אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

Abstract

Culex quinquefasciatus הוא וקטור של מגוון רחב של מחלות המועברות בווקטור כגון מלריה עופות, וירוס הנילוס המערבי (WNV), דלקת המוח היפנית, דלקת המוח של הסוס המזרחי, פילאריאזיס הלימפה ודלקת המוח של סנט לואיס. ראוי לציין כי מלריה עופות מילאה תפקיד מרכזי בהכחדתם של מיני ציפורים אנדמיים רבים באי, בעוד WNV הפך למחלה חשובה המועברת על ידי וקטור בארצות הברית. כדי לקבל תובנה נוספת על ביולוגיה C. quinquefasciatus ולהרחיב את ארגז הכלים שלהם שליטה גנטית, אנחנו צריכים לפתח שיטות יעילות ובמחיר סביר יותר להנדסת גנום במין זה. עם זאת, כמה תכונות ביולוגיות ייחודיות יתושי Culex, במיוחד רפסודות הביצים שלהם, הקשו על ביצוע הליכי microinjection הנדרשים להנדסת גנום. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו פרוטוקול מיקרו-ייחוס עוברי ממוטב המתמקד בהפחתת המכשולים הטכניים הקשורים למאפיינים הייחודיים של יתושי Culex. נהלים אלה מדגימים שיטות אופטימליות לאיסוף ביצים, הפרדת רפסודות ביצים והליכי טיפול אחרים החיוניים למיקרו-לינג'ק מוצלח ב- C. quinquefasciatus. בשילוב עם טכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR/Cas9, הליכים אלה מאפשרים לנו להשיג מוטציות נבטים ספציפיות לאתר, יעילות ותודישתיות, הנדרשות לבצע הנדסת גנום מתקדמת ולפתח טכנולוגיות בקרה גנטית בווקטור המחלה החשוב, אך כיום אינו אמין.

Introduction

C. quinquefasciatus, הידוע בכינויו יתוש הבית הדרומי, הוא וקטור מוסמך של פתוגנים רבים כולל וירוס הנילוס המערבי (WNV), דלקת המוח היפנית, דלקת המוח של סנט לואיס ודלקת המוח של הסוס המזרחי. בפרט, מאז זוהה לראשונה בניו יורק בשנת 1999, WNV הפך למחלה וקטורית מרכזית ברחבי ארצות הברית היבשתית (ארה"ב) עם מעל 50,000 מקרים אנושיים שדווחו וכתוצאה מכך כ -2,300 מקרי מוות בין 1999 ל -2018^1, כמו גם מעל 4,500 מקרי סוסים שדווחו בין השנים 2008-2019². בנוסף, לפחות 23 מיני ציפורים שנמצאו בצפון אמריקה הושפעו מזיהומים ב-WNV עם לפחות 12 מינים המסווגים כבלתי הפיכים כתוצאה מ-WNV³. ההשפעה של WNV על אוכלוסיות אנושיות, סוסים ועופות נובעת מהתנהגות האכלה אופורטוניסטית של הווקטורים שלה. בדרך כלל, ציפורים הן המארחות העיקריות של WNV, ובני אדם וסוסים הם מארחים מקריים או ללא מוצא. כמה פתוגנים וקטור על ידי C. quinquefasciatus רק להדביק ציפורים כגון טפיל מלריה עופות, שריד פלסמודיום. בהוואי, C. quinquefasciatus הוא וקטור עיקרי של מלריה עופות וגרם להכחדתם של מיני ציפורים מקומיים רבים^4,5.

כדי לשלוט במחלות המועברות על ידי C. quinquefasciatus, חוקרים וסוכנויות בקרה וקטורים השתמשו בכלים נפוצים לבקרת אוכלוסיית יתושים כגון יישום קוטל חרקים⁶, עם זאת, שיטות אלה הן יקרות, לא ספציפיות למינים, ויש להם יעילות מוגבלת כמו עמידות לחומרי הדברה גבוהה באוכלוסיות C. quinquefasciatus רבים^6,7,8,9. טכניקות בקרה אחרות, כגון אסטרטגיות בקרת אוכלוסין מבוססות וולבצ'יהפותחו בשנים האחרונות^10,11, אבל עלויות הכושר הקשורות זיהום Wolbachia להגביל את ההיתכנות של גישה זו עבור וקטור זה¹². ישנן גם שיטות בקרה מבוססות גנטית שפותחו במינים אחרים של יתושים כגון Aedes aegypti^13,14, אנופלס גמביה¹⁵ ו אנופלס סטיבנסי¹⁶, כולל פיתוח יתושים עמידים לפתוגן^17,18,19, זה יכול להיות מפותח גם עבור C. quinquefasciatus אם הכלים הנדסת הגנום הנדרשים הם פותח עבור מין זה. עם זאת, ביולוגיה C. quinquefasciatus שונה מאוד מווקטורים אחרים של יתושים Aedes ו Anopheles אשר עשה את הפיתוח של טכנולוגיות גנטיות דומות קשה בווקטור זה. עם הופעתן של טכנולוגיות הנדסת גנום מבוססות CRISPR, הנדסת גנום מדויקת הפכה לטריוויאלית יותר ויותר, משתלמת ומסתגלת וכתוצאה מכך הובילה לפיתוח כלים גנטיים חדשניים במגוון רחב של מינים.

כדי ליצור מוטציות עם טכנולוגיות מבוססות CRISPR, תערובת של חלבון Cas9 ו- RNA מדריך סינתטי (sgRNA), המשלים את הלוצי הרצוי, הוא microinjected לתוך עוברים שלב טרום blastoderm. מאחר שנקבות C. quinquefasciatus מטילות את ביציהן בקבוצות המחוברות במבנה רפסודה צף (איור 1),בניגוד לתפיסת ביצים בודדות, תכונה של יתושי Aedes ו- Anopheles, מיקרו-יינות עוברים מסובכים יותר ויותר במין זה. זחלי קולקס מגיחים גם מהצד הצידה הצידי של כל ביצה, שנמצא במגע עם פני המים(איור 1),כך שכיוון הביצה לאחר המניפולציה חשוב במין זה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט המיועד למיקרו-הזרקה של חלבון Cas9 ו- sgRNA לעוברים C. quinquefasciatus. פרוטוקול זה תוכנן כדי להתאים תכונות ייחודיות לביולוגיה של Culex על מנת לשפר את הישרדות העובר ואת שיעורי מוטציית הגנום באמצעות שלבים מסוימים שהם המפתח לאיסוף ביצים בזמן והישרדות הביצים.

Protocol

1. ג. גידול מושבת קווינקפסיאטוס

1. הקימו מספר מושבות של בוגרי C. quinquefasciatus בכלובי מעונות באגים.
   הערה: המושבות סופקו על ידי ד"ר לורה הרינגטון באוניברסיטת קורנל²⁰. פרוטוקולים מפורטים לגידול יתושי קולקס ניתן למצוא בספרות אחרת²¹.
   1. לשמור על היתושים ב 25 ± 1 °C (50 °F) ב 30% לחות עם מחזור 12:12 שעות היום:לילה.
   2. ספק 20% תמיסת סוכר ad libitum על ידי החדרת מיכל תמיסת סוכר עם פתיל לתוך הכלוב או על ידי רווי כדורי צמר גפן עם תמיסת הסוכר והנחתו בתוך הכלוב.
2. אפשרו ליתושים להזדווג לפחות 3 ימים לפני האכלת הדם(איור 2A).

2. אוסף עוברי שלב טרום בלסטורם C. quinquefasciatus

1. לאחר 3-6 ימים לאחר ההסמכה, ספק לנקבות 1-2 מ"ל של ארוחת דם בקר ציטוט דרך קרום סינתטי מחומם לכ 40 °C (איור2B). ישנם גם פרוטוקולי האכלת דם חלופיים שניתן להשתמש בהם עבור יתושי קולקס (למשל, ראה ref²¹).
   הערה: C. quinquefasciatus ידוע בהעדפה לדם עופות. מעבדות מסוימות משתמשות בציפורים חיות או בדם עופות עבור מקור ארוחת הדם שלהם^21,22,23. עם זאת, מושבות ניתן לאמן / נבחר להאכיל על דם בקר או מכרסמים קטנים אם תכונה זו נבחרה במשך דורות מרובים.
   1. אפשר לנקבות לנוח לפחות 3 ימים לאחר האכלת הדם כדי לעבור אוגנזה והבשלת ביצים לפני גרימת oviposition לניסויים מיקרו-אכילים.
2. ביום של מיקרו-אנז'ים עובריים, צור oviposition עם מי oviposition חדורים אורגנית. מי Oviposition צריך להיעשות על ידי צואת ארנב מותססת (50 גרם / ליטר), דשא נרקב (4.5 גרם / ליטר), או מזון דגים (25 גרם / ליטר) במים במהלך 5 ימים או יותר^24,25.
3. הכניסו את ההויפוזפוזה לכלוב והכניסו את כל הכלוב למקום חשוך(איור 2C).
4. לאחר כל 30 דקות, לבדוק את הכוס עבור רפסודות ביצים.
   1. אם יש רפסודות ביצים, אספו את הרפסודות על ידי כך שתגרפו אותן עם מברשת צבע והניחו אותן על נייר סינון רטוב(איור 2D,E).

3. יישור של C. quinquefasciatus לפני blastoderm עוברי שלב

1. הפרד את הביצים מהרפסודות על ידי לחיצה על הרפסודה והקנטות של הביצים בנפרד באמצעות מברשת צבע ומלקחיים עדינים(איור 2E).
2. יישר ביצים בודדות על רצועה דקה של סרט דביק דו-צדדי המונח על החלק העליון של שקופית זכוכית(איור 2F).
3. בעת יישור, נסה לכוון את הצד הצידה של כל ביצה לאותו כיוון לנגישות קלה יותר.
   הערה: ניתן למצוא שיטה חלופית ליישור ביצה ללא סרט דביק דו צדדי בפרוטוקול מיקרו-ייחוס של עוברי Nasonia vitripennis שפורסם בעבר²⁶.
4. מכסים ביצים בתערובת שמן הילוקרבון.
   הערה: תערובת Halocarbon ניתן להכין מראש על ידי ערבוב בעדינות שני ריאגנטים הילוקרבון ומים (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : מים אולטרה-פורים) ולאחר מכן דגירה תערובת לילה ב 25^οC כדי להקל על רוויית מים של שמן halocarbon.

4. הכנת מחט למיקרו-טג'קציה

1. צור את מחטי זכוכית נימיות אלומינסיליות באמצעות פולר מיקרופיפט זכוכית.
   1. מניחים זכוכית נימית בוגרת לתוך מושך מחטים, לפי הוראות מדריך המשתמש של מושך המחטים.
      הערה: קוורץ ומחטים נימיות borosilicate ניתן להשתמש גם, אבל לניסוי זה, aluminosilicate הוא המועדף בגלל סבירות יחסית ועמידות.
   2. הגדר חום ל 516, מהירות ל 100, עיכוב ל 70, למשוך ל 97, ולחץ ל 500 על מושך המחט.
   3. הפעל את מושך המחט, בהתאם להוראות של מושך ולחזור לפי הצורך עבור מחטים נוספות.
      הערה: במהלך תהליך ההזרקה, מחטים לעתים קרובות להיות סתום או נשבר בטעות, ולכן, משיכת מחטים נוספות לניסוי אחד מומלץ מאוד.
2. שיפוע קצה המחט על ידי נגיעה עדינה בקצה המחט שנמשכה על צלחת שוחקת יהלום מסתובבת במשך סביב 10 s בזווית של 50°.
   הערה: שיפוע המחט פותח אותו כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך תוך יצירת קצה חד יותר לחדירה קלה יותר לתוך העובר. דוגמה למחט נכונה ניתן לראות במאמר הקודם²⁶.
3. חנות משכה ומחטים משופעות על ידי הטמעת אותם לתוך קווים של חימר של מודל בצלחת פטרי.
   הערה: כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר עבור טיפים מחט, מחטים צריך להיות משך טרי משופע קרוב ככל האפשר לזמן ההזרקה.

5. טעינת תערובת ההזרקה

1. הכן את תערובת ההזרקה המורכבת ריאגנטים שינוי גנום (למשל, 200 ng / μL sgRNA ותערובת 200 ng / μL Cas9), או פתרונות הזרקה מועדפים ולשמור אותו על קרח.
   הערה: תערובת זו יכולה להיות מוכנה בזמן ההמתנה ביצים להיות מוטל. פרטים נוספים על Cas9 וייצור sgRNA והכנה למיקרו-ינון ניתן למצוא בפרסומים קודמים^27,28,29,30.
2. לטעון 2 μL של תערובת הזרקה לתוך מחט הזרקה באמצעות קצה microloader.

6. הגדרת מיקרו-ערך

1. מניחים את מחט ההזרקה המלאה לתוך מיקרו-מניפולטור שהוקם מקושר למיקרו-נג'ר אלקטרוני.
2. מניחים את שקופית הזכוכית המכילה את הביצים המיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב.
3. באמצעות מיקרומניפולטור ומיקרוסקופ מורכב, ליישר את המחט כדי לכוון בקצה האחורי של העובר בזווית של 25-35°.

7. מיקרו-נסיגה עוברית (איור 2G)

1. בזהירות להכניס את המחט לתוך העובר ולהזריק את התערובת בכמות של כ -10% מנפח העובר (700-800 pL בהתאם לגודל הביצים).
   הערה: בעת הזרקה, הביצה צריכה להתנפח מעט, עם זאת, אם יותר מדי נוזל מוזרק, ביצים עלולות להתפוצץ, או נוזל ציטופלסמי עלול לדלוף החוצה.
2. להזריק סביב 20 ביצים בכל פעם ולאחר מכן להפסיק ולבצע הליכי התאוששות העובר.
   הערה: בעת הזרקה, יש סיכוי גבוה של מחטים או לסתום או לשבור. אם מתרחשת סתימה, אשר ניתן לקבוע על ידי חוסר נוזל הזרקה זורם דרך המחט, נסה גם לנקות את המחט עם הפונקציה הנקייה על microinjector אלקטרוני או לנסות לשדרג מחדש את המחט. אם אף אחד מהצעדים לא עובד, החלף במהירות למחט חדשה תוך הקפדה על כך שהביצים המוכנות יישארו לחות.

8. התאוששות העובר והבקוע

1. להשאיר את הביצים ללא הפרעה לפחות 5 דקות. תוך 20 דקות לאחר ההזרקה, הסירו בזהירות את שמן ההילה על ידי צחצוח קל עם מברשת צבע נקייה(איור 2H).
2. הרימו את הביצים בעדינות בעזרת מברשת צבע והכניסו אותן לכוס מים מזוקקים כפולה(איור 2I). יש להקפיד לשמור את הביצים על פני המים.
3. בדוק את הביצים מדי יום במשך 7 ימים לבקוע(איור 2J).
4. בצע נהלי גידול זחלים רגילים²¹.

9. הקרנה לשינוי גנום

1. מסך היתושים המוזרקים עבור פנוטיפים מוטנטיים באמצעות סטריאוטסקופ (איור 2K).
   1. אמת מוטציות שאין להן פנוטיפ שניתן לזהות בקלות, על ידי הגברת PCR, T7 Endonuclease I assay, ורצף על ידי תת-קלקולציה של אזור היעד³¹.
2. הגדר צלבים נוספים בין אנשים מוזרקים כדי לזהות מוטציות תורשתיות בתוך נבט.

Results

בניסויים שפורסמו בעבר שיטה זו שימשה ליצירת מוטציות סומטיות ונבטיות של גן קריטי להתפתחות פיגמנטציה בעיניים כהות, לבן (CPIJ005542)³⁰ (טבלה 1). CRISPR/Cas9 שנוצר מוטציות סומטיות נוצרו ציון על ידי הקרנה לאובדן פיגמנטציה בעיניים שלב pupal של אנשים מוזרקים (G₀). מוטציות סומטיות היו בדרך כלל נוכחים כמו פנוטיפים פסיפס שבו חלק אבל לא כל התאים יש פנוטיפ מוטציה. לדוגמה, מוטציות סומטיות של הגן הלבן הביאו לתערובת של ommatidia עם פנוטיפים חסרי פיגמנטציה ואלה עם פנוטיפ פיגמנטי wildtype³⁰. עם זאת, כאשר הייתה מוטציה נבטית של הגן הלבן, הדור הבא (G₁₎ירש את הפנוטיפ המלא של העיניים הלבנות. שיעורי המוטציה של נבטים נקבעו על ידי פסיפס משולב G₀ אנשים וניקוד עבור צאצאים עיניים לבנות לחלוטין (G₁). ניסויים אלה הביאו לשיעור הישרדות של 64% עד 82%, כמו גם שיעור הישרדות מוטגנזה סומטית של 37% עד 57% ושיעור מוטגנסיס של >61% נבטים(טבלה 1). על ידי מולטיפלקסינג sgRNAs למקד loci מרובים באותו גן, שיעורי mutagenesis סומטית חיידקים גדל כלפי מעלה עד 86% (טבלה 1). בנוסף, במשך דורות רבים, מניות הומוזיגוס קיימא של המוטנטים הלבנים נשמרו בהצלחה במעבדה.

איור 1: ג. רפסודת ביצים קווינקפסיאט ומורפולוגיה של ביצה אחת.
נופים צדדיים(B),וגחון(C)של רפסודות ביצים C quinquefasciatus. ג. נקבות קווינקפסיאטו מטילות את ביציהן כשהצד הקדמי הנפוח יותר נוגע בפני המים בעוד שהאצבעות האחוריות המחודדיות יותר הרחק מפני המים(D). A- 10; P- אחורי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: ציר הזמן ליצירת מוטציות C. quinquefasciatus על ידי מיקרו-נסיגה.
ציר הזמן של הכנת מושבת C. quinquefasciatus ואיסוף עוברים למיקרו-ערך (A-D). ביצים שנאספו מופרדות לאחר מכן(E)מיושרות באותו כיוון ומכוסות בשמן הילוקרבון(F). הביצים מוזרקות לאחר מכן(G)ומותר להן לנוח לפחות 5 דקות לפני הסרת שמן ההילה(H). הביצים מועברות למקור מים נקי(I)לבקוע(J)ומוקרנות עבור פנוטיפים מוטנטיים (K). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

		הישרדות			פסיפסיות סומטית (G0)			מוטגניזיס נבטים (G1)
sgRNA	#injected	♂	♀	סה"כ (%)	♂	♀	סה"כ (%)	מוטציות G1 (%)
wsgRNA-1	50	15	20	35(70)	7(47)	13(65)	20(57)	128(69)
wsgRNA-2	50	9	32	41(82)	3(33)	12(38)	15(37)	51(61)
wsgRNA-3	50	17	15	32(64)	7(41)	8(53)	15(47)	157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-2	50	7	16	23(46)	5(71)	12(75)	17(74)	123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-3	50	13	9	22(44)	10(77)	6(67)	16(73)	72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-3	50	17	10	27(54)	13(76)	8(80)	21(78)	101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3	50	11	10	21(42)	9(82)	9(90)	18(86)	149(86)

טבלה 1: שיעורי הישרדות ומוטציה של עוברים מוזרקים עם gRNAs יחיד ומולטיפלקס מיקוד לבן. הטבלה מודפסת מחדש עם הרשאה^{מ- 30}

Discussion

עם המאמצים האחרונים לייצר כלים מהונדסים גנטית לשליטה וקטורית יתושים, יש צורך לפתח ולייעל פרוטוקולי microinjection העובר עבור וקטורים נפוצים מחלת יתושים. למרות ששיטות פותחו עבור יתושי Aedes ו Anopheles, פרוטוקול שתוכנן במיוחד עבור Culex נחקר באופן מינימלי. באופן כללי ניתן לחלק פרוטוקולי הזרקת עוברים יתושים לשלושה שלבים כלליים: 1) איסוף והכנה של עוברים, 2) הזרקת עוברים, ו -3) התאוששות לאחר הזרקה. על מנת ליצור מוטציות בהצלחה, כל שלושת השלבים חייבים להיות מותאמים למין היעד. פרוטוקול שונה זה עבור מיקרו-הנדסה עוברית הוא ספציפי להנדסת גנום מוצלחת של יתושי קולקס.

מקסום אוסף העוברים הוא צוואר בקבוק נפוץ בפרוטוקולי מיקרו-נג'ק של העובר. על מנת להגדיל את מספר הביצים שנאספו בפרק זמן קצר, היתושים הוגבלו ממצע oviposition במשך 2-3 ימים לאחר ארוחת הדם. חשוב לציין כי C. quinquefasciatus נוטים להעדיף מקורות דם עופות לעומת מקורות יונקים או ממברנה האכלה עם דם יונקים. עם זאת, חוקרים רבים מתקשים להשיג מקור אמין של עופות חיים או דם עופות להאכלת דם, כך שמלאי המעבדה יכול להיות מותאם כדי להאכיל מקורות דם נגישים יותר. זה גם חיוני כדי להשתמש במים עשירים בחומרים מזינים עבור מצע oviposition כפי שהוא מספק רמזים oviposition עבור C. quinquefasciatus ורוב וקטורים אחרים Culex. ישנן שיטות רבות כדי לייצר מים עשירים בחומרים מזינים, אשר ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה בין מעבדות כדי להבטיח מספר מתאים של ביצים זמינים עבור microinjection. לדוגמה, בעוד שיטה זו הייתה המוצלחת ביותר עם צואת ארנב מותסס במים deionized במשך 5 ימים או יותר, חוקרים אחרים יש הצלחה רבה יותר עם דשא או מזון דגים כמקור התזונתי וחלקם אפילו עם מים מזוקקים²¹.

מאז יתושי קולקס להטיל קבוצות של ביצים רפסודות, איסוף ביצים הוא פשוט למדי. ביצים ניתן פשוט לאסוף על ידי גרף את כל הרפסודה עם מברשת צבע. הפרדת ביצים היא מורכבת יותר, אבל חיוני להזרקה מוצלחת. ביצים ניתן להפריד בזהירות מן הרפסודה על ידי הפעלת לחץ עדין כלפי מטה בין ביצים עם מברשת צבע או מלקחיים. עם קצת תרגול, משתמשים מרובים היו מסוגלים באופן אמין להפריד ביצים בודדות רפסודות ביצים. לאחר הפרדת כל ביצה, הביצים מיושרות באותו כיוון על סרט דביק דו צדדי, אשר מייצב את הביצים במהלך microinjection. ביצים מוזרקות לקצה האחורי המחודד ותוספת שמן הילוקרבון שומרת על הביצים לחות במהלך מניפולציה.

כדי להגביל את נזק העובר במהלך microinjection, מחטי הזרקה צריך להיות של כוח מתאים משופע בזווית מתאימה. למחטים אלומינוסיליות משופעות במשך 10 שניות בזווית של 50 מעלות היו התוצאות הטובות ביותר, אבל מחטי בורוסיליקט וקוורץ עשויות גם הן לעבוד, למרות שהן עשויות להיות פחות עמידות ויקרות יותר. בנוסף, שיפוע מחט תקין מאפשר זרימה טובה יותר של תערובות Cas9 ו- sgRNA ויוצר נקודה חדה יותר לחדירה קלה יותר לעובר. במקרים רבים, שיפוע הוא גם דרך יעילה לתקן במהירות מחטים סתומות במקום לבזבז את הזמן והמאמץ להחליף מחטים סתומות.

לאחר ההזרקה, ביצים צריכות להישאר ללא הפרעה לפחות 5 דקות עם שמן halocarbon מוסר מיד לאחר מכן על ידי צחצוח בעדינות משם עם מברשת צבע נקייה. לאחר הסרת שמן halocarbon, ביצים מוזרקות ניתן להציב במים כדי לבקוע, אשר מתרחשת בדרך כלל בתוך 3 ימים לאחר הזרקה. עם תרגול ומספר מספיק של ביצים, פרוטוקול זה יכול להשיג מוטציות סומטיות ונבטים עקביים ב- C. quinquefasciatus והוא רב-תכליתי מספיק כדי שניתן יהיה להתאים אותו בקלות ליתושי קולקס אחרים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
9 גרם לחיות מחמד מפלסטיק שקוף	Karat	C-KC9	גידול חרקים ואיסוף ביצים
צינורות נימי זכוכית אלומינוסיליקט 1 מ"מ (קוטר חיצוני) X 0.58 מ"מ (קוטר פנימי)	ניתן		להשתמש גם במחטי מיקרו-הזרקה, בורוסיליקט וקוורץ אך העדפנו אלומינוסיליקט
	חברת סרום דם קולורדו	31025	למושבה לקח כמה דורות להסתגל למקור הדם הזה. סביר להניח שמקורות דם אחרים מתאימים באותה מידה. ראה הערות פרוטוקול על בחירת מקור דם.
Bugdorm	Bugdorm	4F2222	כלוב גידול חרקים
Cas9 חלבון עם NLS	PNABio	CP01	מיקרו-הזרקה
תרכובת מיקרוסקופ	אולימפוס BX41		מיקרו-הזרקה, להזרקת עובר
צלחת שוחקת יהלום (גדלי קצה 0.7u עד 2.0u)	Sutter Instruments	104E	מיקרו-הזרקה, לשימוש עם
מזוקק ללא DNase/RNase משופע מים	Invitrogen	10977-015	מיקרו הזרקה
דו צדדית קלטת	סקוטש	B084NVQGXD	מיקרו הזרקה, יישור עובר
Femtojet 4x או 4i מיקרו-מזרק לתכנות	Eppendorf		מיקרו הזרקה
Femtotips Microloader טיפים	פישר מדעי	E5242956003	מיקרו-הזרקה
מסנן נייר	Whatman	1001-090	מיקרו-הזרקה, אוסף עוברים
מברשת צבע עדינה	ZEM	2595	מיקרו-הזרקה, יישור עוברים
שמן הלוקרביון 27	סיגמא-אולדריץ'	H8773	מיקרו-הזרקה, יישור עוברים
שמן הלוקרביון 700	סיגמא-אולדריץ'	H8898	מיקרו-הזרקה, יישור עובר
Hemotek	Hemotek	PS5	Line Maintenance
מיקרואלקטרודה Beveler	Sutter Instruments	BV10	מיקרו-הזרקה, מחט משופעת
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 או P-2000	מיקרו-הזרקה, משיכת מחט
מיקרוסקופ שקופיות	פישרברנד	12-550-A3	מיקרו-הזרקה, יישור עוברים
ללא ייבוש דוגמנות חימר	Jovi	B0025Z71IM	מיקרו-הזרקה, מחט אחסון
מיקרוסקופ סטריאו	אולימפוס	SZ51	מיקרו-הזרקה, ליישור עוברים
סוכר	דומינו		20% סוכר למקור סוכר למבוגרים.
T7 Endonuclease I	NEB	M0302	הכנת חומרי מיקרו-הזרקה
ערכת שיבוט TOPO TA	ThermoFischer Scientific K451020		הכנת חומרי מיקרו-הזרקה
מלקחיים בעלי קצה עדין במיוחד	Fisher Scientific	16-100-121	מיקרו-הזרקה, יישור עוברים