הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61351

⸱

26 ביוני 2020

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק פרוטוקולים עבור תכנון והרכבה עצמית של nanostructures מ אוליגומרים חומצת פפטיד שונה גמא תערובות ממיסים אורגניים.

תקציר

האסטרטגיות הנוכחיות ב- DNA וננוטכנולוגיה של RNA מאפשרות הרכבה עצמית של מגוון ננו-מבנים של חומצות גרעין במדיה מימית או hydrated באופן משמעותי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים בניית ארכיטקטורות ננופייבר בתערובות ממס אורגניות באמצעות הרכבה עצמית של אריחי חומצת פפטיד (γPNA) הניתנים לטיפול ייחודי, חד-תקעים, שעברו שינוי גמא. כל אריח חד-תקע (SST) הוא אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים המורכב משני תחומים מודולריים שרשור של 6 בסיסים כל אחד. כל תחום יכול להיקשר לתחום משלים הדדית נוכח על גדילים שכנים באמצעות השלמה מתוכנתת כדי ליצור nanofibers שיכול לגדול מיקרונים באורך. מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סליל. בניגוד לננו-מבנים אנלוגיים של דנ"א, אשר יוצרים מבנים קוטר-מונודיספרז, מערכות γPNA אלה יוצרות ננו-פייברים המארזים לאורך רוחבם במהלך הרכבה עצמית בתערובות ממס אורגניות. פרוטוקולי הרכבה עצמית המתוארים כאן ולכן כוללים גם פעילי שטח קונבנציונליים, נתרן דודצ'יל סולפט (SDS), כדי להפחית את השפעות הצרור.

מבוא

בנייה מוצלחת של ננו-מבניםמורכבים רבים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 במדיה מיקווית או hydrated באופן משמעותי עשה באמצעות חומצות גרעין טבעיות כגון DNA1,2,3,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עיצוב רצף γPNA

  1. הורד את ארגז הכלים לעיצוב DNA22 שפותח על ידי מעבדת Winfree ב Caltech23 לתוך התיקייה המכילה סקריפטים תכנות לעיצוב רצפים.
  2. בתוך תיקיית עיצוב רצף זו, פתח שפת תיכנות מהדור הרביעי התואמת לסיומת הקובץ ".m" ולאחר מכן הוסף את התיקיה "DNAdesign" שהורדת בעבר לנתיב באמצעות הפקודה הבאה:
    >> הוסף עיצוב DNAdesign
  3. לאחר מכן הפעל את קובץ ה- Script הבא בשם "PNA3nanofiber.m" (ראה איור משלים 1) באמצעות הפקודה הבאה:
    >> PNA3נאנופייבר
  4. הפעל קובץ Script זה כדי ליצור משתנים הנקראים "thisSeqs" ו- "ThisScore". המשתנה "thisSeqs" מכיל את הרצפים של האוליגומרים המעוצבים, ו-"....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקולים שנדונו בסעיפים לעיל מתארים את העיצוב של מוטיב SST מותאם של ננו-פייברים DNA עבור הדור החזק של מבני nanofibers בהרכבה עצמית באמצעות אוליגומרים γPNA מרובים, ברורים. סעיף זה מתאר את הפרשנות של נתונים המתקבלים מהבילוי המוצלח של הפרוטוקולים המתוארים.

בעקבות הפרוטוקול המתואר בסעיף 5 להדמיית TIRF של דגימות של אוליגומרים γPNA annealed ב 75% DMSO: H2O (v / v) בקלות רבה מספק ראיות של ארכיטקטורות מאורגנות היטב תחת תצפיות מיקרוסקופיות כפי שמוצג איור 4A. .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתמקד בהתאמת ושיפור פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי תערובות ממס אורגניות. השיטות המתוארות כאן מתמקדות בשינויים ובפתרון בעיות בתוך מרחב ניסיוני מוגדר של ממיסים אורגניים אפרוטיים קוטביים נבחרים. יש עדיין פוטנציאל שלא נחקר עבור פרוטוקולים אחרים הוקמה חומצת גרעין ננוטכנולוגיה להיות מותאם בתוך שטח זה. זה יכול לשפר יישומים פוטנציאליים באמצעות אינטגרציה בתחומים אחרים כגון סינתזת פולימר ופפטיד אשר מבוצעים בדרך כלל ממיסיםאורגניים דומים 25,26. בנ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע 1739308, מענק קריירה NSF 1944130 ועל ידי משרד חיל האוויר של מחקר מדעי מענק מספר FA9550-18-1-0199. רצפי γPNA היו מתנה נדיבה מד"ר טאמול Srivastava של תיקון גנים Trucode, Inc. ברצוננו להודות לד"ר אריק ווינפרי ודר"ר ריזאל הריאדי על השיחות המועילות שלהם על קוד MATLAB של ארגז הכלים לעיצוב דנ"א. ברצוננו להודות גם לג'וזף סוהאן, מארה סאליבן והמרכז להדמיה ביולוגית על עזרתם באיסוף נתוני TEM.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&גמא; גדילים / אוליגומרים של PNATrucode Gene Repair Inc.סעיף 2.1
ספקטרופוטומטר UV-VisAgilentVarian Cary 300סעיף 3.1.2
קובטות קוורץStarna29-Q-10סעיף 3.1.1
מחזור תרמיBio RadC1000 מגעסעיף 4.1
0.2 מ"ל צינורות PCR VWR53509-304סעיף 4.5
נטול מים DMFVWREM-DX1727-6קטע 4.6
נטול מים DMSOVWREM-MX1457-6סעיף 4.6
נטול מים 1,4-DioxaneFisher ScientificAC615121000סעיף 4.6
10X מי מלח חוצץ פוספט (PBS)VWR75800-994סעיף 3.1.1
שקופיות מיקרוסקופVWR89085-399סעיף 5.2
החלקות כיסוי זכוכיתVWR48382-126סעיף 5.2
2% קולודיון באמיל אצטטסיגמא-אולדריץ'9817סעיף 5.2
איזואמיל אצטטVWR200001-180סעיף 5.2
אלבומין סרום בקר ביוטיניל (ביוטין-BSA)סיגמא-אולדריץ'A8549סעיף 5.3
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'A2153סעיף 5.4
סטרפטווידיןסיגמא-אולדריץ'189730סעיף 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813סעיף 5.7
מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללתNikonNikon Ti2-Eסעיף 5.8
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJoelJEM 1011סעיף 6.6
פינצטהDumont0203-N5AC-POסעיף 6.3
אורניל אצטטאלקטרון מדעי המיקרוסקופיה22400סעיף 6.1
פורמבר, 300 רשת, רשתות נחושתטד פלה בע"מ.1701-Fסעיף 6.2
פורמבר-סיליקון חד חמצני סוג A, 300 רשת, רשתות נחושתטד פלה בע"מ.1829סעיף 6.2
אוליגומרים/גדילים של DNAIDTסעיף 7.1
נתרן דודציל סולפט (SDS)VWR97064-860סעיף 8.1

מקורות

  1. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PNA גמאארכיטקטורות ננו-סיביםאריחים בעלי גדיל יחידסודיום דודציל סולפטדימוי TIRFאפיון TEMהרכב ממסצמימת ננו-מבנים