מאמר שיטה

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61388

⸱

14 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

תקציר

שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין בתת-פרה-דם של רקמת המוח, המובילה למחסור בחמצן וגלוקוז, ולאובדן עצבי כתוצאה מכך. ראיות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין תאי גליה ונוירונאליים מפעילה השפעות מועילות לאחר אירוע איסכמי. לכן, כדי לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית. בזאת אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוקיטים ונוירונים מקליפת המוח העוברית חולדה, כי באמצעות מדיה תרבותית ספציפית, מאפשר הקמת תרבויות נוירון- או אסטרוקיטים מועשר או תרבויות neuron-glia עם תשואה גבוהה ושחזור.

כדי ללמוד את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים, אנו מציעים גישה המבוססת על מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבת של אסטרוציטים מצופה צלחות multiwell. שתי התרבויות נשמרות זו מזו על ידי ספירות פרפין קטנות. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפולים ספציפיים לכל סוג תא, המייצג יתרון במחקרים רבים.

כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות נתונות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה בשבץ איסכמי.

מבוא

על פי נתוני ארגון הבריאות העולמי, כ-5.5 מיליון בני אדם מתים מדי שנה משבץ איסכמי1. מצב זה מאופיין על ידי ההפרעה של זרימת הדם לאזור מוח מסוים, וכתוצאה מכך אובדן הפיך או בלתי הפיך באספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות, אשר משנה את תפקוד הרקמות ומוביל תפקוד מיטוכונדריאלי, dysregulation סידן, excitotoxicity גלוטמט, דלקת ואובדןתאים 2,,3.

מלבד תאי כלי דם, תאי עצביים וגליה מעורבים פתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי4. בפרט, אסטרוציטים חיוניים לתחזוקה של נוירונים ולאחרונה הוצגו לשחק תפקיד קריטי בתגובה נגע איסכמי5. סוג זה של תא גליה מבצע פונקציות של תמיכה מבנית, הגנה מפני סטרס חמצוני, סינתזה של נוירוטרנסמיטורים, ייצוב של תקשורת תא תא, ביןהיתר 6. יחד עם נוירונים, אסטרוציטים לשחק תפקיד ישיר שידור סינפטי, ויסות השחרור של מולקולות כגון אדנוסין טריפוספט, חומצה גמא אמינו בוטירית גלוטמט7. חלק מהפציעה המושרה על ידי איסכמיה נגרמת על ידי שחרור מוגזם של גלוטמט והצטברותו על שסוע סינפטי, המוביל להפעלת יתר של קולטני N-מתיל-D-אספרטט, הפעלת מפלים איתות במורד הזרם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך excitotoxicity8. מאז אסטרוציטים מסוגלים להסיר גלוטמט מן הסוע הסינפטי ולהמיר אותו גלוטמין, הם חיוניים בהגנה מפני excitotoxicity, ובכך להפעיל השפעה neuroprotective על איסכמיה. תאים אלה גם לשחק תפקיד בדלקת עצבית איסכמיה המושרה. לאחר העלבון האיסכמי, אסטרוציטים מופעלים עוברים שינויים מורפולוגיים (היפרטרופיה), להתרבות, ולהראות עלייה בביטוי חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP). הם יכולים להיות תגובתיים (אסטרוגליוזיס), שחרור ציטוקינות פרו דלקתיות כגון גורם נמק גידול-α, interleukin-1α ו interleukin-1β, והפקת רדיקלים חופשיים, כולל תחמוצת החנקן וסופרתחמוצת, אשר בתורו יכול לגרוםלמוות עצבי 9,,10. לעומת זאת, אסטרוציטים תגובתיים עשויים גם לשחק אפקט neuroprotective, מאז הם משחררים ציטוקינות אנטי דלקתיות, כגון שינוי גורם גדילה-β, כי הוא upregulated לאחרשבץ 11. יתר על כן, הם יכולים ליצור צלקת גליה, אשר יכול להגביל את התחדשות רקמות על ידי עיכוב נבטים סקסוניים; עם זאת, צלקת גליה זו יכולה לבודד את אתר הפציעה מרקמות קיימא, ובכך למנוע גל מדורג של נזק לרקמות בלתימבוקרות 12,13.

לכן, זה הכרחי כדי לבסס מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה תחת פציעה איסכמית על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות להגביל או להפוך את ההשפעות של פגיעה איסכמית. בהשוואה למודלים אחרים המשמשים לחקר פגיעה איסכמית, כל שם במודלים vivo 14,15,16, תרבויות organotypic17,18,19 ופרוסות מוחחריפה 20,21,22, תרביות תאים ראשיות הן פחות מורכבות, מה שהופך את המחקר של תרומות בודדות של כל סוג תא בפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי ואיך כל סוג תא מגיב למטרות טיפוליות אפשריות. בדרך כלל, על מנת ללמוד את האינטראקציות בין תרבויות מועשר נוירון ותרבויות מועשר אסטרוציט, נוירונים ותאי גליה ממוצא לאחר הלידהמשמשים 23,24, או תאי גליה שלאחר הלידה ונוירוניםעובריים 25,26. בזאת מוצעת גישה פשוטה כדי לבסס נוירון- או אסטרוציט מועשר תרבויות ותרביות נוירון-גליה מאותה רקמה. תאים ראשיים אלה מתקבלים קליפת המוח העוברית חולדה, אזור המושפע לעתים קרובותמשבץ 27,28. יתר על כן, ניתקה של הרקמה מבוצעת רק על ידי הליך מכני. לכן, פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים באותו שלב של התפתחות, באופן מהיר ולא יקר, ועם ביצועים גבוהים ושחזור.

את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים ניתן לחקור באמצעות מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבתית של אסטרוציטים נזרעים צלחות multiwell. ניתן להשתמש בספירות פרפין קטנות כדי להבטיח את ההפרדה של שתי תרביות התא. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית של כל סוג תא לפני שהם מובאים במגע. לדוגמה, ניתן להשתיק גן מסוים באסטרוציטים ולראות כיצד הוא יכול להשפיע על הפגיעות העצבית או הגנה מפני נזק איסכמי המושרה. שיטה מבוססת כדי לגרום לתנאים כמו איסכמי במבחנה היא חמצן ומניעת גלוקוז (OGD)3, אשר מורכב החלפת האטמוספירה הרגילה (95% אוויר ו 5% CO2)על ידי אטמוספרה אנוקסית (95% N2 ו 5% CO2),הקשורים השמטה של גלוקוז.

השיטה המתוארת מתאימה ללימוד האינטראקציות בין תאי עצב ואסטרוציטים בהקשר של שבץ איסכמי, בצורה פשוטה, מהירה, ניתנת לשחזור ולא יקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים בהם נעשה שימוש גודלו במרכז לחקר מדעי הבריאות CICS-UBI בהתאם לדרישות האתיות הלאומיות לחקר בעלי חיים ועם האמנה האירופית להגנה על בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסיוניות ומדעיות אחרות (הנחיה 2010/63/EU).

1. תרבות תא ראשי קליפת המוח העובר חולדה

  1. הכנה בינונית לתרבות
    1. להכין את המדיום Neurobasal (NBM) על ידי הוספת התוספים הבאים: 2% B27, 0.5 mM גלוטמין, 25 גלוטמט μM ו 120 μg / מ"ל ג'נטמיצין. Homogenize, להתאים את ה-pH ל 7.2 ולחטא את המדיום עם שלב סינון ואקום, באמצעות מסנן 0.22 μm. עבור תרבות התא נוירון-גליה, להשלים את אמצעי תרבות תא NBM עם 10% של סרום חום-לא פעילות של פר העובר (HI-FBS).
    2. להכין את המינימום חיוני בינוני נשר (MEM) בינוני עם התוספים הבאים: נתרן מימן קרבונט 2.2 g/L, אינסולין מלבלב הורן 5 מ"ג / L, D-גלוקוז anhydrous 3.4 g/L, פניצילין (12 U /mL) / סטרפטומיצין (12 μg/ mL) ו 10% HI-FBS. הומוגניזציה, להתאים את ה-pH ל 7.2 ולחטא את המדיום עם שלב סינון.
  2. הכנת חומרים וציוד
    1. לנקב את החלק המסוף של קצה מיקרופיפט פלסטיק 1 מ"ל מצד לצד, באמצעות מחט בקוטר מסוים (0.5 מ"מ עבור S; 0.6 מ"מ עבור M; 0.8 מ"מ עבור L) ולאטום את פתיחת הקצה באמצעות להבה.
    2. לחטא את כל כלי הזכוכית. לאורך כל הדיסטוריה יש לשמור על הכלים המשמשים (למשל, מספריים, פינצטה, אזמל) שקועים ב-70% אתנול. מרססים את החומרים ב-70% אתנול לפני הכניסה לתא זרימת ה למינאר.
    3. קבעו את טמפרטורת אמבט המים ל-37°C והניחתו את תא תרבית התא באמבט המים לפני תחילת ההליך.
      הערה: עבור בדיקות אימונוציטוכימיה, ציפוי פולי-D-לינזין צריך להתבצע לוחות multiwell המכילים כיסויים.
  3. תרבות קליפת המוח העוברית חולדה
    1. הסר את עוברי החולדה מנקבה Wistar חולדה עם 15-16 ימים של הריון (סוף ההזדווגות, אשר אמור להימשך 24 שעות, נחשב היום הראשון של ההתפתחות העוברית).st לשם כך, להרדים את הנקבה עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג) וxylazine (12 מ"ג/ ק"ג) ולהסיר את העוברים. ואז להמתת את העכברוש הנשי על ידי נקע צוואר הרחם, בעקבות פרוטוקול סטנדרטי.
    2. מניחים את העוברים בצינור סטרילי של 50 מ"ל, מוסיפים תמיסת מלח של מאגר פוספט (PBS) עד שהיא מכסה את העוברים ואקח אותם במהירות לחדר התרבות.
    3. עדיין בתוך שאק החלמון, מניחים את העוברים בצלחת פטרי המכילה 25 מ"ל של PBS קר. בעזרת מספריים פינצטה, לשבור את שאק החלמון, להסיר את העובר ולהעביר אותו לצלחת פטרי אחרת המכילה גם PBS קר. PBS בצלחת פטרי צריך להיות מספיק כדי לכסות את העובר כולו.
      הערה: היזהר בעת פתיחת שאק החלמון כדי למנוע פגיעה בעובר. ב 1.3.3 ו 1.3.4 השתמשנו 90 מ"מ מנות פטרי קוטר הניח על גבי חבילות קרח מכוסה נייר סופג כדי לשמור על PBS בטמפרטורה נמוכה.
    4. עבור פירוק העובר, להעביר אותו לצלחת פטרי אחרת המכילה 30 מ"ל של PBS קר. מניחים את העובר מתחת למיקרוסקופ לנתח ולשתק אותו באמצעות פינצטה. הפוך את החתך הראשוני במקביל לקליפת המוח, עובר מהחלל עינית לסוף הלוע ולהיות זהיר לא לערוף את החיה.
    5. בזהירות להסיר את הקרקפת ואת קרום המוח באמצעות פינצטה, על מנת לא לפגוע ברקמת המוח קליפתית. תעשה את החתך הבא כדי להפריד את קליפת המוח. להעביר את הרקמה הקליפתית לצינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS באמצעות פיפטה פסטר.
    6. לבצע את העיכול המכני של רקמת המוח הקליפתי באמצעות 1 מ"ל טיפים פלסטיק שהוכנו ב 1.2.1. לתלת 10 פעמים עם פיפטה רגילה ולחזור על התהליך באמצעות pipettes עם חורים קטנים יותר בהדרגה (L, M ו-S), עד הנתחים מתפרקים.
    7. לאחר העיכול המכני, צנטריפוגה המתלים ב 400 x g במשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את המשקע עם מדיום תרבות התא המתאים שהתחממו בעבר ב-37°C.
    8. לקבוע את המספר הכולל של תאים הנוכחיים מתלה התא (צפיפות התא) באמצעות תא Neubauer, לעשות את דילול המתאים וצלחת התאים. צפיפות התא הראשונית הוגדרה בהתבסס על מחקר קודם5.
      1. עבור תרבות מועשרת בנוירון, השתמש 0.21 x 106 תאים /ס"מ2 כצפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים במדיום תרבות NBM ללא HI-FBS.
      2. עבור תרבויות נוירון-גליה להשתמש 0.14 x 106 תאים / ס"מ2 כמו צפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים במדיום תרבות NBM בתוספת 10% HI-FBS.
      3. עבור תרבות מועשר אסטרוציט, להשתמש 0.26 x10 6 תאים / ס"מ2 כמו צפיפות התא הראשונית ולשמור על התאים MEM בתוספת כפי שצוין קודם לכן.
      4. מקם את התאים בדגמה ב- 37 °C, 95% O2 ו- 5% CO2.
        הערה: לתקופות תרבות ארוכות יותר, אנטי מיטוטי כגון 27 μM 5-fluoro-2′-deoxyuridine עם 68 μM uridine יש להוסיף כדי לדכא את צמיחת התא.

2. מערכת שיתוף תרבות

  1. הכנת חומרים
    1. מחממים את הפרפין ב-150 מעלות צלזיוס בבלוק חימום למשך כ-7 דקות. לשמור על 150 מעלות צלזיוס עד לסיום ההליך. לאחר מכן, בעזרת זכוכית סטרילית בקוטר 1 מ"מ פסטר פיפטה, להוסיף טיפה קטנה מעל כיסויים מצופים PDL. ספירות הפרפין לא סדירות, אבל יש להן קוטר של כ-2 מ"מ. הספירות יאפשרו להפריד בין שתי התרבויות בכ-1.25 מ"מ.
    2. מכיוון שהפרפין אינו סטרילי, מניחים את הנפח עם ספירות הפרפין תחת קרינה אולטרה סגולה למשך 15 דקות.
    3. כדי לבסס את התרבות ההתאמה, מעבירים את הסיכות עם ספירות הפרפין באמצעות פינצטה ששקעה בעבר ב-70% אתנול במשך 15 דקות.
  2. תרבות שותף
    1. כאשר שתי התרבויות מוכנות לשימוש (כלומר, לאחר 7 ימים בתרבות בתנאים המוזכרים בשלב 1.3.8), להעביר את הנוירונים שנזרעו בכיסויים עם ספירות פרפין לבארות המכילות את האסטרוציטים.
    2. 24 שעות לפני שתי התרבויות מובאות במגע, לשנות את מדיום התרבות של נוירונים ואסטרוקיטים NBM בתוספת, או לא, עם HI-FBS, בהתאם למטרת הניסוי.
    3. לאחר הצבת שני סוגי התאים במגע, המתן 8-12 שעות לפני הפעלת הגירויים וההליכים השונים.
      הערה: הייצוג השרטוטי של מערכת התרבות ההתקוטפת מוצג באות 1.

3. מחסור בחמצן וגלוקוז

  1. תרבות הכנה בינונית
    1. לניסווי OGD, השתמש בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). הכן את המדיום HBSS עם הריגנטים הבאים: 1.26 מ"מ CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 מ'מ KH2PO4, 0.49 מ"מ MgCl2, 139.9 מ"מ NaCl, 4.17 מ"מ NaHCO3, 3.38 מ"מ Na2HPO4. המגן והתאם את ה-pH ל- 7.2. לחטא את המדיום על ידי סינון.
      הערה: במידת הצורך, להשלים את פתרון HBSS עם גלוקוז (HBSSglu +), על ידי הוספת גלוקוז 5.56 mM. עבור תרבויות שהוגשו OGD לא להשלים את המדיום HBSS עם גלוקוז (HBSSglu-).
  2. הליך OGD
    1. 7 ימים לאחר זריעת התאים, להסיר את מדיום התרבות ולשטוף פעמיים עם HBSSglu-. לאחר הכביסה מוסיפים את מדיום תרבות תאי HBSSglu ומניאים את הנפח בתא ההיפוקסיה.
    2. לאטום את תא היפוקסיה ולהוסיף תערובת גז המכילה 95% N2/5% CO2 במשך 4 דקות עם זרימה של 20 L/min כדי להסיר את החמצן הנוכחי בתוך התא. לאחר מכן, לעצור את הזרימה ולמקם את תא היפוקסיה באינקובטור ב 37 ° C עבור 4 שעות או 6 שעות, בהתאם להיקף של איסכמיה המיועדת.
    3. לאחר תקופת OGD, להחליף את HBSSglu- בינוני עם מדיום התרבות המתאימה עבור ההליכים הנותרים.
      הערה: הניסוי OGD שמטרתו לדמות את התנאים במבחנה כי התאים סובלים במהלך אירוע איסכמי, ולכן חשוב לאשר כי כל המדיה בשימוש בעבר מוסר.

4. תסרוקת אימונוציטו

הערה: בצע את ההסכמה החיסונית כפי שתואר קודם לכן5.

  1. בקצרה, כדי לאפיין את תרבויות קליפת המוח השונות, דגירה התאים לילה ב 4 ° C עם ארנב anti-GFAP (1:2000) ועכבר נגד microtubule הקשורים חלבון 2 (MAP2; 1:500); ואז שעה אחת בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים המשניים הבאים: אנטי-ארנב ביחיד אלקסה פלור 546 ואנטי-עכברים התווסתו לאלכסה פלור 488, שניהם ב-1:1000 דילול.
  2. לתייג את גרעין התא על ידי דגירה עם 2 μM Hoechst 33342 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הר מכסה את הפלואורסצנת הרכבה בינונית ולרכוש תמונות על מיקרוסקופ epifluorescence עם הגדלה 63x.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. נתונים אקספרס כאחוז מהמספר הכולל של תאים או כאחוז שליטה ומוצגים כשגיאה סטנדרטית ממוצעת ± של ממוצע (SEM) של לפחות 3 ניסויים עצמאיים שבוצעו בשלושה רישיות.
  2. בצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנה (GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה), באמצעות מבחן T של סטודנט שלא שולם. התוצאות נחשבו משמעותיות כאשר ערכים של p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאפיין את התרבויות, אימונוציטוכימיה כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFAP או MAP2, סמנים בשימוש נרחב של אסטרוציטיםונוירונים (איור 2), בוצעבכל סוג של תרבות קליפתית. ניתוח זה גילה כי תרבויות מועשר אסטרוציט הציגו 97% של התאים המביעים GFAP (איור 2A). לגבי התרבות המועשרת בנוירון 78% מהתאים הביעו MAP2, 4% מהתאים הביעו GFAP, ו 18% מהתאים היו גם GFAP ו MAP2 שלילי(איור 2B). ביחס לתרבות הקליפתית נוירון-גליה, 49% מהתאים היו MAP2 חיובי, 31% ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת כאן מורכבת בידוד אסטרוציט ונוירון מרקמות קליפתיות עובריות חולדה, המאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציט מועשר או תרבויות נוירון-גליה. הוא הותאם ממחקרקודם של הקבוצה 5שלנו , שבו תוארו הבידוד של התרביות העובריות הקליפתיות והנוירון ושתי התרבויות התאפיינו. באמצעות תרבויות אלה, רוק ואח ' מצא כי אסטרוציטים לשחק תפקיד מפתח בתגובה לנזק איסכמי, מציע כי תקשורת בין אסטרוציטים ונוירונים חיונית לגניחותעצבית 5. בפרוטוקול הנוכחי, בנוסף להכנת תרבויות נוירון-גליה ונוירון מועשר,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

המחברים מכירים בתמיכה במימון של Fundação para a Ciência e Tecnologia באמצעות פרויקטים UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 והמחווה SFRH/BD/135936/2018 ל-JP, על ידי 'Programa Operacional do Centro, Centro 2020" באמצעות הפרויקט CENTRO-01-0145-FEDER-000013 ומימון לפלטפורמה PPBI-פורטוגזית של BioImaging באמצעות פרויקט POCI-01-0145-FEDER-022122.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תרבית 24 בארותתרמו פישר סיינטיפיק142475
95% N2/5% CO2 בלון גזArLí quido
Anti Mouse מצומד ל- Alexa Fluor 488InvitrogenA110011/1000 דילול; תקופת הדגירה - שעה בטמפרטורת החדר
אנטי ארנב מצומד ל- Alexa Fluor 546InvitrogenA110101/1000 דילול; תקופת הדגירה - שעה בטמפרטורת החדר
תוסף B27 (50x)Gibco17504-044
Dako פלואורסצנטי הרכבה בינוניתDakoS3023
D-גלוקוז נטול מיםפישר סיינטיפיקG/0450/603.4 גרם/ליטר
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיZeissAxioObserver Z1x63x אובייקטיבי
סרום בקר עוברי (FBS)BiochromS061510%
ג'נטמיציןסיגמא-אולדריץ'G1272120 ומיקרו; גרם/מ"ל
גלוטמטסיגמא-אולדריץ'G841525&מיקרו; M
גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G31260.5 מ"מ
Hoechst 33342InvitrogenH13992 ומיקרו; M; תקופת הדגירה - 10 דקות בטמפרטורת החדר
תא דגירה היפוקסיהStemcell Technologies27310תא המשמש לאינדוקציה OGD
אינסולין מלבלב בקרSigma-AldrichI55005 מ"ג/ליטר
קטמיןSigma-AldrichK-00287.5 מ"ג/ק"ג
מינימום חיוני בינוני נשר בינוניSigma-AldrichM0268מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש
עכבר Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421דילול 1/500; תקופת הדגירה למשך הלילה ב-4 מעלות; C
בינוני נוירובזאליGibco21103-049מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש
בפסטילי פרפין להיסטולוגיהסיגמא-אולדריץ'1.07164נקודת התמצקות 56-58° C
ParaformaldehydeSigma -AldrichP61484% ב-PBS
פניצילין/סטרפטומיציןBiochromA 2213פניצילין (12U/mL) /סטרפטומיצין (12& מיקרו; גרם/מ"ל)
פולי-D-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P1024
ארנב אנטי-GFAPDAKOZ03341/2000 דילול; תקופת הדגירה למשך הלילה ב-4 מעלות; C
נתרן מימן פחמתיפישר סיינטיפיקS/4240/602.2 גרם/ליטר
קסילזיןסיגמא-אולדריץ'X112612 מ"ג/ק"ג

מקורות

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים