אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

Abstract

התרחבות תאי מערכת החיסון, הפעלתם וסחרם לריאות, הנשלטים על ידי ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים מרובים, עשויים להשתנות על-ידי פגיעה מוחית חמורה. עדות לכך היא העובדה כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים שסבלו משבץ איסכמי. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש באנליזה ציטומטרית של זרימה צבעונית כדי לזהות 13 סוגים של תאי חיסון בריאות של עכברים, כולל מקרופאגים אלוואולריים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, תאים דנדריטיים CD103+ או CD11b+ (DCs), פלסמציטואיד DCs, אאוזינופילים, מונוציטים / תאים שמקורם במונוציטים, נויטרופילים, תאי T ו- B שמקורם בלימפואידים, תאי NK ותאי NKT, בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, אנו מתארים את ההכנה של הומוגנטים ריאה באמצעות שיטת הומוגניזציה של חרוזים, כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים שונים או כימוקינים בו זמנית על ידי מערכי חרוזים מרובים יחד עם ניתוח ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובה החיסונית הריאתית במסגרות מחלה אחרות, כגון מחלת ריאות זיהומית או מחלה אלרגית.

Introduction

הריאות הן איבר מחסום, חשוף לסביבה החיצונית, ולכן הם מקבלים כל הזמן אתגרים אימונולוגיים כגון פתוגנים ואלרגנים¹. הפעלת תאי חיסון תושבי ריאה וחדירת תאי חיסון מהפריפריה נדרשים כדי לנקות פתוגנים מהסביבה הריאתית. בנוסף, תאי מערכת החיסון המתגוררים בריאות שומרים על סבילות לחיידקים קומנסליים, מה שמרמז על כך שתאים אלה ממלאים תפקיד בסילוק פתוגנים ובשמירה על הומאוסטזיס¹. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים הם בין תאי מערכת החיסון הזקיף המתגוררים בריאה החשים פתוגנים באמצעות קולטני זיהוי תבניות ומנקים פתוגנים אלה על ידי פאגוציטוזה². תאים דנדריטיים תושבי ריאות מגשרים על התגובה החיסונית המולדת והנרכשת באמצעות ....

Protocol

כל הפרוטוקולים והנהלים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מערב וירג'יניה. העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים ספציפיים בוויבריום באוניברסיטת מערב וירג'יניה.

1. הכנת פתרונות

1. הכינו חיץ פרפוזיה (מלח חצוב פוספט, PBS). יש להשתמש בכ-10 מ"ל של PBS קר כקרח לכל עכבר.
2. הכן מדיום תאי ריאה/חיץ FACS. מאגר FACS מכיל PBS בתוספת 1% סרום בקר עוברי (FBS). שמור על הקור הבינוני במשך כל התהליך של כריתה והעברה של הריאות. יש להכין כ-8 מ"ל לכל דגימת ריאות. הכינו חיץ בינוני/FACS טרי לפני הניסויים.
3. הכן מאגר דיסוציאציה לבידוד של תא בודד. Buffer מכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגןאז D ו-200 מיקרוגרם/מ"ל DNase....

Results

לאחרונה דיווחנו כי אינדוקציה של שבץ איסכמי בעכברים משנה את הרכב תאי החיסון של הריאות¹¹. באופן ספציפי, איסכמיה מוחית חולפת הגדילה את האחוזים של מקרופאגים, נויטרופילים ו- CD11b+ DCs, תוך הפחתת אחוזים של תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B, תאי NK ואאוזינופילים בתא הריאתי. יתר על כן, שינויים תאיים התאימו לרמות מופחתות באופן משמעותי של כימוקינים מרובים בריאות. מתוארת כאן שיטה לבידוד וזיהוי של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בתא הריאה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן היו מעכברים שעברו אינדוקציה של tMCAO וניתוח בוש.......

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים זיהוי של סוגי תאי חיסון הריאה וביטוי של כימוקינים או ציטוקינים באותו עכבר. אם רוצים מחקר היסטופתולוגיה, ניתן להסיר אונה בודדת ולתקן אותה למטרה זו לפני שממשיכים לשלבי הבידוד של התא הבודד. מגבלה אחת של שיטה זו היא שגישה זו עשויה שלא להתאים במסגרות מחלה מסוימות אם השינוי בהרכב תאי החיסון והביטוי של כימוקינים ו/או ציטוקינים צפויים להתחלק באופן לא שווה בין אונות שונות של הריאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים, כגון שחפת Mycobacterium, מראים נטייה להדבקת אונות מסוימות של הריאה

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, שיבוט RA3-6B2	Biolegend	103212	1:200 דילול
חרוזים 3 מיקום הומוגנייזר חרוזים	Benchmark Scientific	D1030	הומוגנייזר רקמות
CCR2-BV421, שיבוט SA203G11	Biolegend	150605	1:200 דילול
CD103-BV421, שיבוט 2E7	Biolegend	121422	1:200 דילול
CD11b-PE/Cy7, שיבוט M1/70	Biolegend	101216	1:400 דילול
CD11c-PE/Cy7, שיבוט N418	Biolegend	117318	1:200 דילול
CD11c-Percp/Cy5.5, שיבוט N418	Biolegend	117328	1:200 דילול
CD4-BV421, שיבוט GK1.5	Biolegend	100443	1:200 דילול
CD45-FITC, שיבוט 30-F11	Biolegend	103108	1:200 דילול
CD64-APC, שיבוט X54-5/7.1	Biolegend	139306	דילול 1:200
CD8-PE, שיבוט 53-6.7	Biolegend	100708	דילול 1:800
קולגנאז D	Sigma Aldrich	11088882001	רכיב במאגר הדיסוציאציה
צינור מכסה בורג חרוטי	ThermoFisher	02-681-344	צינור להומוגניזציה של רקמות
DNase I	Sigma Aldrich		10104159001 רכיב במאגר הדיסוציאציה
בלוק Fc CD16/32 נוגדן Biolegend		101320	1:100 דילול
genlteMACS דיסוציאטור	Miltenyi Biotec	130-093-235	השוואה של עיכול ריאות עם או בלי דיסוציאטור מכני
gentleMACS C צינורות	Miltenyi Biotec	130-093-237	שפופרת לפירוק רקמות עם דיסוציאטור genlteMACS
עצירת מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטיל	ThermoFisher	78442	רכיב במאגר ההומוגניזציה
מוניטור דופלר לייזר		Moor MOORVMS-LDF	ניטור זרימת הדם במהלך tMCAO
LEGENDplex פאנל כימוקין פרו דלקתי	Biolegend	740451	מערך חרוזי מולטיפלקס
LIVE/DEAD ניתן לתיקון כתם קרוב ל-IR	ThermoFisher	L34976	השתמש להרחקת תאים מתים במהלך ניתוח זרימה ציטומטרי
Ly6C-PE, שיבוט HK1.4	Biolegend	128008	דילול 1:800
Ly6G-BV510, שיבוט 1A8	Biolegend	127633	1:200 דילול
MCAO תפר L56 לשימוש חוזר 6-0 בינוני	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, שיבוט M5/114.15.2	Biolegend	107636	דילול
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, שיבוט PK136	Biolegend	108728	דילול 1:200
Siglec F-PE, שיבוט E50-2440	BD Biosciences	552126	דילול 1:200
חוט תפר משי, גודל 6/0	Fine Science Tools	18020-60	tMCAO
SomnoSuite מערכת הרדמה	Kent Scientific	SS-01	הרדמת עכבר עבור tMCAO
TCRb-BV510, שיבוט H57-897	Biolegend	109234	1:200 דילול
חרוזי זירקוניה/סיליקה, 2.3 מ"מ	Biospec	11079125z	חרוזים להומוגניזציה של רקמות