex5 בתוכנת מיון לא מקוונת לזיהוי רכבות רסטר יחידה אחת וצפורמי גל(איור 5a–b).
    1. בחר את הערוץ הרצוי מהחלון הנפתח.
      הערה: ניתן להציג את נתוני הספייק המתועדים ברציפות בחלון נפרד של OFSS. ניתן גם להתאים את סרגל הזמן. אם נעשה שימוש בטרוד, ניתן להגדיר את OFSS כדי למיין את 4 הערוצים כטרודה.
    2. הגדר את רמת המתח עבור מיצוי צורת גל סף.
      אזהרה: השתמש במינימום של 5x RMS לזיהוי ספייק מתאים.
    3. זהה צורות גל ולאחר מכן בצע מיון ספייק בשיטה חיפוש עמק (אוטומטי) או K-אמצעים (חצי אוטומטי). במידת הצורך, מזג יחידות התופסות אזורים דומים של שטח ניתוח הרכיבים הראשיים של תלת-ממד (PCA).
    4. יצא ממוין . נקס 5 קבצים לניתוח נוסף (איור 5c–d).
      הערה: ניתן לייצא תוצאות ניתוח עבור מרווח הזמן הבין-כוכבי, קצב הירי וקצב ההתפרצות לפלטפורמות ניתוח אחרות.

9. זיהוי פלואורסצנטיות של ביטוי AAV

  1. לאחר ההקלטה, המתת חסד החיה בתא איזופלוריין.
  2. בצע זלוף עירוי קרדית עם 10 mM PBS (~ 10 מ"ל), ואחריו 4% paraformaldehyde חוצץ פוספט (PB-PFA, ~ 10 מ"ל).
  3. הסר את כל המוח ללא פגע ולתקן אותו 4% PB-PFA עבור 48 שעות.
  4. העבר את המוח הקבוע לתוך 4% PB-PFA המכיל 30% סוכרוז עבור cryopreservation ב 4 °C (50 °F). לאחר 72 שעות, חלקו את המוח בקריוסטט והרסו פרוסות על שקופית מצופה ג'לטין.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, נבחרו מקטעים המכילים את החלק הסגור של ההיפוקמפוס (rostral) כדי להדגים מסופים בעלי תווית AAV ב- DG, CA3 ו- CA1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מעקב אנטרוגרד

ביטוי AAV אומת על ידי הדמיית אימונופלואורסצנטיות של חלבון כתב (eYFP) ב- VTA של עכברי C57BL/6 21 ימים לאחר ההזרקה (איור 2). תיוג אנטרוגרדי מוצלח של תחזיות גלוטמט VTA פרסינפטיות בהיפוקמפוס אומת גם על ידי זיהוי eYFP בשכבות של DG, CA3 ו- CA1 (איור 6a-d; סרט 2 ו-3).

תחזיות גלוטמט VTA להיפוקמפוס לווסת פעילות CA1

פוטוטימול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעשור האחרון התקדם משמעותית התכנון של מבני AAV. ככזה, מקדמים ספציפיים יותר נוירון שולבו במגוון של סרוטיפים AAV עבור שיפור הספציפיות transfection14. על ידי שילוב גנים לחלבוני פלואורסצנטיות, מובילים, קולטנים וערוצי יונים, ספריות של AAV קיימות כעת לזיהוי הדמיה, נוירומודולציה ופעילות סינפטית. במבנים AAV זמינים מסחרית, שילוב של פלואורופור מקודד גנטית ו תעלות יונים (אופסין) מאפשר מעקב נוירואנטומי ואלקטרופיזיולוגי משולב של מעגלים עצביים14,18...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו ממומנת על ידי מענק גישור CBS שהוענק ל- OOM. OOM, PAA ו- AS עיצבו את המחקר וביצעו את הניסויים. AS ו- PAA ניתחו את התוצאות. OOM ו PAA הכינו את כתב היד. אנו מודים לד"ר קארל דיסרוט (אוניברסיטת סטנפורד) על שהפכה את AAV לזמין לשימושנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3% מי חמצןפישר כימיH312
AAV-CaMKII α-ChR2-eGYPAddgeneפלסמיד #26969
כבל BNCאמזון
BNC מפצלשרוול
קרמיקה עבור Ø טבעות 1.25 מ"מ.ThorlabsADAL1-5
מקדחהDremelLR 39098
מגלשות מצופות ג'לטיןפישר סיינטיפיקOBSLD01CS
מזרק המילטון (Neuros)WPI Inc.06H
מתאם שלב ראשNeuronexusAdpt-Q4-OM32
בדיקת סיליקון בעלת עכבה גבוההNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
בקר הקלטה INTAN 512chINTANRHD2000
תמיסת יודDynarex1425
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
קטמיןספקטרוםK1068
LED דרייברThorlabsLEDD1B
LED מקור אור (470 ננומטר)-אור כחולThorlabsM470F3
מיקרומניפולטורNarishigeM0-203
סיבים אופטייםThorlabsCFMLC14L05
פאן ראש פיליפס בורג פיליפס (M0.6 X 2 מ"מ)אמזוןM0.6 X 2 מ"מ
מגבר מקדים (32 ערוצים)INTANC3314
מסגרת סטריאוטקסיתKopf1530
TTL פולסרPrizmatix4031
UrethaneSigmaU2500
XylazineAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany Version
Graphpad PrismGraphPad תוכנהגרסה 8
Intan Recording ControllerIntantechגרסה 2.07
NeuroexplorerNex Technologiesגרסה 5.215
Plexon לא מקוון Spike SorterPlexon Incגרסה 4.5
ACSF הרכב: ACSF מחומצן חזק עם 95% חמצן/5% CO<תת>2 המבעבע ללא הרף דרך ה>
ACSF (ACSF; במ"מ 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl<תת>2 ו-25 גלוקוז).
הזדווגות מפוצל אמזון

מקורות

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10(2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251(2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269(2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528(2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697(2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

VTACA1AAVMulti Unit RecordingIn Vivo
מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.