מאמר שיטה

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61325

⸱

30 ביולי 2020

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

במאמר זה

סיכום

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

תקציר

בביולוגיה של הרבייה, מהפכת הביוטכנולוגיה שהחלה עם הפריה מלאכותית וטכנולוגיה להעברת עוברים הובילה לפיתוח טכניקות רבייה בסיוע כגון oocyte בהברה חוץ גופית (IVM), הפריה חוץ גופית (IVF) שיבוט של בעלי חיים ביתיים על ידי העברה גרעינית מתא סומטי. IVM היא השיטה בעלת משמעות מיוחדת. זוהי טכנולוגיית הפלטפורמה לאספקת oocytes בוגר, באיכות טובה עבור יישומים כגון צמצום מרווח הדור מינים חשובים מבחינה מסחרית או בסכנת הכחדה, מחקר לגבי רבייה אנושית חוץית, וייצור של בעלי חיים טרנסגניים עבור טיפולים בתא. המונח איכות oocyte כולל את יכולתה להשלים התבגרות, להיות מופרית, ובכך לגרום צאצאים בריאים. משמעות הדבר היא כי oocytes באיכות טובה הם בעלי חשיבות עליונה עבור הפריה מוצלחת כולל הליכי הפריה חוץ גופית. זה מציב קשיים רבים לפתח שיטת תרבות אמינה שתתמוך בצמיחה לא רק של oocytes אנושיים, אלא גם של מינים גדולים אחרים של יונקים. הצעד הראשון בIVM הוא תרבות המבחנה של oocytes. עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים לתרבות תלת-מית-מית של ציטים שונים. הראשון, מודל 3D cumulus-oocyte מתחמים (COCs) הם עטוף ברשת חרוז פיברין-אלגינט interחדירה, שבו תערובת של פיברין אלגינט הם ג'ל בו זמנית. בשנייה, COCs מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואורין (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטטרפלואורואתילן) חלקיקי אבקה כדי ליצור microbioreactors המוגדרים גולות נוזלי (LM). שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם מחזיקים בארגון תלת-מיתד COCs על-ידי מניעת שיטוחם ושיבוש כתוצאה מכך של צמתים של פערים, ובכך שומרים על הקשר הפונקציונלי בין האוציט, לבין תאי הזקיקים שמסביב.

מבוא

הפיתוח של מערכות תרבות שונות, כולל אלה תלת מימדי (3D), שמטרתו לספק תנאים אופטימליים לצמיחה והתבגרות של oocytes מבודד מן הזקיקים גם בשלבים המוקדמים ביותר של פיתוח. זה הוא בעל חשיבות רבה עבור טכניקות רבייה בסיוע (ART), במיוחד לאור המספר ההולך וגדל של נשים הנאבקות עם פוריות לאחר טיפול בסרטן1. התבגרות של oocytes בתנאי חוץ גופית (IVM) היא כבר טכניקה מבוססת היטב המשמשת בעיקר עבור יצירת עובר חוץ גופית לצורך רבייה בעלי חיים2. עם זאת, ברוב המינים היונקים, גם אם שיעור גבוה של התבגרות של קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) ניתן להשיג (טווח 60 עד 90 %)3, היכולת ההתפתחותית שלהם עדיין אינה מספקת לצרכים. הסיבה לכך היא הפיתוח של zygotes שהושגו באופן כזה אפילו עד שלב blastocyst הוא נמוך ולאחר ההעברה לבעלי חיים חלופיים הכדאיות שלהם לטווח מצטמצם. כתוצאה מכך, יש צורך להגדיל את היכולת ההתפתחותית של עוברים שהתקבלו מoocytes שהיו נתונים להליך IVM4. לכן, מדיה התבגרותחדשה 5 נמצאים בתכנון ותקופות שונות של תרבות המבחנהנבדקים 6,7 יחד עם תוספי מדיה תרבות עם גורמי גדילהשוניםמולקולות 8,9.

הצעד הראשון של כל מערכת IVM מלאה הוא ליצור תנאים אופטימליים לצמיחה בת קיימא של oocytes במהלך תרבות המבחנה. הצמיחה oocyte הוא אחד האינדיקטורים הספציפיים של היכולת של oocyte לחדש meiosis10,11. בנוסף, oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה חייב להיות מסוגל לתמוך התבגרות גרעינית שלה בידול cytoplasmic12. מורפולוגיה של קומפלקס cumulus-oocyte הוא אינדיקטור חשוב נוסף המשמש במרפאות ART כדי לבחור את oocyte הטוב ביותר עבור השלבים הבאים של הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) הליך בבניאדם ובעלי חיים 12,,13. בין המאפיינים המורפולוגיים של COCs נחשבים: קוטר oocyte, גרגר ציטופלסמה שלה ושלמות גוףהקוטב הראשון 14,15. חוץ מזה, הפוטנציאל ההתפתחותי oocyte הוא בקורלציה המראה והדחיסה של תאי קומולוס ומספר השכבות שלהם סביב oocyte. חשוב מאוד עבור oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה היא גם התחזוקה של תאי oocyte-cumulus אינטראקציות נאותות ויציבות ציטוסקלטון16,17,18,,19. עד כה, במבחנה oocyte צמיחה בתוך COCs אנושי הוכח20. השימוש COCs הפרה הביא גם עם לידות חיות. אלה היו מבודדים זקיקי שחלות ילדותיים ולאחר מכן תרבותי במשך 14 ימים עד oocyte היה גדול מספיק כדי לעבור את הליך הפריהחוץ גופית 21. באופן דומה, COCs מבודד זקיקי בבון אנטרל, נתון IVM לאחר בתרבות המבחנה הניב oocytes מסוגל לתחל מחדש meiosis לשלב metaphase II עם מבנה ציר מופיענורמלי 22. עם זאת, במחקר זה המחברים לא מנסים להפרות אותם. עם זאת, תוצאות כאלה מצביעות על כך שהליך דומה יכול להיות מיושם לא רק על מינים יונקים מסוימים אלה, אלא גם על תסביכים אנושיים cumulus-oocyte שהושגו זקיקים מה צריך לאפשר להשיג oocytes באיכות טובה מתאים טכניקת הפריה חוץ גופית מוצלחת.

התוצאות המתוארות לעיל הושגו עם יישום של פרוטוקולי IVM קונבנציונליים שבמהלכם oocytes היו תרבותיים במערכות דו מימדיות (2D). ההליך השגרתי במערכות תרבות דו-מית-מידיות מכסה את ה-oocytes, השקוע בטיפה של אמצעי תקשורת תרבותיים מתאימים,עם שמן מינרלי 23,24. ההנחה היא כי כיסוי שמן במהלך תרבות oocyte במבחנה משמש כדי למנוע אידוי נוזלי, ובכך להבטיח את התחזוקה של pH תקין ולחץ אוסמוטי בתרבות. למרות מערכת תרבות 2D כזה מאפשר להשיג, אפילו עד 87% של oocytes חזיר בוגר25, הוכח כי כיסוי שמן מינרלי גורם דיפוזיה משמעותית של חומרים מסיסים שומנים אשר נחוצים לפיתוח oocytesנכון 26. בנוסף, בגלל סטרואידים (פרוגסטרון ואסטרוגנים) דיפוזיה לתוך שמן מינרלי במהלך תרבות oocyte, עיכוב של התבגרות גרעינית וצמצום בהישג כשירות התפתחותית של oocytes חזיר נצפתה. הדבר עלול לגרום להשגת מספר קטן של זיגוטים, אשר בנוסף מאופיינים בקיבולת התפתחותית נמוכה לשלב של blastocyst ועל ידי קיימא ירודה לאחר העברה לבעלי חיים נמען27. לכן, נעשות ניסיונות להגביר את היכולת ההתפתחותית של עוברים הנגזרים מoocytes שהתקבלו לאחר הליך IVM, על ידי יצירת תנאים אופטימליים להשגת בגרות הן צטופלסמית והן בגרות גרעינית של oocytes תרבותי יחד עם CCs כמו קומפלקסים, במיוחד באמצעות מערכות תלת מימדיות (3D). 3D חדשניים שונים במערכות תרבות המבחנה פותחו בשני העשורים האחרונים28,29. אלה נועדו לשמור על הארגון המרחבי הטבעי של תאים ולהימנע שיטוח שלהם במנות תרבות מה לא ניתן להשיג בתרבויות הדו-מיD המסורתיות. ניתן להבטיח את הפעילות המבנית והפונקציונלית של COCs תרבותיים על ידי תחזוקת הארכיטקטורה המתאימה שלהם ותקשורת ללא הפרעה באמצעות צמתים בין תאיםשונים 30. התאמת ביו-פיגומים עבור 3D בתרבות המבחנה של קומפלקסים cumulus-oocyte הוערך באמצעות חומרים ביולוגיים טבעיים כגון רכיבים שונים של מטריצה חוץ תאית (ECM; קולגן וחומצה היאלורונית)31 או פולימרים אינרטיים (אלגינט)32. ניסיונות אלה שנבדקו במספר מינים הביאו לתוצאות מבטיחות מבחינת חידוש אוציט מיוזיס והשגת יכולתם המלאה33,34,35. עם זאת, עד כה, לא פותחה מערכת תלת-מית-מית-מית-מית-מז"ד המתאימה לבגרות COCs המבודדת מבעלי חיים ביתיים גדולים, כולל חזירים.

עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם עבור תרבות תלת-מית-די של COCs של פורצ'ין. הפרוטוקול הראשון מתאר אנקפולציה בחרוזי פיברין-אלג'ינאט (FAB). FAB יכול להיווצר על ידי ערבוב בו זמנית של תמיסת אלגנאט ופיברין, אשר עוברים תהליך ג'לציה סינכרונית. שילוב זה מספק סביבה מכנית דינמית מכיוון ששני הרכיבים תורמים לקשיחות מטריצה. פתרון דומה שימש בעבר עבור תרבות זקיק השחלות בעכבר והתבגרות36. במקרה של הפרוטוקול המוצג, כדי למנוע השפלה מוקדמת של רשת אלגנאט-פיברין, נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר של תמיסת סידן כלוריד, המבטיח תהליך ג'לציה מהירה ויציבה. הסביבה המכנית הדינמית יוצרת תנאים דומים לאלה בסביבה התוך-זקיקית הטבעית שבה שוכנים COCs וגדלים. בנוסף, העבודה מציגה תוצאות מייצגות של מערכות תרבות 3D COCs, שבו אלה מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואוריציה (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטרופלואוראתילן) חלקיקי אבקה, כדי ליצור microbioreactors (גולות נוזליות, LM). LM הם צורה של bioreactor 3D שהופעמי בעבר לתמוך, בין היתר, צמיחה של מיקרואורגניזמיםחיים 37, סרטניםסרטניים 38 ותאי גזעעובריים 39. LMs שימשו בהצלחה גם לתרבות הכבשים40. ברוב הניסויים באמצעות LMs, ביו-כופתים הוכנו באמצעות פוליטקטרפלואורואתילן (PTFE) אבקת מיטה עם גודל חלקיקים של 1 μm41. הפרוטוקול המוצג משתמש FEP, אשר דומה מאוד קומפוזיציה ומאפיינים PTFE fluoropolymers. אבל FEP הוא יותר קל לצורה ורך יותר PTFE ומה חשוב במיוחד, זה שקוף מאוד.

שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם שומרים על ארגון תלת-מיתד COCs על ידי מניעת שיטוח שלהם ושיבוש כתוצאה של צמתים פער, שמירה על הקשר הפונקציונלי שלהם בין oocyte ותאי זקיק שמסביב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים הבאים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים במכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי באוניברסיטת ג'יג'יבלוניק.

1. בידוד של מתחמי קומולוס-אוציט

  1. כדי לאסוף חומר לבידוד זקיקי השחלות, לחתוך שחלות porcine מגילים prepubertal (כ 6-7 חודשים של גיל, במשקל 70-80 ק"ג) בבית מטבחיים מקומי. בחר כ-20 שחלות חזיר מתוך 10 בעלי חיים לבידוד COCs בכל ניסוי.
    הערה: בהנחה שכל שחלה מניבה 3-5 זקיקים, המספר הכולל של זקיקים משתנה מ- 60 ל- 100.
  2. מניחים שחלות בתרמוס עם תמיסת מלח סטרילית המאגר פוספט (PBS; pH 7.4; 38 °C) המכיל 1% AAS. ודא כי החומר הניסיוני מועבר למעבדה בתוך 1 שעות שבו הוא שטיפה פעמיים עם PBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה.
  3. לאחר שטיפה של השחלות, להעביר אותם לבקת מלאה HM בינוני ולאחסן ב אינקובטור ב 38 ° C לזמן של כל המניפולציות.
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות במהלך טיפול ב- oocyte, לבצע את כל ההליכים DMEM / F12 בינוני (טיפול בינוני, HM) עם תוספת של 2.5% אנטיביוטיקה / פתרון אנטימיקוטי (AAS) ו 10% סרום בקר עוברי (FBS) ולשלוט pH ברמת CO2 בסביבה, על שולחן חימום עם בקרת טמפרטורה (38 ° C) ותחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למזער זיהום חיידקים.
  4. מתוך זקיקי חרסינה גדולים (6-8 מ"מ קוטר) לאסוף נוזל זקיקים (FF) על ידי שאיפה וצנטריפוגציה ב 100 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לסנן את supernatant באמצעות מזרק סטרילי מחובר מסנני נקבוביות 0.2 μm נקבוביות ולהקפיא הצמד ב -80 ° C.
    הערה: השתמש במזרק אינסולין (u- 40) לשאיפה של נוזל זקיקים.
  5. ודא כי, רק זקיקים בריאים בגודל בינוני (4-6 מ"מ קוטר) נבחרים לבידוד COCs42.
    הערה: COCs של כיתה I, בעל oocyte שלם ועגול עם ooplasm הומוגני ורב שכבתי (לפחות 3-4) קומולוס קומפקטי נחשבים מתאימים להליך IVM 3D נוסף43.
  6. כדי לבודד COCs, להעביר 2-3 שחלות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ מלאה HM. לבודד COCs זקיקים בגודל בינוני על ידי ביצוע אחד ההליכים שלהלן.
    1. בעדינות לחתוך את פני השטח של זקיקי השחלות הבולטים עם להב כירורגי סטרילי 15C. זה יגרום לנוזל הזקיקים יחד עם COCs לזרום החוצה לתוך צלחת פטרי.
    2. שאיפה לתכנים הזקיקים באמצעות מחט 28 G שיש גודל של 5/8 "מחובר מזרק חד פעמי ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי.
      הערה: השליכו את שרידי רקמת השחלות. השלבים הבאים של הבידוד מתבצעים תחת סטריאומיקרוסקופ.
  7. הכינו 3-5 60 מ"מ מנות פטרי הפריה חוץ גופית.
    1. להוסיף 1 מ"ל של HM לבארות המרכזיות ולמקם 3-4 טיפות של HM (50 μL לטיפה) בטבעות החוץ שלהם.
    2. לאחר מכן, באמצעות מיקרופיפט פוליקרבונט, להעביר את COCs שלא ניזהם לטיפות של HM בטבעות ההחוצה כדי לשטוף אותם לזמן קצר במשך 3-4 פעמים.
    3. בסוף, להעביר אותם בנפרד לבאר המרכזית. אחסן את צלחות הפריה חוץ גופית זו באינקובטור לצורך הליכים נוספים.
  8. לאחר איסוף COCs, בצע את שלב הבחירה הסופי על-ידי הקצאתם באופן אקראי לשני פרוטוקולי אנקבולציה IVM שונים המפורטים להלן.

2. אנקלוסציה בחרוזי הידרוג'ל פיברין-אלגינת

  1. הכן 1 מ"ל של 50 IU/mL תרומבין בתמיסת מלח עם טריס-אגירה (TBS; pH 7.4) עם 100 מ"מ CaCl2 בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 2.0 מ"ל.
  2. להכין פתרון מניות פיברינוגן (50 מ"ג/מ"ל ב TBS) ולשמור אותו קפוא.
    הערה: כדי למנוע cluming בעת המסת פיברינוגן ב- TBS, לחמם TBS ל 37 ° C.
    1. ביום ההליך, להפשיר אותו לאט על קרח ו ממש לפני השימוש להביא לטמפרטורת החדר.
  3. רגע לפני השימוש לערבב ב 1:1 יחס 0.5% פתרון אלגינת ו 50 מ"ג /מ"ל פיברינוגן פתרון כדי לקבל סוף סוף 2 מ"ל (FA). בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי מערבבים בעדינות את התערובת. להימנע מהכנת בועות.
  4. כדי להכין "תאי דגירה", להחיל רצועות דקות של סרטי פרפין על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
    הערה: מחק את השקופיות עם 70% EtOH לפני השימוש. תא דגירה אחד נוצר עם שתי שקופיות. כדי להפריד ביניהם, מניחים 3 מ"מ על אחד מהם.
  5. פיפטה 7.5 μL טיפות של תערובת FA על זה סרט פרפין מצופה מגלשת זכוכית, אשר יש גם הפרדת spacers. בשקופית אחת מקום 8-10 טיפות, מסודרים בשתי שורות.
  6. העברה, באמצעות מיקרו-פיפט, 3-5 COCs יחד עם נפח מינימלי (עד 5 μL) של בינוני התבגרות (MM), ולמקם אותם בדיוק במרכז הירידה FA. הליך זה דורש כישורים ידניים טובים ודיוק.
    הערה: מדיום ההתבגרות (MM) מורכב DMEM/F12, בתוספת 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10% FBS ו 50% נוזל זקיקים porcine (FF) שנאספו בשלב 1.4.
  7. להוסיף 7.5 μL של תרומבין / Ca2+ פתרון על כל ירידה FA, רק כדי לכסות אותם. אין צורך לערבב אותם כי הג'ל נוצר כמעט באופן מיידי.
  8. מכסים את תא הדגירה על-ידי החלת מגלשת הזכוכית השנייה, שהוכנה בעבר על קפסולות ה-FA. בתנועה מאוד זהירה אך איתנה, הפכו את התא והניחתו בצלחת פטרי 100 מ"מ מרופדת בנייר סינון לח כדי להימנע מייבוש.
  9. לאחר מכן, מעבירים את צלחת פטרי לאקובטור CO2 5% (38°C) למשך כ-5-7 דקות. לאחר מכן, כמוסות FA יהיה מעונן בגלל gelation בו זמנית של פיברין ואלגינת.
  10. להעביר כמוסות FA לתוך 96 צלחות באר (כמוסה אחת לכל באר) המכיל 100 μL MM לכל באר.
    הערה: כדי לא לפגוע כמוסות FA שנוצרו, לבצע צעד זה בזהירות עם השימוש משקולות כירורגיות.
  11. כל יומיים מחליפים חצי מה-MM (50 μL) ב-MM טרי ומוגן מראש. COCs של תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (בהגדלה של פי 10).
    הערה: תנאי תרבות עבור תרבות COCs FA: 38 °C, תחת 5% אווירה CO2 ולחות יחסית 95%. לאחר 4 ימים של IVM, הידרוג'לים נראים כמעט ברורים בשל השפלה הדרגתית של רכיב fibrin. האלגינת הנותרת צריכה להיות מושפלת באופן אנזימטי - על ידי אלג'ינאט-ליאז, אנזים המופק מצמחים שמשפיל במיוחד אלגנטיות ואינו משפיע על תאי בעלי חיים.
    1. הסר MM מבארות המכילות את הכמוסות ולהוסיף 100 μL של 10 IU / מ"ל alginate lyase ב DMEM. להשאיר את צלחת התרבות באינקובטור במשך 25-30 דקות.
    2. הסר COCs מהקפסולות המומסות.
      הערה: ניתן לעשות זאת עם קצה פיפטה חתוכה.
    3. לאחר מספר שטיפה ב-DMEM טרי, העבר COCs לטבעת הפנימית של צלחת הפריה חוץ גופית (5-10 COCs למנה) המכילה PBS. עכשיו, השתמש בהם לניתוח מורפולוגי או ביוכימי נוסף.

3. אנקפולציה במיקרוביו-חיידקי אתילן (FEP) פלואורציה סופר הידרופובית.

הערה: ודא שכל הליכי IVM מתבצעים בטבלה מבוקרת באופן תרמוסטטי ו- COCs נשמרים ב- 38 °C לאורך כל הטיפול שלהם.

  1. הכן צלחת פטרי 30 מ"מ המכילה 5 גרם של אבקת FEP בגודל חלקיקים ממוצע של 1 μm.
    הערה: חשוב להשתמש באבקת FEP טרי. FEP בשימוש חוזר נוטה לצבור ויוצר גושים.
  2. הפיצו טיפה אחת של MM (כ-30 μL בנפח) המכילה 3-5 COCs מבודדים בשלב 1.6 על המיטה של אבקת FEP. סובב את הלוח בעדינות בתנועה מעגלית כדי לוודא כי חלקיקים אלה כיסו לחלוטין את פני השטח של הטיפה הנוזלית ואת גולות נוזלי נוצר (LM).
  3. להרים נוצר LM באמצעות פיפטה עם 1,000 μL טיפ.
    הערה: חותכים את קצה הפיפטה בקצה, כדי להתאים אותו לקצר של LM (4-5 מ"מ). הקוטר המשוער של טיפ מוכן כזה צריך להיות קצת יותר גדול מזה של LM.
  4. הכינו מספר צמי 60 מ"מ של הפריה חוץ גופית פטרי. מוסיפים 3-4 מ"ל של מים סטריליים לטבעות ההיררכיות כדי להכין את תא הלחות. לאחר מכן, מניחים LM אחד לתוך הבאר המרכזית.
    הערה: הליך זה דורש כישורים ידניים טובים ודיוק - אם השיש ממוקם בחוסר תקלות או נופל אפילו מגובה נמוך הוא יושמד.
  5. דגירה גולות במשך 4 ימים ב 38 ° C ב 5 % CO2 אינקובטור.
    1. לשנות את המדיום מדי יום לאחר ההליך: להחיל 30 μL של MM על כל LM, אשר יגרום להתפשטות שלהם כי מגע נוזלי ישיר משבש את הידרופוביה של אבקות FEP מצופה. כאשר תכולת השיש מתמוססת, העבר COCs מתוצרת הביולוגיה לטיפה של MM טרי בצלחת פטרי.
      הערה: כדי להעביר במדויק COCs שפורסמו, השתמש מיקרופיפט פוליקרבונט.
    2. לאחר כמה שטיפה ב-MM (3-4 פעמים) כדי להסיר חלקיקי FEP, להעביר אותם עם 30 μL של MM טרי על מיטת אבקת FEP. סובב בעדינות את הצלחת בתנועה מעגלית כדי להבטיח כי חלקיקי האבקה כיסו לחלוטין את פני השטח של הטיפה הנוזלית ויוצרים LM חדש.
    3. לאחר מכן בצע את ההליך בשלבים 3.3-3.4.
      הערה: הציפוי השקוף של אבקת FEP מאפשר לפקח על תוכן LM באמצעות מיקרוסקופ אור.

4. אפיון COCs לאחר הליך IVM 96-h באמצעות שתי מערכות תלת-מיD

הערה: כדי לקבוע את היעילות של מערכות IVM בשימוש, ציון COCs מורפולוגית תחת מיקרוסקופ אור. בנוסף, השתמש תיוג פלורסנט כפול עם calcein AM ואתידיום הומודימר (EthD-1) צבעים לניתוח של COCs קיימא44.

  1. בדיקה מורפולוגית של oocytes לאחר IVM על ידי אור ומיקרוסקופ פלואורסצינציה.
    1. לשטוף COCs (הן אלה נגזרים מתרבות באמצעות FAB ואלה מ LM) עם 38 °C 1x PBS.
      הערה: כדי להקל על הטיפול ב- COCs ולא לפגוע בהם במהלך הליך ההכתמה, השתמש בצלחת 96 או 48 היטב ובצע כל שלב כתמים על-ידי העברת COCs לבארות הבאות.
    2. דגירה אותם ב 100 μL של 1.6 m calcein AM ו 5.5 mM EthD-1 עבור 30-45 דקות ב 37 ° C. לדלל את שני החומרים ב 1x PBS.
      הערה: מכיוון שפעולה זו היא הודעה פלואורססטית בשני צבעים, בצע שלב זה בחושך.
    3. לאחר הדגירה, לשטוף את COC פעמיים PBS ולאחר מכן לטבול אותו במדיום הרכבה נגד כף שנועד למנוע פוטו-בליך מהיר של חלבוני פלורסנט וצבעי פלורסנט(טבלת חומרים).
      הערה: הגן על הקצוות של זכוכית כיסוי מפני ייבוש עם כל לק.
    4. דמיין דגימות מוכתמות תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודאלי.
      הערה: כדי לרגש את הפלואורסצנס של שני הגששים (כלומר, calcein ואתידיום הומודימר-1, EthD-1) לכוון לייזר ארגון ל 488nm. הפלואורסצנה הנפלטת מופרדת על-ידי מסנן דיכורי משולש 488/561/633 ולאחר מכן נמדדת ב- 505-570 ננ"מ עבור המסנן הירוק (calcein) וב- 630-750 ננ"מ עבור האדום (EthD-1).
    5. לסווג COCs לארבע קטגוריות, באמצעות סיווג שונה המוחל על זקיקי השחלות בתרבות המבוססת על הדמיית פלואורסצנטיות confocal בהתאם לאחוז תאי גרנולוזהמתים 35.  V1: COCs עם מחשבים אישיים בני קיימא משוערים של 100%; V2: COCs עם 10% של CCs מת; V3: COCs עם 10%-50% של CCs מת; V4: COCs עם 50% של CCs מת.
      הערה: מבחינה טכנית, קשה להעריך את הכדאיות של oocyte עם הודעה חיה-מת; לכן, יש להעריך זאת למשל, על ידי ניתוח מבנה אולטרה-מיטוכונדריאלי או פעילות.
  2. בדיקה של אוציטים אולטרה מבנה לאחר IVM על ידי מיקרוסקופאלקטרון שידור.
    1. לתקן COCs ב 100 μL 2.5% גלוטרלדהייד ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר (pH 7.2, טמפרטורת החדר) עבור 2 שעות.
    2. לטבול COCs ב 100 μL 0.1 M נתרן cacodylate מאגר (לילה ב 4 ° C) ולשטוף באותו מאגר.
    3. לאחר תק עם 1% osmium tetroxide ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר (טמפרטורת החדר) עבור 1 שעה.
    4. לאחר הכתמה באורניל אצטט (1 %), התייבשות COCs בסדרה הולכת וגדלה של דילול אתנול (50%, 60%, 70%, 90% ו 100%), לחדור אותם לילה בטמפרטורת החדר, ואחריו שני שינויים קצרים של שרפים ולבסוף, להטביע אותם LR לבן.
    5. לאחר מכן, כדי לכוון ולהעריך דגימות, כתם מקטעים דקים למחצה (1 μm) עם מתילן כחול / תכלת הרקיע II.
    6. לבסוף, לבחון קטעים אולטרה דק, מוכתמים כפליים ברמה ultrastructural עם TEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בCOCs באמצעות שתי מערכות IVM, תאי granulosa דבקו בחוזקה זה בזה, ורוב COCs התאושש היו שכבות שלמות של תאי קומולוס(איור 1,B). בנוסף, חלק ניכר של תאי קומולוס נשמרו.

התוצאות שהתקבלו מניתוח הכדאיות של COCs אישרו כי שתי המערכות שהושמו לתחבולה של ציטים קוסין ב3D בתנאי המבחנה הבטיחו תנאי צמיחה אופטימליים(איור 2). בשתי הקבוצות נצפו רק oocytes בעלי יכולת קיום גבוהה, V1 = 13 %, V2 = 87% עבור FAB ו- 10% V1, ו- 90% V2 עבור LM, בהתא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היכולת לשמור על צמיחה במבחנה לא רק של oocyte אלא גם של תאי קומולוס המקיפים אותו ובו זמנית תמיכה התבגרותו היא חיונית ביותר עבור טכנולוגיות הרבייה בסיוע מוצלח תקדם את ההבנה של תא סומטי / oocyte אינטראקציות במיוחד מינים העוברים צמיחה זקיקים ממושכת כגון בני אדם או חזירים. טכניקות IVM משופרות ללא הרף הופכים כלי שימושי כדי לשמר את אפשרויות הרבייה במקרים של תסמונת שחלות פוליציסטיות (PCOS), כשל בשחלות מוקדמות, או פוריות מוחלטת (oncotherapy). בנוסף, מאז תפקוד לקוי של השחלות מסוימים עשוי להיגרם על ידי צמיחת זקיקים dysregulated, הב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים אסירי תודה: ד"ר Waclaw Tworzydlo (המחלקה לביולוגיה התפתחותית ומורפולוגיה חרת חוליות, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו רפואי, אוניברסיטת Jagiellonian) עבור מתקנים טכניים ב TEM; לגב' ביאטה סנקווסקה (המחלקה לאנדוקרינולוגיה, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, האוניברסיטה הג'יג'יבלונית) לקבלת סיוע טכני; למחלקה לביולוגיה והדמיה של תאים, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, אוניברסיטת ג'יג'ילוניאן, JEOL JEM 2100HT (JEOL, טוקיו, יפן). עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2018/29/N/NZ9/00983 ממרכז המדע הלאומי פולין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטיביוטיקה אנטיביוטית אנטיביוטית <חזקה>כללית
(100x) 100 מ"לתרמו פישר15240062ריכוז סופי של 2.5% לטיפול במדיום. 1% ב-PBS (שלב 1.2)
DMEM/F12 (500 מ"ל)Sigma-AldrichD8062טיפול והתבגרות בינוני
DPBS (ללא Ca, Mg), 1x, 500 מ"לתרמו פישר14190144
FCS (100 מ"ל)Thermo Fisher16140063ריכוז סופי של 10% הן למדיום טיפול והן למדיום התבגרות. (שלבים: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500 מ"לתרמו פישר10010023
תמיסת מלאי TBS (10x, pH 7.4) 500 מ"לקיימן כימיקלים600232ריכוז סופי פי 1. מותג אחר יכול להיות שימוש
<חזק>התבגרות בינונית
hCG (בקבוקון אחד של 10,000 U)Sigma-AldrichCG10
PMSGBioVendorRP1782721000
<חזק>חרוזי פיברין-אלגינט
אלגינט ליאזסיגמא-אולדריץ'A1603(שלב 2.11.1)
תרומביןסיגמא-אולדריץ'T9326-150UN(שלב 2.1)
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'C5670(שלב 2.1)
פיברינוגן (250 מ"ג)סיגמא-אולדריץ'F3879(שלב 2.2)
נתרן אלגינטסיגמא-אולדריץ'W201502(שלב 2.3) שימוש לתמיסת אלגינט
<חזק>שיש נוזלי
FEPDyneon GmbH 3M AdMDA-66670
<חזק>בדיקה מורפולוגית
חיה/כדאיות מתה/ציטוטוקסיות, לתאי יונקיםThermo FisherL3224(שלב 4.1.) פלואורסצנטיות נפלטת: 494 ננומטר עבור קלצאין, 528 ננומטר עבור EthD-1; מידה: 517 ננומטר עבור קלצאין, 617 ננומטר - EthD-1
VECTASHIELD Antifade הרכבהמעבדות וקטורH-1000הרכבה
בינונית<חזקה>בדיקת אולטרה-מבנה
תמיסת גלוטרלדהידSigma-AldrichG58822.5% ריכוז סופי (שלב 4.2.1.)
LR שרף לבןסיגמא-אולדריץ'L9774(שלב 4.2.4.)
מתילן כחולסיגמא-אולדריץ'M9140(שלב 4.2.5.)
אוסמיום טטרוקסידסיגמא-אולדריץ'O5500(שלב 4.2.3.)
נתרן קקודילאט טריהידראטסיגמא-אולדריץ'C0250השתמש להכנת מאגר נתרן קקודילאט 0.1M (pH 7.2)
אורניל אצטטPOCH868540111(שלב 4.2.4.)
<חזק>מכשירים ספציפיים, כלים
30 מ"מ צלחת פטריTPP93040
60 מ"מ IVF צלחת פטריפלקון353653
Ez-Grid פרימיום טיפול בתאים פיפטורRI מדעי החיים8-72-288
Ez-TipRI מדעי החיים8-72-4155/20
שולחן חימוםSEMICניתן להשתמש במותגים אחרים
חממהPanasonicMCO-170AIC-PEניתן להשתמש במותגים אחרים צלחת
פטרי סטרילית (10 ס"מ)NEST ביוטכנולוגיה704002
מסנני מזרק סטריליים עם 0.2 ומיקרו; mGOOGLAB SCIENTIFICGB-30-022PES
תרמוסקצ'ואה5602589ניתן להשתמש במותגים אחרים
חזקה בינוני

מקורות

  1. Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
  2. Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
  3. Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
  4. Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
  5. Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
  6. You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613(2012).
  7. Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
  8. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
  9. Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
  10. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
  11. Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
  12. Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
  13. de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
  14. Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
  15. Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
  16. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  17. Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
  18. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  19. Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
  20. Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
  21. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  22. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
  23. Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
  24. Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
  25. Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
  26. Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
  27. Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
  28. Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
  29. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
  30. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
  31. Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
  32. Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
  33. Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
  34. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  35. Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
  36. Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709(2015).
  37. Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
  38. Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
  39. Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
  40. Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  41. Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
  42. Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
  43. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
  44. Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
  45. Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
  46. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695(2011).
  47. Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
  48. Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
  49. Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
  50. Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vitro MaturationTEMFEPGap Junctions

מאמרים קשורים