מאמר שיטה

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

DOI:

10.3791/61359

⸱

24 ביוני 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרחבות תאי מערכת החיסון, הפעלתם וסחרם לריאות, הנשלטים על ידי ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים מרובים, עשויים להשתנות על-ידי פגיעה מוחית חמורה. עדות לכך היא העובדה כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים שסבלו משבץ איסכמי. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש באנליזה ציטומטרית של זרימה צבעונית כדי לזהות 13 סוגים של תאי חיסון בריאות של עכברים, כולל מקרופאגים אלוואולריים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, תאים דנדריטיים CD103+ או CD11b+ (DCs), פלסמציטואיד DCs, אאוזינופילים, מונוציטים / תאים שמקורם במונוציטים, נויטרופילים, תאי T ו- B שמקורם בלימפואידים, תאי NK ותאי NKT, בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, אנו מתארים את ההכנה של הומוגנטים ריאה באמצעות שיטת הומוגניזציה של חרוזים, כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים שונים או כימוקינים בו זמנית על ידי מערכי חרוזים מרובים יחד עם ניתוח ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובה החיסונית הריאתית במסגרות מחלה אחרות, כגון מחלת ריאות זיהומית או מחלה אלרגית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאות הן איבר מחסום, חשוף לסביבה החיצונית, ולכן הם מקבלים כל הזמן אתגרים אימונולוגיים כגון פתוגנים ואלרגנים1. הפעלת תאי חיסון תושבי ריאה וחדירת תאי חיסון מהפריפריה נדרשים כדי לנקות פתוגנים מהסביבה הריאתית. בנוסף, תאי מערכת החיסון המתגוררים בריאות שומרים על סבילות לחיידקים קומנסליים, מה שמרמז על כך שתאים אלה ממלאים תפקיד בסילוק פתוגנים ובשמירה על הומאוסטזיס1. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים הם בין תאי מערכת החיסון הזקיף המתגוררים בריאה החשים פתוגנים באמצעות קולטני זיהוי תבניות ומנקים פתוגנים אלה על ידי פאגוציטוזה2. תאים דנדריטיים תושבי ריאות מגשרים על התגובה החיסונית המולדת והנרכשת באמצעות הצגת אנטיגן3. בנוסף, תאי מערכת החיסון המולדת המקומית המופעלים מייצרים ציטוקינים וכימוקינים המגבירים את התגובה הדלקתית ומעוררים את חדירתם של תאי מערכת החיסון כגון מונוציטים, נויטרופילים ולימפוציטים לריאות1. שבץ איסכמי הוכח כמשנה חסינות מערכתית ומוביל לרגישות מוגברת לזיהום ריאתי; עם זאת, מחקרים מעטים העריכו את התא הריאתי לאחר שבץ איסכמי, אם כי כמה מחקרים בחנו אותו במהלך מצבים דלקתיים 4,5,6,7,8,9. מטרת השיטות המתוארות כאן היא לקבוע בו זמנית את הפתולוגיה של הריאות, את הרכב תאי החיסון ואת רמות הביטוי של ציטוקינים וכימוקינים בריאות כדי להעריך שינויים בתא הריאתי ולהעריך שינויים פוטנציאליים בתגובה החיסונית הריאתית בעקבות התקף איסכמי.

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקבלת תרחיפים של תאים בודדים מהריאות של העכברים כדי לזהות 13 סוגים של תאים חיסוניים. פרוטוקול זה מבוסס על עיכול רקמות עם קולגן D ללא צורך בדיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול להכנת הומוגנטים של רקמות שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים או כימוקינים שונים באמצעות מערכי חרוזי מולטיפלקס מבוססי ציטומטריה זורמת. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות של שבץ איסכמי על חסינות ריאתית וניתן להשתמש בו גם במודלים אחרים של מחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים והנהלים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מערב וירג'יניה. העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים ספציפיים בוויבריום באוניברסיטת מערב וירג'יניה.

1. הכנת פתרונות

  1. הכינו חיץ פרפוזיה (מלח חצוב פוספט, PBS). יש להשתמש בכ-10 מ"ל של PBS קר כקרח לכל עכבר.
  2. הכן מדיום תאי ריאה/חיץ FACS. מאגר FACS מכיל PBS בתוספת 1% סרום בקר עוברי (FBS). שמור על הקור הבינוני במשך כל התהליך של כריתה והעברה של הריאות. יש להכין כ-8 מ"ל לכל דגימת ריאות. הכינו חיץ בינוני/FACS טרי לפני הניסויים.
  3. הכן מאגר דיסוציאציה לבידוד של תא בודד. Buffer מכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגןאז D ו-200 מיקרוגרם/מ"ל DNase I בתמיסת המלח המבוצרת (HBSS) של האנק. יש להכין טרי מתמיסת הציר (100 מ"ג/מ"ל קולגן D ו-10 מ"ג/מ"ל DNase I) לפני הניסויים. יש צורך בכ-6 מ"ל לכל דגימת ריאות. יש לוודא שהמאגר מגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. הכן חיץ הומוגניזציה להומוגניזציה של רקמת הריאה. Buffer מכיל PBS וקוקטייל מעכב חלבון ופוספטאז 1x (מלאי = 100x). יש להכין טרי לפני הניסויים. שמור על החיץ קר במהלך כל תהליך ההומוגניזציה. כ-200 μL של החיץ מספיקים להומוגניזציה של אונה ימנית אחת של הריאות.

2. חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (tMCAO)

הערה: הליכים עבור tMCAO באמצעות החדרת monofilament לעורק המוח האמצעי תועדו בפירוט בעבר10. בניסויים אלה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 8 עד 12 שבועות, במשקל 25-30 גרם.

  1. בקצרה, יש לתת 2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקום לעכברים לפני הניתוח. הרדימו עמוק את העכברים בתא אינדוקציה באמצעות 5% איזופלורן. אשר הרדמה עמוקה בשיטת צביטה בבוהן. לשמור על הרדמה עם 1-2% isoflurane במהלך הניתוח באמצעות חרוט האף. שמור על טמפרטורת הגוף ב 36.5 - 38 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך על ידי הנחת שמיכה חמה מתחת לעכברים. כל כלי הניתוח צריכים להיות מעוקרים אוטומטית יום לפני הניתוח.
  2. לגלח ולהכין את העור על הצוואר הגחוני באמצעות 70% אתנול ואחריו פילינג כלורהקסידין. יש לתת באופן תת עורי 2 מ"ג/ק"ג בופיוואקאין מעל אזור החתך לפני ביצוע החתך הראשון. השתמשו במשחת עיניים כדי לכסות את העיניים כדי למנוע יובש. בצע חתך בצוואר בקו האמצע. משכו בעדינות הצידה רקמות רכות סביב קנה הנשימה.
  3. זהה את עורק הצוואר המשותף השמאלי ואת עורק הצוואר החיצוני.
  4. יש למרוח תפר זמני (גודל 6/0) על עורק הצוואר המשותף כדי לבלום את זרימת הדם. בצע חתך בעורק הצוואר החיצוני.
  5. הכנס מונופילמנט מצופה גומי סיליקון (גודל 6-0) לעורק הצוואר החיצוני, ולאחר מכן קדם את המונופילמנט לעורק המוח האמצעי. השאירו את המונופילמנט בעורק המוח האמצעי למשך 60 דקות (חסימה).
  6. עקוב אחר קצב זרימת הדם באמצעות זרימת דופלר לייזר. ירידה בקצב הזרימה לעורק המוח האמצעי שהוא > 80% מצביעה על חסימה מוצלחת.
  7. לאחר 60 דקות של חסימה, הסר את monofilament כדי לאפשר את reperfusion להתרחש. סגרו את החתך.
  8. בעכברים המופעלים על ידי בושה, בצע שלבים 2.1-2.6 ללא החדרת המונופילמנט. בעכברים אלה, קצב זרימת הדם צריך להישאר יציב במהלך ההליך כולו.
  9. עקוב אחר העכברים מדי יום ומדוד את הליקויים הנוירולוגיים באמצעות קריטריונים סטנדרטיים לציון11. 0 – ללא גירעון נוירולוגי; 1 – נסוג forepaw contralateral כאשר מורם על ידי הזנב; 2- עיגולים אל contralateral כאשר מורם על ידי הזנב; 3- נפילה לקונטרלטרל תוך כדי הליכה; 4 – לא הולך באופן ספונטני או הוא בתרדמת; 5 – מת.
  10. לספק זריקות תת עוריות של מלח רגיל משכך כאבים (meloxicam, 2 מ"ג / ק"ג) כל 24 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח.
  11. יש לבודד את הריאות 24 ו-72 שעות לאחר tMCAO לצורך ניתוח במורד הזרם.

3. קצירת רקמות הריאה

  1. הרדמה עמוקה של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין. אשר הרדמה עמוקה בשיטת צביטה בבוהן.
  2. כדי לבצע את כל הגוף זלוף שריר הלב12, להצמיד את העכבר לפלטפורמה כירורגית פרווה רטובה עם 70% אתנול כדי להפחית את הפצת הפרווה לתוך חלל הגוף. השתמש מספריים דיסקציה עדינים כדי לבצע חתך רוחבי בבטן caudal ולאחר מכן חתך קו האמצע של הצפק, עצירה בחלל החזה לפני פירסינג הסרעפת.
    1. אין לחתוך דרך השריר/להסתתר לתוך חלל הצפק ואין להמשיך את החתך מעבר לבטן.
  3. יש להפסיק את החתך ברגע שמגיעים לחלל בית החזה לפני ניקוב הסרעפת. היזהרו שלא לפגוע בלב ובריאות שעלולים לפגוע באיכות הזליפה או בהתאוששות התאים
  4. באמצעות מספריים עדינים לבצע חתך בקו האמצע של הצפק לעצור בחלל החזה לפני פירסינג הסרעפת.
  5. תפסו את העכבר בקצה הדיסטלי של עצם החזה באמצעות מלקחיים והתרוממו כלפי מעלה תוך כדי חיתוך דרך הסרעפת תוך הקפדה שלא לפגוע בלב, בריאות או בכלי הדם. ברגע שהאיברים נראים לעין עושים חתך דרך כלוב הצלעות ומפרידים ומצמידים בחזרה את מארז הצלעות כך שהלב והריאות חשופים לחלוטין.
  6. בזהירות לעשות חתך קטן באטריום הימני ליד קשת אבי העורקים. זה ישמש כיציאה לזילוף.
  7. מיד לאחר מכן, הכנס בעדינות מחט של 25 גרם x 5/8 המחוברת למזרק מלא ב-10 מ"ל של PBS קר לתוך המשטח העליון הדיסטלי של החדר השמאלי. היזהר לא להחדיר דרך מחיצת החדר לתוך החדר הימני. מחט צריך להיות מוכנס בקושי לחדר השמאלי.
    הערה: אם מחיצת החדר מנוקבת, הנוזל ימהר החוצה מאפו של העכבר. פעולה זו תפחית את איכות הזליפה ותגרום לאובדן תאים.
  8. אם תרצה, ניתן להשתמש במהדק כדי להחזיק את המחט בבטחה במקומה בחדר השמאלי במהלך הזלוף.
  9. בהתמדה אך בעדינות לדחוף 10 מ"ל של PBS קר לתוך הלב. רקמת העכבר צריכה להתחיל לחלחל ולנקות את הדם כיציאת נוזלים מהאטריום הימני.
    1. לדחוף אליקוט שני של 10 מ"ל של PBS עד שיתרחש אישור דם מספיק. לכבד יהיה מראה חום בהיר והריאות יעברו מצבע ורוד אדמדם לצבע לבן ברובו.
  10. באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, הסר בזהירות את כל הרקמות שמסביב כולל הלב, קנה הנשימה, הוושט, התימוס, רקמת החיבור, בלוטות הלימפה והסימפונות הגדולים.
  11. הפרידו את אונות הריאה הבודדות והניחו את האונות בצלחת פטרי על קרח המכילה אליקוט של 1-2 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים.

4. הומוגניזציה של רקמת ריאה למערכי חרוזים מולטיפלקס באמצעות הומוגנייזר חרוזים

  1. יש לצנן מראש צינור מכסה בורג חרוטי 2 מ"ל המכיל 3 חרוזי זירקוניה/סיליקה סטריליים בקוטר 2.3 מ"מ. הוסף 200 μL של חיץ הומוגניזציה קר לצינור.
  2. שוקלים את האונה, מעבירים את האונה לצינור החרוטי המצונן מראש המכיל את החרוזים ואת מאגר ההומוגניזציה.
    הערה: כ-50-100 מ"ג של רקמה הומוגנית ב-200 μL של חיץ יספיקו לזיהוי ביטוי ציטוקינים וכימוקין בדגימה.
    1. הומוגניות האונה באמצעות הומוגנייזר מבוסס חרוזים (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך 2 דקות.
    2. ודא שהרקמה הומוגנית לחלוטין. הגדל את הזמן במידת הצורך.
  3. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה של הצינור במיקרו-צנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) ברזולוציה של 15,870 x גרם למשך 3 דקות.
  4. העבירו את הסופרנאטנטים למיקרו-צינורית מקוררת מראש של 1.5 מ"ל.
  5. יש להניח את הדגימה ישירות על קרח לשימוש מיידי או לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי. הימנעו ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.

5. דיסוציאציה של רקמת הריאה ובידוד תאים בודדים

  1. שפכו את המדיום של תאי הריאה, של אונות הריאה הנותרות כדי למנוע דילול של מאגר הדיסוציאציה. לאחר מכן, הכנס בזהירות מזרק 1 מ"ל עם 25G ו 5/8 מחט המכילה 1 מ"ל של חיץ דיסוציאציה לתוך רקמת הריאה.
  2. מזריקים שברים קטנים (בערך 1/4עד 1/5ת') של מאגר הדיסוציאציה לכל אונת ריאה ומנפחים בעדינות.
    הערה: רוב החיץ ימהר לצאת זמן קצר לאחר ניפוח מכיוון שהאונה נכרתה.
  3. חזור על הזרקת מאגר דיסוציאציה 1-2x.
  4. לדגום את אונות הריאות עם חיץ דיסוציאציה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. טחנו דק את אונות הריאה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים עדינים.
  6. מעבירים את חתיכות הריאה הטחונות עם חיץ הדיסוציאציה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.  יש להוסיף עם מאגר דיסוציאציה נוסף לסך של 6 מ"ל. מערבולת במרץ במשך דקה אחת.
  7. לדגום את הדגימה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבולת במרץ כל 7-8 דקות.
  8. לאחר 45 דקות של דגירה, מערבלים את הדגימה במרץ למשך דקה אחת לקבלת תוצאות אופטימליות.
  9. יש לנתק עוד יותר את הדגימה על ידי מעבר דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר כדי להסיר שאריות של רקמת חיבור ורקמת ביניים.
  10. צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 380 x גרם, להשליך את supernatant.
  11. הוסף 5 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים לדגימה. השהה את כדור התא על ידי מערבולת עדינה.
  12. צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 380 x גרם, להשליך את supernatant.
  13. הוסף 1 מ"ל של מדיום תאי ריאה קרים. השהה את כדור התא על ידי מערבולת עדינה.
  14. עוברים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, וסופרים תאים.

6. ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור נישת תאי חיסון הריאה

  1. זרעים 1-2 x 106 תאים / נוגדנים מוגדרים לתוך צלחת תחתונה עגולה היטב 96 (3 סטים בסך הכל). צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  2. יש לתלות את כדור התא ב-50 μL של PBS קר המכיל כתם חי/מת הניתן לתיקון. הכינו את הכתם בהתאם להוראות היצרן.
  3. דגירה של התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  4. החזירו את גלולת התא עם 25 μL של חיץ FACS קר המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן CD16/32 נגד עכבר. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  5. הוסף 25 μL של מאגר FACS קר המכיל שילובי נוגדנים המפורטים בטבלה 1 לתאים. מערבבים בפיפטציה עדינה.
    הערה: הנפח הכולל של מאגר FACS עבור צביעת הנוגדנים הוא 50 μL. לכן, בעת הכנת תערובת מאסטר של נוגדנים ב 25 μL, ריכוז הנוגדנים צריך להיות כפול הריכוז הסופי.
  6. דגירה של התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  7. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  8. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. העבר לצינור FACS בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל פוליסטירן המכיל 150 μL של מאגר FACs נוסף. נתח את הדגימה באופן מיידי באמצעות ציטומטר זרימה.
    הערה: קיבוע תאים באמצעות השלבים הבאים מאפשר לנתח דגימות מאוחר יותר.
  9. לאחר שלב 6.7., השהה את הדגימה עם 100 μL של 1% paraformaldehyde ב- PBS.
  10. דגירה של הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  11. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 830 x גרם. השליכו סופרנאטנטים.
  12. השהה את התאים עם 100 μL של חיץ FACS קר. אחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור. לנתח את המדגם בתוך 72 שעות.

7. מערכי חרוזים מולטיפלקס לזיהוי ציטוקינים וכימוקין

הערה: לוחות מולטיפלקס של כימוקין פרו-דלקתי ודלקת הזמינים באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) שימשו לקביעת הביטוי של כימוקינים וציטוקינים בריאות לאחר אינדוקציה של tMCAO בהתאם לפרוטוקול היצרן, שתואר בפירוט13.

  1. בקצרה, הפשירו את האנליטים על הקרח אם הם אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לאחר הומוגניזציה של רקמות. צנטריפוגה של הדגימה ב 590 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי להסיר כל רקמה שיורית.
  2. צור עקומה סטנדרטית על ידי דילול סדרתי של הקוקטייל הסטנדרטי (C7) שנמצא בריכוז ידוע של 10 ננוגרם/מ"ל ל-7 תקנים (C1-6) כאשר התקן האחרון הוא חיץ בדיקה בלבד (C0).
  3. לאחר שכל הריאגנטים התחממו לטמפרטורת החדר, הוסיפו 25 μL מכל תקן ו-25 μL של חיץ בדיקה לצלחת V תחתית 96 באר.
  4. לכל דגימה היטב, הוסף 25 μL של הומוגנט ריאה (אנליט) ו 25 μL של חיץ בדיקה לצלחת V תחתית 96 באר
  5. מערבבים במרץ את החרוזים המצופים מראש, ואז מוסיפים 25 μL של חרוזים מצופים מראש לכל אחת מהבארות הסטנדרטיות והדוגמיות.
  6. אטמו את הצלחת והגנו מפני אור על ידי כיסוי בנייר כסף. נערו את הצלחת ב-110 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להוסיף 200 מיקרו-ליטר של מאגר כביסה ב-1x (תמיסת המלאי היא פי 20, יש לדלל עד פי 1 עם מים). לדגור במשך דקה אחת.
  8. צנטריפוגה ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להשהות את התקן ולדגום עם נוגדנים לזיהוי 25 μL.
  9. אטמו וכיסו את הצלחת כדי להגן מפני אור. יש לנער את הצלחת ב-110 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. יש להוסיף 25 μL של סטרפטאבידין-פיקוריתרין (SA-PE) לכל תקן ולדגום היטב.
  11. אטמו וכיסו את הצלחת כדי להגן מפני אור. יש לנער ב-110 סל"ד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. סובבו את הצלחת ב 230 x גרם במשך 5 דקות. יש להשעות את התקן והדגימות במאגר כביסה אחד.
  13. העבר לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל FACS המסומן היטב המכיל 150 μL נוספים של מאגר שטיפה 1x.
  14. קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות של אות PE עבור התקנים והדגימות באמצעות ציטומטר זרימה.
  15. בנה עקומה סטנדרטית עבור כל כימוקין וציטוקין באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת (MFI) של PE כנגד הריכוזים שנקבעו מראש.
  16. קבע את הריכוז של כל כימוקין וציטוקין באמצעות העקומה הסטנדרטית וה- MFI מכל דגימה. לוח המולטיפלקס מספק תוכנת ניתוח נתונים שניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הריכוז של כל אנליט. משקל האונה האפית/עליונה משמש לקביעת ריכוז הציטוקינים או הכימוקין למיליגרם רקמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה דיווחנו כי אינדוקציה של שבץ איסכמי בעכברים משנה את הרכב תאי החיסון של הריאות11. באופן ספציפי, איסכמיה מוחית חולפת הגדילה את האחוזים של מקרופאגים, נויטרופילים ו- CD11b+ DCs, תוך הפחתת אחוזים של תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B, תאי NK ואאוזינופילים בתא הריאתי. יתר על כן, שינויים תאיים התאימו לרמות מופחתות באופן משמעותי של כימוקינים מרובים בריאות. מתוארת כאן שיטה לבידוד וזיהוי של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בתא הריאה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן היו מעכברים שעברו אינדוקציה של tMCAO וניתוח בוש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים זיהוי של סוגי תאי חיסון הריאה וביטוי של כימוקינים או ציטוקינים באותו עכבר. אם רוצים מחקר היסטופתולוגיה, ניתן להסיר אונה בודדת ולתקן אותה למטרה זו לפני שממשיכים לשלבי הבידוד של התא הבודד. מגבלה אחת של שיטה זו היא שגישה זו עשויה שלא להתאים במסגרות מחלה מסוימות אם השינוי בהרכב תאי החיסון והביטוי של כימוקינים ו/או ציטוקינים צפויים להתחלק באופן לא שווה בין אונות שונות של הריאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים, כגון שחפת Mycobacterium, מראים נטייה להדבקת אונות מסוימות של הריאה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH P20 GM109098 ותוכנית פרס החדשנות מפראספרו לאדווין וואן. ניסויי ציטומטריה של זרימה בוצעו במתקן ציטומטריה של זרימה WVU ומתקן ליבה של תא יחיד, הנתמך על ידי מענקי NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ו- P20 GM103434.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B220-APC, שיבוט RA3-6B2Biolegend1032121:200 דילול
חרוזים 3 מיקום הומוגנייזר חרוזיםBenchmark ScientificD1030הומוגנייזר רקמות
CCR2-BV421, שיבוט SA203G11Biolegend1506051:200 דילול
CD103-BV421, שיבוט 2E7Biolegend1214221:200 דילול
CD11b-PE/Cy7, שיבוט M1/70Biolegend1012161:400 דילול
CD11c-PE/Cy7, שיבוט N418Biolegend1173181:200 דילול
CD11c-Percp/Cy5.5, שיבוט N418Biolegend1173281:200 דילול
CD4-BV421, שיבוט GK1.5Biolegend1004431:200 דילול
CD45-FITC, שיבוט 30-F11Biolegend1031081:200 דילול
CD64-APC, שיבוט X54-5/7.1Biolegend139306דילול 1:200
CD8-PE, שיבוט 53-6.7Biolegend100708דילול 1:800
קולגנאז DSigma Aldrich11088882001רכיב במאגר הדיסוציאציה
צינור מכסה בורג חרוטיThermoFisher02-681-344צינור להומוגניזציה של רקמות
DNase ISigma Aldrich10104159001 רכיב במאגר הדיסוציאציה
בלוק Fc CD16/32 נוגדן Biolegend1013201:100 דילול
genlteMACS דיסוציאטורMiltenyi Biotec130-093-235השוואה של עיכול ריאות עם או בלי דיסוציאטור מכני
gentleMACS C צינורותMiltenyi Biotec130-093-237שפופרת לפירוק רקמות עם דיסוציאטור genlteMACS
עצירת מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטילThermoFisher78442רכיב במאגר ההומוגניזציה
מוניטור דופלר לייזרMoor MOORVMS-LDFניטור זרימת הדם במהלך tMCAO
LEGENDplex פאנל כימוקין פרו דלקתיBiolegend740451מערך חרוזי מולטיפלקס
LIVE/DEAD ניתן לתיקון כתם קרוב ל-IRThermoFisherL34976השתמש להרחקת תאים מתים במהלך ניתוח זרימה ציטומטרי
Ly6C-PE, שיבוט HK1.4Biolegend128008דילול 1:800
Ly6G-BV510, שיבוט 1A8Biolegend1276331:200 דילול
MCAO תפר L56 לשימוש חוזר 6-0 בינוניDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, שיבוט M5/114.15.2Biolegend107636דילול
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, שיבוט PK136Biolegend108728דילול 1:200
Siglec F-PE, שיבוט E50-2440BD Biosciences552126דילול 1:200
חוט תפר משי, גודל 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
SomnoSuite מערכת הרדמהKent ScientificSS-01הרדמת עכבר עבור tMCAO
TCRb-BV510, שיבוט H57-897Biolegend1092341:200 דילול
חרוזי זירקוניה/סיליקה, 2.3 מ"מBiospec11079125zחרוזים להומוגניזציה של רקמות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051(2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853(2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038(2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779(2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757(2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73(2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים