Method Article

הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

DOI:

10.3791/61351

⸱

June 26th, 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Carnegie Mellon University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק פרוטוקולים עבור תכנון והרכבה עצמית של nanostructures מ אוליגומרים חומצת פפטיד שונה גמא תערובות ממיסים אורגניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האסטרטגיות הנוכחיות ב- DNA וננוטכנולוגיה של RNA מאפשרות הרכבה עצמית של מגוון ננו-מבנים של חומצות גרעין במדיה מימית או hydrated באופן משמעותי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים בניית ארכיטקטורות ננופייבר בתערובות ממס אורגניות באמצעות הרכבה עצמית של אריחי חומצת פפטיד (γPNA) הניתנים לטיפול ייחודי, חד-תקעים, שעברו שינוי גמא. כל אריח חד-תקע (SST) הוא אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים המורכב משני תחומים מודולריים שרשור של 6 בסיסים כל אחד. כל תחום יכול להיקשר לתחום משלים הדדית נוכח על גדילים שכנים באמצעות השלמה מתוכנתת כדי ליצור nanofibers שיכול לגדול מיקרונים באורך. מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סליל. בניגוד לננו-מבנים אנלוגיים של דנ"א, אשר יוצרים מבנים קוטר-מונודיספרז, מערכות γPNA אלה יוצרות ננו-פייברים המארזים לאורך רוחבם במהלך הרכבה עצמית בתערובות ממס אורגניות. פרוטוקולי הרכבה עצמית המתוארים כאן ולכן כוללים גם פעילי שטח קונבנציונליים, נתרן דודצ'יל סולפט (SDS), כדי להפחית את השפעות הצרור.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בנייה מוצלחת של ננו-מבניםמורכבים רבים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 במדיה מיקווית או hydrated באופן משמעותי עשה באמצעות חומצות גרעין טבעיות כגון DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ו- RNA 11,12 הוצגו בעבודות קודמות. עם זאת, חומצות גרעין המתרחשות באופן טבעי עוברות שינויים קונפורמיים דו-סטריים או צמצמו את היוצקותהתרמיות בתערובות ממס אורגני 13,14.

בעבר, המעבדה שלנו דיווחה על שיטה לבניית ננו-פייברים עם 3 סלילים באמצעות חיקויי חומצות גרעין סינתטיות שעברו מיקום גמא הנקראים חומצות גרעין גמא-פפטיד (γPNA)15 (איור 1A). הצורך בפיתוח כזה ויישומים פוטנציאליים של חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA נדונה בתוךהשדה 16,17. הראינו, באמצעות הסתגלות של אריח חד גדילי (SST) אסטרטגיה שהוצגו עבור nanostructures DNA18,19,20, כי 9 אוליגומרים γPNA ברור ברצף יכול להיות מתוכנן ליצור nanofibers סליל 3 בתערובות ממס אורגני קוטבי נבחר כגון DMSO ו- DMF. אוליגומרים γPNA הוזמנו מסחרית עם שינויים של (R)-diethylene גליקול (מיני PEG) בשלוש עמדות γ (1, 4 ו 8 עמדות בסיס) לאורך כל אוליגומר 12 בסיס מבוסס על שיטות שפורסמו על ידי Sahu et al. 21 שינויים אלה גמא לגרום טרום ארגון helical המשויך זיקה מחייבת גבוהה יותר ויציבות תרמית של γPNA יחסית PNA ללא שינוי.

מאמר זה הוא התאמה של העבודה המדווחת שלנו שבו אנו חוקרים את ההשפעות של פתרון ממס והחלפה עם DNA על היווצרות של nanostructures מבוססי γPNA15. מטרת מאמר זה היא לספק תיאורים מפורטים של העיצוב, כמו גם פרוטוקולים מפורטים עבור שיטות מותאמות ממס שפותחו עבור הרכבה עצמית ואפיון של nanofiber γPNA. לכן, אנו מציגים לראשונה את אסטרטגיית SST מודולרית, פלטפורמה כללית עבור עיצוב nanostructure באמצעות חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA.

המגרש הסללי לדופלקסים של PNA דווח על 18 בסיסים לכל סיבוב בהשוואה לדופלקסים של דנ"א, שעוברים סיבוב אחד לכל 10.5 בסיסים (איור 1B). לכן, אורך התחום של SSTs γPNA הפגינו נקבע על 6 בסיסים כדי להכיל שליש סיבוב מלא או 120° של סיבוב כדי לאפשר אינטראקציה בין שלושה helices מערך משולש. כמו כן, שלא כמו מוטיבים קודמים של SST, כל SST מכיל רק 2 תחומים, ויוצר ביעילות מבנה חד-ממדי דמוי רצועת הכלים העוטף ליצירת צרור שלוש סלילים (איור 1C). כל אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים משתנה ב-1, 4 ו-8 המיקומים כדי להבטיח חלוקה במים אחידים של קבוצות מיני-PEG במוטיב SST הכולל. בנוסף, בתוך המוטיב ישנם שני סוגים של אוליגומרים: גדילים "רציפים" הקיימים על סליל יחיד וגדילי "קרוסאובר" פורשים סליל (איור 1D). בנוסף, אוליגומרים P8 ו- P6 מסומנים עם Cy3 פלואורסצנטי (כוכב ירוק) וביוטין(אליפסה צהובה),בהתאמה ( איור 1D ), כדי לאפשר זיהוי של היווצרות מבנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסך הכל, מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סלילים באמצעות השלמה מתוכנתת של כל תחום בודד לתחום המתאים על אוליגומר שכן (איור 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב רצף γPNA

  1. הורד את ארגז הכלים לעיצוב DNA22 שפותח על ידי מעבדת Winfree ב Caltech23 לתוך התיקייה המכילה סקריפטים תכנות לעיצוב רצפים.
  2. בתוך תיקיית עיצוב רצף זו, פתח שפת תיכנות מהדור הרביעי התואמת לסיומת הקובץ ".m" ולאחר מכן הוסף את התיקיה "DNAdesign" שהורדת בעבר לנתיב באמצעות הפקודה הבאה:
    >> הוסף עיצוב DNAdesign
  3. לאחר מכן הפעל את קובץ ה- Script הבא בשם "PNA3nanofiber.m" (ראה איור משלים 1) באמצעות הפקודה הבאה:
    >> PNA3נאנופייבר
  4. הפעל קובץ Script זה כדי ליצור משתנים הנקראים "thisSeqs" ו- "ThisScore". המשתנה "thisSeqs" מכיל את הרצפים של האוליגומרים המעוצבים, ו-"thisScore" הוא ציון העונשין.
  5. הפעל את קובץ ה- Script מספר פעמים כדי לקבל את הציון המינימלי ביותר. מדגם של 20 ריצות כאלה מוצג בטבלה 1.
  6. אשר באופן ידני את המשלימות הרצויה של Watson-Crick של כל תחום של הרצפים שנוצרו עבור המוטיב המבני שצוין של SST. מפרטי רצף עבור מבנה nanofiber 3 סליל מוצגים בטבלה 2.
  7. אמת את הפרטים הבאים עבור רצפים שנוצרו.
    1. הימנע משימוש בארבעה בסיסי C ו- G רצופים.
    2. בחר באופן ידני רצפים ספציפיים לפונקציונליזציה של N-terminal עם מולקולות צבע פלואורסצנטי וביוטין כדי לאפשר מחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים.
    3. כלול לפחות 3 מיני-PEG גמא-שינויים על עמוד השדרה כדי לאפשר קונפורמציה סללי מאורגן מראש אוליגומרים חד נטושים כפי שתואר על ידי Sahu et al. 21

2. הכנת גדילי מניות γPNA

  1. השג גדילי רכיב γPNA של רצפים שצוינו בסינתזה בקנה מידה של 50 נמול עם טיהור כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעל ביצועים גבוהים מיצרן מסחרי.
  2. תן מחדש כל גדיל במים deionized ל 300 ריכוזי μM. אחסן את הגדילים המתווסכלים במקפיא ב-20 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים עד לצורך בניסויים.

3. מחקרי עקומת היתוך של תת-קבוצות אוליגומר γPNA

  1. השג טווחי טמפרטורה נמסים עבור שילובים שונים של תת-קבוצות משלימות של 2 אוליגומר ו- 3 אוליגומרים על-ידי הפעלת מחקר עקומת התכה במאגרים מימיים כגון 1x phosphate buffered saline (PBS) או ממס אורגני קוטבי מועדף כגון דימתילפורממיד (DMF) או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (ראה איור 2).
    הערה: עקומות התכה תרמית ב- >50% מ- DMF מתחילות לאבד את קו הבסיס העליון ומראות הפרעות חמורות בין השאר בגלל ספיגה גבוהה של DMF באורך הגל הנדרש לניסויים. זוהי תופעה ידועה בספרות24. עם זאת ניתן להשיג את עקומות ההיתוך ב 5 מיקרומטר לכל ריכוזי גדיל בתנאים ממס אלה.
    1. Aliquot 16.7 μL מתוך 300 μM המניות של כל אוליגומר ולעשות את הנפח הסופי 1000 μL או ב 1x PBS או 100% (v / v) DMSO או 100% (v / v) DMF ביעילות להשיג 5 μM ריכוז סופי לכל אוליגומר. מעבירים את תערובת התת-קבוצה האוליגומרית לנתיב אופטי באורך 1 ס"מ, קובט קוורץ.
    2. בצע ניסויי UV-Vis בטמפרטורה משתנה בספקטרופוטומטר המצויד בבלוק טמפרטורה ניתן לתיכנות.
    3. לאסוף נקודות נתונים עבור עקומות ההיתוך על פני טווח טמפרטורות של 15 \u201290 °C (690 °F) עבור מחזורי קירור (חישול) וחימום (נמס) בקצב של 0.5\u20121 °C/min. שמור את הדגימות במשך 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס לפני הקירור ב 15 °C (60 °F) לפני החימום. לקבוע את טמפרטורתההיתוך(T m ) מהשיא של הנגזרת הראשונה של עקומת החימום.
    4. ודא כי טווחי טמפרטורת ההיתוך עבור תת-קבוצות 2-אוליגומר הם מעל 35 °C (60 °F) בכל המקרים ממס. בנוסף, ודא כי תת-קבוצות 3-oligomer המתאימות המכילות גדיל נוסף לתתת-הקבוצה המקבילה שלהם 2-oligomer מראה עלייה ניכרת ב- Tm עקב שיתוף פעולה מוגבר.
      הערה: זה יוודא כי הרכבה עצמית סיר יחיד של אוליגומרים מרובים יכול לקפל שיתוף פעולה לתוך nanostructure הרצוי עם יציבות תרמית סבירה.

4. פרוטוקול הרכבה עצמית עבור אוליגומרים נפרדים מרובים של γPNA

הערה: כדי לתכנן פרוטוקול רמפה תרמית להרכבה עצמית עבור nanostructures γPNA, חישול רמפה איטית רצוי.

  1. במקרה של רצפי אוליגומר שנוצר, anneal את הדגימות עבור 22.5 שעות בקירור רוכב תרמי מ 90 °C (60 °F). בדרך כלל, טמפרטורת ההיתוך המתקבלת עבור 2-אוליגומר ו 3-אוליגומר γPNA subsets לשכב בטווחים של 40 \u201270 °C (70 °F) עבור תנאי ממס שונים.
  2. לתכנת את האופניים התרמיים כדלקמן: להחזיק ב 90 °C (60 °F) במשך 5 דקות, רמפה למטה מ 90 °C (70 °F) בקצב קבוע של 0 °C (70 °F/ min, רמפה למטה מ 70 °C (70 °F) בקצב של 0 °C (70 °F/3 דקות, רמפה למטה מ 40 °C (60 °F) בקצב של 0 °C (60 °F/ min) ולהחזיק ב 4 °C (ראה טבלה 3). ניתן לאחסן דגימות ב- 4 °C (70 °F) עבור 12\u201224 שעות לפני האפיון.
    הערה: בעוד 2- ו 3- oligomer subsets של מערכת nanofiber שלנו יכול להיווצר PBS 1x, nanofibers בקנה מידה מיקרון מלא לצבור PBS 1x. לכן, תנאי ממס צריך להיות אופטימיזציה בהתבסס על קנה המידה והגודל של המבנה שנוצר, כמו גם את סוג וצפיפות של שינויים גמא.
  3. עבור מיקרון בקנה מידה ארוך 3-סליל nanofibers, להכין דגימות אצווה anneal ב 75% DMSO: H2O (v / v), 75% DMF: H2O (v / v), 40% 1,4-דיוקסן: H2O (v / v) מבוסס על מחקריאופטימיזציה ממס 15.
  4. הכן אצוות אנאליות כדלקמן (ראה טבלה 4). ראשית, להכין 10 μL תת מניות ב 20 μM ריכוזים מן 300 μM המניות העיקריות עבור כל אוליגומר על ידי aliquoting 0.67 μL מהמלאי הראשי ולהפוך את הנפח ל 10 μl באמצעות מים deionized.
  5. Aliquot 1 μL מ 20 μM תת מניות עבור כל אוליגומר ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL. זה מהווה נפח כולל של 9 μL עבור 9 אוליגומרים.
  6. הוסף 30 μL של DMSO / DMF נטול מים עבור 75% DMSO ו 75% מקרי DMF עם μL נוסף של מים deionized לעשות נפח סופי של 40 μL עם כל אוליגומר ב 500 ננומטר ריכוזים סופיים. הוסף 16 μL של 1,4-דיוקסן ולעשות את הנפח עם מים deionized ל 40 μL עבור 40% מצב ממס דיוקסן.
  7. טען את אצוות anneal על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.

5. סה"כ הדמיית מיקרוסקופיה של השתקפות פנימית (TIRF)

  1. הכינו תא לחות מתיבת טיפים ריקה של פיפטה. מלאו את הקופסה בכ-5 מ"ל מים כדי למנוע ייבוש של תעלות הזרימה לדוגמה המתוארות כדלקמן (ראו איור 3).
  2. הכינו תא זרימה עם מגלשת מיקרוסקופ, 2 רצועות סרט דו-צדדיות וכיסוי מצופה ניטרוסלולוז. כדי לצפות את כיסוי עם nitrocellulose, לטבול את כיסוי בתוך מקור המכיל 0.1% קנודיון אטיל אצטט ויבש באוויר.
    1. הכן את פתרון nitrocellulose על ידי ביצוע דילול 20-פי 20 מ מסחרי זמין 2% קנודיה אטיל אצטט עם ממס אצטט isoamyl.
  3. הכן ביוטינילציה בסרום בסרום (Biotin-BSA) פתרון על ידי שקילה 1 מ"ג של ביוטין-BSA והמסתו ב 1 מ"ל של 1x PBS. זרימה 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל ביוטין-BSA במאגר PBS 1x על ידי הצבת ערוץ הזרימה בזווית. הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  4. הכן את מאגר לשטוף על ידי המסת 1 מ"ג של BSA ב 1 מ"ל של 1x PBS. לשטוף את עודף ביוטין-BSA על ידי זורם 15 μL של מאגר לשטוף. כדי להעביר את פני השטח, הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  5. הכן את פתרון סטרפטבידין על ידי מדידת 0.5 מ"ג של סטרפטבידין ו 1 מ"ג של BSA ולאחר מכן המסה באמצעות 1 מ"ל של 1x PBS. זרימה 15 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל סטרפטבידין ב 1x PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA. הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. זרימה 15 μL של מאגר לשטוף לשטוף את סטרפטבידין מאוגד.
  6. זרימה 15 μL של אצווה annealed בעבר של אוליגומרים γPNA ב 500 nM ריכוז לכל גדיל או 75% DMSO, 75% DMF או 40% 1,4-מצב דיוקסן. להדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  7. הכן 1 mM Trolox בתנאי ממס מועדפים על ידי דילול 10-פי מ"מ מלאי של 10 מ"מ של טרולוקס ב- DMSO (למדוד 2.5 מ"ג של טרולוקס להתמוסס ב 1 מ"ל של DMSO). לשטוף את nanostructures מאוגדים בערוץ הזרימה עם 15 μL של 1 mM Trolox בעל הרכב ממס זהה ננו.
    הערה: תוכן DMSO של >50% בערוץ הזרימה יגרום להפרעות אות קלות עקב האינדקס השונה של שבירה של מצב הממס במהלך TIRF אשר מכויל בדרך כלל עבור זוויות TIRF של מים מכסים. זה יכול להיות מתוקן על ידי שטיפה עם 1 mM Trolox שנעשו על ידי דילול 10 mM Trolox 10-פי באמצעות מים deionized. טכניקה זו מספקת תמונות ברורות יותר, אך שימושית רק להערכת אם היווצרות התרחשה, עם זאת, מכיוון שהיא מייצרת מיקרו-בועות דו-פאזיות בערוץ הזרימה. כתוצאה מכך, ננו-מבנים עשויים להיות גלויים בממשק של שני השלבים כפי שמוצג איור 4D.
  8. העבר את ערוץ הזרימה אל מחזיק השקופית והתמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בהדמיית TIRF באמצעות מטרה של טבילת שמן פי 60 וזכוכית מגדלת של פי 1.5. סרוק את ערוץ הזרימה בהגדלה של 60x או 90x על-ידי ניטור ערוץ Cy3 (ראה איור 4).

6. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) הדמיה

  1. לשקול 0.5 גרם של אצטט אורניל ב 50 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין 1% אצטט אורניל אצטט פתרון. סנן את תותב הכתם של 1% אורניל אצטט מים באמצעות מסנן μm 0.2 המחובר למזרק.
    הערה: לחילופין, ניתן לרכוש 2% אצטט אורניל מימי מיצרניל מסחרי.
  2. רכשו רשתות נחושת מצופות Formvar מסחריות עם רשת שינוי בגודל 300 רשתות שינוי.
    הערה: חשוב לציין כי שכבת התמיכה formvar יכול להיות מומס משם על ידי ממיסים כמו DMSO מעבר 2 דקות. עבור דגירה מדגם ארוך יותר, formvar זמין מסחרית התייצב עם חד תחמוצת הסיליקון על רשתות נחושת זמינים המאפשרים לרשת להיות הידרופילי יותר מאשר רשתות מצופות פחמן והוא יכול לעמוד בתנאי מדגם נמרצים קרן אלקטרונים כפי שמוצג באיור 5C.
  3. פיפטה 4 μL של מדגם על הרשת עבור 15 s. השתמש בפיסת נייר סינון כדי לבטל את הדגימה על-ידי הבאת נייר הסינון במגע עם הרשת מהצד.
  4. מיד להוסיף 4 μL של פתרון הכתם על הרשת עבור 5 s.
  5. פתיל את הכתם כמו קודם ולהחזיק את נייר המסנן נגד הרשת במשך 1\u20122 דקות כדי לוודא את הרשת יבשה. יש לדמיין דוגמאות בדרך כלל בטווח של 1\u20122 שעות לאחר הכתם. לחלופין, אם הרשת מובטחת להיות יבש לחלוטין, רשתות ניתן לאחסן בתיבת אחסון רשת TEM עד 3 ימים לפני הדמיה.
  6. העבר את הרשת למחזיק דגימת TEM ולתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור המופעל ב- 80 kV עם הגדלה הנעה בין 10 K ל- 150K (ראה איור 5).

7. מורפולוגיות שונות עבור כלאיים γPNA-DNA מבוסס על החלפה סלקטיבית עם DNA

  1. השג אוליגומרים DNA של רצפים שצוינו (ראה טבלה 5) מיצרני אוליגונוקלאוטיד מסחרי מסונתז ב 25 סולם nmol באמצעות התפלה סטנדרטית. השתמשו מחדש ברצפי הדנ"א האלה באמצעות מים לא מיונים נטולי RNase בריכוזי מלאי של 20 מיקרומטר.
  2. להחלפת גדילי γPNA רציפים בדנ"א, רצפים D3, D5 ו-D9 יכולים להחליף גדילים p3, p5 ו-p9. באופן דומה, עבור החלפת גדיל γPNA מוצלב עם DNA, רצפים D1, D4 ו D7 יכול להחליף גדילים p1, p4 ו p7.
  3. Aliquot 1 μL מתוך 20 μM תת מניות עבור כל γPNA או DNA אוליגומר ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL כמו בשלב 2.7. הוסף 30 μL של DMSO נטול מים נטולי מים נטולי RNase כדי להפוך את הנפח הסופי ל 40 μL (ראה טבלה 6).
  4. טען את אצוות anneal על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.
  5. לאפיין ננו-מבנים היברידיים γPNA-DNA באמצעות פרוטוקול TIRF לאחר שלבים בסעיף 5 או באמצעות פרוטוקול הדמיית TEM המוזכר בסעיף 6 (ראה איור 6).

8. מורפולוגיות שונות עבור nanofibers γPNA בריכוזים משתנים של SDS

  1. הכן 20% (wt / v) SDS המניה העיקרית על ידי מדידת 20 מ"ג של SDS והמסתו ב 100 μL של מים deionized.
  2. הכן 6% (wt /v) SDS תת מניות על ידי aliquoting 3 μL מ 20% מניית SDS ו ביצוע נפח 10 μL באמצעות מים deionized.
  3. אנאל אוליגומרים γPNA בריכוזים הסופיים של 5.25 mM ו 17.5 mM SDS כדלקמן. Aliquot 1 μL מתוך 20 μM תת מניות עבור כל אוליגומר γPNA ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL כמו בשלב 2.7. הוסף 30 μL של DMSO נטול מים ו μL אחד של 6% ו 20% SDS כדי להפוך את הנפח הסופי ל 40 μL כדי להשיג ריכוזים סופיים SDS של 5.25 mM ו 17.5 mM, בהתאמה (ראה טבלה 7).
  4. לטעון את האצוות anneal של ריכוזי SDS שונים על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.
  5. לאפיין ננו-מבנים γPNA בנוכחות SDS באמצעות פרוטוקול TIRF בעקבות שלבים בסעיף 5 או באמצעות פרוטוקול הדמיית TEM המוזכר בסעיף 6 (ראה איור 7).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים שנדונו בסעיפים לעיל מתארים את העיצוב של מוטיב SST מותאם של ננו-פייברים DNA עבור הדור החזק של מבני nanofibers בהרכבה עצמית באמצעות אוליגומרים γPNA מרובים, ברורים. סעיף זה מתאר את הפרשנות של נתונים המתקבלים מהבילוי המוצלח של הפרוטוקולים המתוארים.

בעקבות הפרוטוקול המתואר בסעיף 5 להדמיית TIRF של דגימות של אוליגומרים γPNA annealed ב 75% DMSO: H2O (v / v) בקלות רבה מספק ראיות של ארכיטקטורות מאורגנות היטב תחת תצפיות מיקרוסקופיות כפי שמוצג איור 4A. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתמקד בהתאמת ושיפור פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי תערובות ממס אורגניות. השיטות המתוארות כאן מתמקדות בשינויים ובפתרון בעיות בתוך מרחב ניסיוני מוגדר של ממיסים אורגניים אפרוטיים קוטביים נבחרים. יש עדיין פוטנציאל שלא נחקר עבור פרוטוקולים אחרים הוקמה חומצת גרעין ננוטכנולוגיה להיות מותאם בתוך שטח זה. זה יכול לשפר יישומים פוטנציאליים באמצעות אינטגרציה בתחומים אחרים כגון סינתזת פולימר ופפטיד אשר מבוצעים בדרך כלל ממיסיםאורגניים דומים 25,26. בנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע 1739308, מענק קריירה NSF 1944130 ועל ידי משרד חיל האוויר של מחקר מדעי מענק מספר FA9550-18-1-0199. רצפי γPNA היו מתנה נדיבה מד"ר טאמול Srivastava של תיקון גנים Trucode, Inc. ברצוננו להודות לד"ר אריק ווינפרי ודר"ר ריזאל הריאדי על השיחות המועילות שלהם על קוד MATLAB של ארגז הכלים לעיצוב דנ"א. ברצוננו להודות גם לג'וזף סוהאן, מארה סאליבן והמרכז להדמיה ביולוגית על עזרתם באיסוף נתוני TEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&גמא; גדילים / אוליגומרים של PNATrucode Gene Repair Inc.סעיף 2.1
ספקטרופוטומטר UV-VisAgilentVarian Cary 300סעיף 3.1.2
קובטות קוורץStarna29-Q-10סעיף 3.1.1
מחזור תרמיBio RadC1000 מגעסעיף 4.1
0.2 מ"ל צינורות PCR VWR53509-304סעיף 4.5
נטול מים DMFVWREM-DX1727-6קטע 4.6
נטול מים DMSOVWREM-MX1457-6סעיף 4.6
נטול מים 1,4-DioxaneFisher ScientificAC615121000סעיף 4.6
10X מי מלח חוצץ פוספט (PBS)VWR75800-994סעיף 3.1.1
שקופיות מיקרוסקופVWR89085-399סעיף 5.2
החלקות כיסוי זכוכיתVWR48382-126סעיף 5.2
2% קולודיון באמיל אצטטסיגמא-אולדריץ'9817סעיף 5.2
איזואמיל אצטטVWR200001-180סעיף 5.2
אלבומין סרום בקר ביוטיניל (ביוטין-BSA)סיגמא-אולדריץ'A8549סעיף 5.3
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'A2153סעיף 5.4
סטרפטווידיןסיגמא-אולדריץ'189730סעיף 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813סעיף 5.7
מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללתNikonNikon Ti2-Eסעיף 5.8
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJoelJEM 1011סעיף 6.6
פינצטהDumont0203-N5AC-POסעיף 6.3
אורניל אצטטאלקטרון מדעי המיקרוסקופיה22400סעיף 6.1
פורמבר, 300 רשת, רשתות נחושתטד פלה בע"מ.1701-Fסעיף 6.2
פורמבר-סיליקון חד חמצני סוג A, 300 רשת, רשתות נחושתטד פלה בע"מ.1829סעיף 6.2
אוליגומרים/גדילים של DNAIDTסעיף 7.1
נתרן דודציל סולפט (SDS)VWR97064-860סעיף 8.1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  4. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  5. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  6. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  7. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  8. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  9. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  10. Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518(2018).
  11. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  12. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  13. Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007(2014).
  14. Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339(2000).
  15. Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
  16. Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
  17. Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930(2017).
  18. Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
  19. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
  20. Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
  21. Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
  22. DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
  23. Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
  24. Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
  25. Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
  26. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247(2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gamma PNASelf AssemblyOrganic Solvent MixturesNanofiber ArchitecturesSingle Stranded TilesSodium Dodecyl SulfateTIRF ImagingTEM CharacterizationSolvent CompositionNanostructure Bundling

Related Articles