Method Article

ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות

DOI:

10.3791/61404

⸱

May 16th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות תאיות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) הן מודלים רלוונטיים לחקירת אורגנוגנזה. שיטה מבוססת הידרוג'ל לייצור ציסטות מרה ואפיון שלהם מוצע. פרוטוקול זה חושף את המחסומים של אפיון תלת-מימד, עם שיטה פשוטה ואמינה להערכת יעילות היווצרות ציסטה, גדלים, ולבדוק את הפונקציונליות שלהם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cholangiocytes, תאי האפיתל כי בשורה את תעלות המרה בכבד, לפקח על היווצרות מרה ושינוי. בעשרים השנים האחרונות, בהקשר של מחלות כבד, מודלים תלת מימדיים (3D) המבוססים על cholangiocytes הופיעו כגון ציסטות, spheroids, או מבנים דמויי צינור לחקות טופולוגיה רקמות עבור organogenesis, מידול מחלות, מחקרי סינון סמים. מבנים אלה הושגו בעיקר על ידי הטבעת cholangiocytes בהידרוג'ל. המטרה העיקרית הייתה ללמוד ארגון עצמי על ידי טיפול בקוטביות אפיתל, פונקציונלי, ומאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, מעט מאוד מחקרים מתמקדים ביעילות היווצרות ציסטה. כאשר זהו המקרה, היעילות מכמתת לעתים קרובות מתמונות של מטוס יחיד. בדיקות פונקציונליות וניתוח מבני מבוצעים מבלי לייצג את ההטרוגניות הפוטנציאלית של התפלגות ציסטה הנובעת הטרוגניזציה של פולימר הידרוג'ל ותופעות לוואי. לכן, אין אפשרות להשתמש בניתוח הכמותי, כאשר הוא נעשה, להשוואה ממאמר אחד לאחר. יתר על כן, מתודולוגיה זו אינה מאפשרת השוואות של פוטנציאל צמיחה תלת-מית-מיו של מטריצות וסוגי תאים שונים. בנוסף, אין אזכור של פתרון בעיות ניסיוני עבור ציסטות immunostaining. במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה ואוניברסלית כדי להראות כי התפלגות התא הראשונית קשורה התפלגות אנכית הטרוגנית של היווצרות ציסטה. תאים Cholangiocyte מוטבע הידרוג'ל מלווה בניתוח Z-stacks לאורך עומק הידרוג'ל לאורך הזמן של 10 ימים. בשיטה זו, קינטיקה חזקה של יעילות היווצרות ציסטה וצמיחה מתקבלת. אנו גם מציגים שיטות להערכת קוטביות ציסטה ותפקוד הפרשה. לבסוף, טיפים נוספים למיטוב פרוטוקולי אימונוסטיין מסופקים כדי להגביל את קריסת ציסטה להדמיה. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים של תרבות תאים תלת-מיוד, ובכך לפתוח את האפשרויות להשוות מערכת אחת לאחרת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשלושת העשורים האחרונים, תחום המחקר במבחנה התקדם לעבר מערכות תרבות תלת-מית-מיו. מספר פרוטוקולים צצו עבור תאים culturing ב3D כמו spheroids או אגרגטים בנוכחות או היעדר פיגומים / מטריצה, בטיפה, בעצבנות, בהתקנים מיקרופלואידים, אוצף 1. השימוש בשיטות תרבות תלת-ממדיות הוכיח את יתרונותיו על פני תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), במיוחד עבור תאי אפיתל, אשר הוכחו כארגון עצמי במבנים תלת-ממדיים, הנקראים ציסטות או אצ'יני. במקרה זה, התאים יוצרים שכבת מונו-שכבתית המקיפה לומן, שבו תאים לרכוש פנוטיפ אפיתל המלא שלהם עם פונקציות פיזיולוגיות ספציפיות משופרות2.

מחקרים רבים תרמו לפיתוח שיטות לגבש אורגנואידים אפיתל אלה במטריות טבעיות. זה אפשר לסיכום באינטראקציות vivo תא תא ומיקרו-סביבה, כדי לקבל את הממסד ואת היציבות של פנוטיפ אפיתל3,4,5,6,7. לאחרונה, ובמיוחד במטרה לפתח אורגנואידים להשתלה ולפענח את הדרישה של microenvironment לתיאום תוכנית האפיתל, הידרוג'לים סינתטיים פותחו כדי לשפר את היווצרות של אפיתל acini8,9,10. למרבה הצער, מחקרים אלה מדווחים על נתונים איכותיים, או מציגים שיטות חישוב באמצעות הפניות פנימיות כגון היחס בין ציסטות על-פני ציסטות במטוס דו-מימד8,9,10. זה מונע כל השוואה בין מחקרים שונים במונחים של יעילות, יציבות, או אפיון מורפולוגי ופיזיולוגי של אורגנואידים אפיתל.

מיקרו-אנקסטלציה של תאי אפיתל בחרוזים באמצעות מכשירים מיקרו-נוזלים אפשרה תוצאות כמותיות והשוואתיות מציאותיות יותר. באמצעות טכנולוגיה זו, אורגנואידים מסוגי תאים שונים נוצרו והבדילו בהתבסס על מורפולוגיה בין מבנים תאיים תלת-מימדשונים 11,12. עם זאת, טכנולוגיה זו אינה קלה לעבודה ודורשת שימוש בחדרים נקיים כדי לייצר את המכשירים המיקרו-נוזלים. טכנולוגיה זו הוקמה עבור מספר סוגים של הידרוג'לים אך דורשת התאמה טכנית כדי להיות מיושמת על הידרוג'לים אחרים, הגבלת הרב-תכליתיות שלה. לכן, רוב המחקרים שנועדו לפתח אורגנואידים אפיתל להסתמך על הטבעה של תאים אפיתל בצובר הידרוג'ל. בשיטות אלה, הטרוגניות גבוהה של ג'ל structuration והפצה תא בתוך כל תרבות 3D מוזנח לעתים קרובות. לכן, רוב הניתוחים מתייחסים לתמונות 2D בודדות, המייצגות רק בערך את ההתפלגות של העצמים הסלולריים השונים בכל אמצעי האחסון התת-ממדי.

מחלות המשפיעות על תעלות מרה, כגון cholangiocarcinoma, אטרזיה המרה, cholangitis טרשת נפוצה העיקרית, בין היתר, הם הגורם העיקרי של תמותה ותחלואה. מלבד השתלת כבד, אין טיפולים יעילים עבור תנאים אלה13. המאמצים לחקור היווצרות צינור מרה, גורמים למחלות והתקדמות יאפשרו פיתוח של טיפולים חדשניים14.

מודלים organotypic מרה של ציסטות, spheroids או מבנים דמויי צינור באמצעות נורמלי או המטופל נגזר, מובדיל, או קווי תא cholangiocyte נגזר צוגנטור פותחו15 , 16,17,18,19,20. מחקרים שונים יש recapitulated קוטביות cholangiocyte, ביטוי של סמני cholangiocyte, נוכחות של סיליה, הפרשת cholangiocyte ויכולת ספיגה מחדש, היווצרות לומן וחסימה; כולם מייצגים מאפיינים חשובים של פנוטיפ צ'ולנגיוציט, מורפולוגיהופונקציה 15,17,19. אחרים דיווחו על תחזוקה של אורגנואידים מרים נגזר המטופל במשך פרקי זמן ארוכים20. לאחרונה, חקרנו את התפקיד של רמזים ביוכימיים וביופיזיים על ציסטות מרה organogenesis21. חשוב לציין, הפתוגנזה של אטרזיה מרה נחקרה ב spheroids מרה וצינורות7,22. יתר על כן, תכונות עיקריות של cholangitis טרשת נפוצה כגון סנסציה cholangiocyte, הפרשת ציטוקינות פרו דלקתיות, כמו גם גיוס מקרופאג נחקרו בהצלחה באמצעות spheroids מרה15,20. עם זאת, ניתן לשחזר במבחנה מודלים כמותיים 3D כי פיזיולוגי לווסת פנוטיפ cholangiocyte, פיזיולוגיה, ומיקרוסביבה שבו שאלות אלה ניתן לטפל עדיין נדרשים. יתר על כן, רק מעט פרסומים דיווחו על יעילות היווצרות ציסטה21,23. זוהי נקודה חשובה כדי לבסס, במיוחד בעת חקירת organogenesis, גורם למחלה, ומתאמת של תגובות סמים עם פונקציה cholangiocyte וקיטוב. בנוסף, עם הבדלים בפיגומים/מטריצה המשמשים מרוטוקול לפרוטוקול, קשה להשוות בין מערכות. כדי לפתור בעיות אלה, אנו מציעים שיטה כמותית, אמינה ואוניברסלית כדי ליצור ציסטות מרה מחקה היווצרות לומן, קיטוב cholangiocyte, ופונקציית הפרשת cholangiocyte. חשוב לציין, אנו מציגים ניתוח שיטתי המבוצע לאורך ציר ה-Z על-פני ג'ל תלת-ממדי בעת הערכה לאורך זמן, יעילות היווצרות ציסטה, גודל, כדאיות, קיטוב ופונקציונליות. יתר על כן, השתמשנו הידרוג'ל טבעי ו cholangiocytes חולדה נורמלי (NRC)s, כדוגמה לפרוטוקול, אבל הידרוג'לים טבעיים או סינתטיים אחרים, כמו גם תאים אפיתל יכול לשמש להיווצרות של מבנים סיסטיק 3D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור ציסטות

הערה: פרוטוקול זה יכול להתבצע עם כל סוג של הידרוג'ל, אם הג'לציה מאפשרת הטבעה של תאים.

  1. ציפוי הידרוג'ל
    הערה: ציפוי הידרוג'ל נכון של השקופית התא הוא צעד קריטי כדי למנוע היווצרות של שכבות תא 2D בתחתית הבאר, זה עלול להפריע הדמיה ציסטה עוקבות ולפגוע בחישוב של יעילות היווצרות ציסטה.
    1. כדי להבטיח הומוגניות של תמיסת הג'ל, להפשיר את ההידרוג'ל ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (O /N).
    2. טיפים פיפטה Precool על קרח או O / N ב -20 ° C ושקופית תא 8 באר ב -20 ° C O / N.
    3. מניחים את ההידרוג'ל ואת מגלשת התא בת 8 הבאר על דלי קרח מלא בקרח.
    4. בצינור חרסי 15 מ"ל, הכינו פתרון המכיל 40% הידרוג'ל (V/V) במדיום שלם של NRC קר (ראה טבלת חומרים)והניח את הצינור על קרח.
    5. כדי לכסות את השקופית התא, באמצעות טיפים פיפטה קרה, להוסיף 50 μL של תמיסת הידרוג'ל על מרכז כל באר, ולפרוש על פני השטח כולו באמצעות קצה פיפטה, תוך החזקת החלקה התא עלקרח (איור 1A).
      הערה: להפיץ את פתרון הידרוג'ל באופן שווה ככל האפשר הימנעות בועות.
    6. כדי לפולימר את ההידרוג'ל, דגירה את החלקה התאית לפחות 15 דקות ב 37 °C, 5% CO2.
  2. הכנת תא
    1. לחמם NRC שלם בינוני, פוספט אגירה תמיסת מלח (PBS), ו חומצה טטראצטית טריפסין-אתילנדיאמין (טריפסין-EDTA) באמבט מים מחומם מראש 37 מעלות צלזיוס.
    2. בעוד הידרוג'ל הוא polymerizing, ודא כי NRCs גדלים 70% confluency ב בקבוקון מצופה T-25 ס"מ2 קולגןמצופה 21. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1x מחומם מראש.
    3. דגירה NRCs עם 5 מ"ל של PBS 1x מחומם מראש (עבור T-25ס"מ 2 בקבוקון) במשך 20 דקות ב 37 ° C, 5% CO2.
      הערה: שלב זה, אשר מקצר את זמן הדגירה עם trypsin-EDTA הוא אינסטרומנטלי בשמירה על המאפיינים של התאים בארגון עצמי.
    4. בטלו את ה-PBS, הוסיפו 1 מ"ל של טריפסין-אדטה ותדגירה למשך 5-10 דקות ב-37°C, 5% CO2.
    5. נטרל עם 4 מ"ל של NRC שלם מחומם מראש. לאסוף ולהעביר את מתלה התא לתוך צינור חסינה 15 מ"ל, ולסובב ב 150 x g במשך 4 דקות.
    6. השליכו את המדיום והתווסדו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של מדיום מחומם מראש.
    7. באמצעות מסננת תא 40 μm, לסנן את פתרון התא לתוך צינור חמור 50 מ"ל ולספור את התאים.
      הערה: העברת התאים דרך מסננת היא שלב קריטי עבור התוצאות הכמותיות להיות לשחזור כלומר, כדי לקבל גודל כמעט דומה של אגרגטים של תאים להיות מוטבע.
  3. הטבעת מתלי תאים בתמיסת הידרוג'ל
    1. הכן פתרון של 1,600 μL של 80% הידרוג'ל (V/V) במדיום NRC שלם קר (שפופרת 1); שמור בקרח. לדלל 5 x 105 תאים / מ"ל ב 1,600 μL של קר להשלים NRC בינוני (צינור 2) ולשמור בקרח.
      הערה: שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי למנוע פולימר של ההידרוג'ל תוך ערבובו עם מתלה התא ולשמור על הכדאיות של התא.
    2. כדי להכין פתרון זריעת תאים של 2.5 x 105 תאים/מ"ל ב-40% הידרוג'ל (V/V), לערבב צינור 1 וצינור 2. להוסיף 400 μL של פתרון התא לתוך כל באר של השקופית תא מצופה הידרוג'ל הימנעותבועות (איור 1B).
    3. שמור את השקופית התא באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עד שינוי מדיה.
    4. לאחר 2 ימים בתרבות, להסיר 250 μL של המדיום מפינה של כל באר, להיזהר לא פיפטה את ההידרוג'ל. לאחר מכן, לאט להוסיף 250 μL של מדיום התרבות. לשנות את המדיום כל יומיים.
      הערה: מזער את התנועה של החלקה התאית, במיוחד במהלך חניכה ציסטה.

2. כימות ציסטה

  1. הדמיית ציסטה
    הערה: סעיף זה צריך להתבצע במהירות כדי לא לסכן את הכדאיות של התא אם המיקרוסקופ אינו מצויד בתא חימום כדי לשלוט CO2 וטמפרטורה. על מנת להבטיח כימות עקבית, נציג התפלגות ציסטה בנפח הידרוג'ל מלא, ציסטות מודמיות באמצעות מיקרוסקופית ניגודיות פאזה והדמיה סדרתית (Z-stacks), עם פרמטרים מוגדרים מראש בנקודות זמן שונות.
    1. קח Z-stack לאורך עומק ההידרוג'ל עבור כל נקודת זמן(איור 1ג', ד). בדוגמה זו, ערימות Z נלקחות בימים 1, 2, 4, 7 ו- 10.
      הערה: ודא שהתפלגות התאים הראשונית אחידה בהידרוג'ל כדי להבטיח את הישימות של שיטה זו.
      1. עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה המצויד בתוכנה לרכישת תמונה, בחר את ההגדלה האובייקטיבית של פי 10 בחלון משטח האף הידני(איור 2B(1).
      2. הפעל את המנורה הלבנה ובחר באפשרות ההדמיה של Brightfield.
      3. הפעל את המצלמה על-ידי בחירהבלחצן" הפעל " בתנון המשנה של הסר. התמקד בשדה ציסטות והגדר את זמן החשיפה(איור 2ב(2)). פתח את החלון תיקיית הלכידה האוטומטית לשמירה אוטומטית של תמונות(איור 2B(3).
      4. פתח את חלון לכידה מסדרת Z והגדר באמצעות ה-Z בורג המישורי העליון והתחתון של מחסנית Z (אותן קואורדינטות XY אך Z שונה מוקרנות). להתאים את ה-Z-שלב בהתאם ליעד, רמת הרזולוציה ולחץ על הכפתור "הפעל עכשיו" כדי להפעיל את הרכישה (איור 2B(4).
        הערה: בדוגמה זו, ציסטות מפוזרות על פני עובי הידרוג'ל של 520 μm. 26 תמונות נרכשות לאורך עומק הידרוג'ל עם מרווח של 20 μm Z-שלב. בהתאם ליעד, יש להתאים את שלב ה- Z כדי לא לפספס ציסטה ולהבטיח זיהוי של תאים בודדים ואצרגטים.
      5. קח לפחות 3 ערימות Z חופפות לבאר.
        הערה: דגימה זו נחוצה כאשר, כמו בדוגמה זו, ציסטות הן רבות יותר בעומק הג'ל מאשר בקצוות בשל הטרוגניות בפולימר הידרוג'ל.
      6. כדי שערך נתונים מייצג יחזור על שלב 2.1.1.5. עבור 3 בארות בסך הכל.
        הערה: ההתפלגות הטרוגנית של ציסטות תלויה בסוג ההידרוג'ל, הפולימר שלו וקו התא. בהתחשב שלוש Z-stacks לכל באר ושלוש בארות לכל ניסוי, מינימום של 200 ציסטות הם תמונה על פני תשע Z-ערימות לאפיין היווצרות ציסטה וצמיחת ציסטה בכל נקודת זמן.
  2. עיבוד תמונה
    הערה: בהידרוג'ל, ניתן למצוא NRCs כתאים בודדים, ציסטות או אגרגטים. ציסטות מזוהות על ידי הנוכחות של מעטפת תא עגולה ודקה מנוגדת המקיפה לומן, בעוד אגרגטים של תאים מציגים צורה לא סדירה ותאין להם לומן. אגרגטים ותאים בודדים בעלי מראה צפוף וניגודי(איור 3B(4).
    1. פתח את תוכנת פיג'י, פתח את Z-stack ולך לתפריט פיג'י ולחץ על קובץ | פתוח (איורמשלים 1). בחר את מחסנית Z לניתוח. במידת הצורך, בחר באפשרות "מחסניתוירטואלית "ולחץעל " כן " לפתיחה( איור 3A(1).
    2. שכפול המחסנית באמצעות תמונה | שכפול . לחץ על התיבה "מחסנית כפולה"ולחץעל " אישור " (איור משלים 2).
      הערה: בדוגמה זו, ערימות Z הן בתבנית קובץ .nd2 המקודדת ב- 16 סיביות.
    3. צור הקרנת עוצמה מינימלית מהערום השכפול. עבור אל תפריט תמונה | ערימות | פרויקט Z. בחר סוג הקרנה "מינימום עוצמה"ולחץעל " אישור " ( איור3A(2)( איורמשלים 3).
    4. הפחת את הרקע מההקרנה. עבור אל תפריט תהליך | חיסור רקע. הקלד 500.0 פיקסלים של רדיוס כדור מתגלגל ולחץ על "רקעאור " כדי לעבד ציסטות יותר מנוגדות מהרקע (איור 3A(3)( איורמשלים 4).
      הערה: רדיוס הכדור המתגלגל מגדיר את גודל האזור שבו מופעל חיסור רקע. יש להגדיר פרמטר זה לגודל האובייקט הגדול ביותר לזיהוי.
    5. אם יש צורך בשיפור ניגודיות, עבור אל תפריט תמונה | כוונן | בהירות/ניגודיות | אוטומטי | החל. פיג'י תמוטב באופן אוטומטי את הבהירות והניגודיות. ב (איור 3A(3),הערכים האפורים הנמוכים והעליונה נקבעו ל- 49702 ו- 65452, בהתאמה(איור משלים 5).
      הערה: אם ההקרנה אינה מכוילת, עבור לתפריט ניתוח | הגדר קנה מידה והקלד את יחס הכיול המתאים μm/pixel (איור משלים 6).
  3. מידות ספירת ציסטה וגודל ציסטה
    1. כדי למדוד את קוטר ציסטה משוער, בחר את הכלי קו ישר בתפריט פיג'י וצייר קו על פני הקוטר של כל ציסטה על ההקרנה הסופית(איור 3B(4). הוסף את אזור העניין החדש (ROI) שנוצר עבור כל ציסטה למנהל ההחזר על ההשקעה: לחץ על "t" קיצור הדרך במקלדת לספירה ופתיחה מהירה יותר של מנהל ההחזר על ההשקעה. לחץעל " הצגהכל " כדי לראות את ציסטות שנספרו (איור משלים 7)
    2. ודא כי לא נשאר ציסטה מבלי לספור על-ידי superimposing ROIs להגדיר מההקרנה על Z-stack. כך, לחץ על החלון Z-stack כדי לבחור אותו. ב-ROI Manager, לחץ על "הצג הכל" והזיז את הסמן לאורך מחסנית Z כדי לבדוק תמונה זו לכל תמונה, כל הציסטות נספרו (איור משלים 8).
    3. לאחר ספירת ציסטות חדשות וROIs נוסף בשלב 2.3.1., בחר את סט ההחזר על ההשקעה ולשמור אותו באמצעות חלון ROI Manager על-ידי לחיצה על עוד | חיסכון (איור משלים 9).
    4. בחר את כל ROIs ב-ROI Manager ולחץ על "מידה" ב-ROI Manager כדי לקבל את הגודל של כל ציסטה. כך תפתח חלון חדש של מדידות בשם "תוצאות" ממספר כל ציסטה וגודלה המשוער. לאחר מכן שמור .csv על ידי לחיצה על "תוצאות" חלון ודרך התפריט: קובץ | שמירה בשם (דמות משלימה 10).
      הערה: ניתן ליצור מאקרו כדי לעבד מחסניות באופן אוטומטי למחצה, להעריך מספר/גדלים של ציסטה מהתחזיות ולאחסן את הנתונים עבור הליך ספירה מהיר יותר. כך, בחר בכלי "הקלטה" בתפריט הסר, על-ידי לחיצה על תוספים | פקודות מאקרו | הקלט .
  4. כימות יעילות היווצרות ציסטה
    1. ספירת מספר ציסטות ביום Y, על figure-protocol-1 הקרנה (Y = 1, 2, 4, 7 או 10).
    2. כדי לחשב את יעילות היווצרות ציסטה עבור 1000 תאים ביום Y, לחלק את מספר ציסטות שנספרו בנקודת זמן זו על ידי מספר התאים שנזרעו ביום 0 להסיק מנפח הידרוג'ל ולהכפיל על ידי 1000 (איור 3C, איור 4).
      figure-protocol-2

3. יכולת קתיון תאים

  1. להכין פתרון מניות של פלואורסצ'ין diacetate (ה-FDA) ב 5 מ"ג / מ"ל על ידי המסת 5 מ"ג של ה-FDA ב 1 מ"ל אצטון ולאחסן ב -20 ° C.
  2. הכן פתרון מלאי של פרודיד פרופידיום (PI) בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל במים deionized (dH2O) ולאחסן ב 4 ° C.
  3. הכנת NRC בינוני ללא סרום עגל עוברי (FCS).
  4. כדי להכין את פתרון הכתמים של ה-FDA/PI, להוסיף 4 μL של פתרון מניות ה-FDA (8 μg / mL ריכוז סופי) ו 25 μL של פתרון מניות PI (20 μg / מ"ל ריכוז סופי) לתוך 2.5 מ"ל של NRC בינוני ללא FCS.
  5. הסר את המדיום משקופית התא, להוסיף 250 μL של תמיסת כתמים לתוך כל באר דגירה 4-5 דקות בחושך ב 37 °C, 5% CO2. פיפטה את תמיסת הכתמים בזהירות ולשטוף פעם אחת עם 250 μL של 1x PBS.
  6. בזהירות להוסיף 250 μL של NRC שלם בינוני לכל באר ולצלם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך עם טקסס אדום פלואורסצ'ין isothiocyanate (FITC) מסננים. תאים חיים יהיו ירוקים ותאים מתים יהיו אדומים(איור 5A).
    הערה: כדי לכמת תאים חיים/מתים, קח Z-stacks על-פני נפח ההידרוג'ל לאחר שלב 2 ולהתאים את שיטת עיבוד התמונה עבור פלואורסצנטיות.

4. פעילות הפרשה

הערה: פעילות ההפרשה באמצעות קרום apical של cholangiocytes מוערך על ידי הפרשת פלואורסצן בלומן. את ספציפיותו ניתן להעריך על ידי ביצוע אותה בדיקה עם Verapamil, מעכב טרנספורטר עמיד לתרופות מרובות (MDR)24.

  1. כדי להכין פתרון כתמים של Hoechst 33258 ב 5 μg /mL, להוסיף 0.83 μL של פתרון מניות Hoechst (15 מ"ג / מ"ל ריכוז מניות ב dH2O) ב 2.5 מ"ל של NRC בינוני ללא FCS.
  2. הוסף 250 μL של תמיסת Hoechst בכל באר ודגירה ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 15 דקות.
  3. להסיר את הפתרון Hoechst ולהוסיף 250 μL של פתרון ה-FDA (8 μg / מ"ל ריכוז סופי) בכל באר. דגירה 4-5 דקות ב 37 °C, 5% CO2.
    הערה: ברגע תאים נחשפים פתרון הכתמת ה-FDA, מעקב של קינטיקה הפרשת פלואורסצן עשוי להיות שימושי כדי לכייל את הזמן הדרוש ציסטות כדי להפריש. כך, צלם תמונות כל דקה למשך שעה אחת באמצעות הדמיה של זמן. בדוגמה זו, הזמן הדרוש כדי לצפות ציסטות הפרשת NRC בהידרוג'ל הוא כ 15-20 דקות.
  4. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך 5 דקות לאחר שטיפה עם בינוני ללא FCS. השתמש 4′,6-diamidino-2-פנילינול (DAPI) ומסנני FITC כדי לחשוף תיוג גרעין והצטברות פלואורסצן בלומן(איור 6A). כדי לכמת את מספר ציסטות הפרשת, קח את ערימות Z כמו בשלב 2 והתאם את שלבי עיבוד התמונה לתמונות פלורסנט.
    הערה: עבור בדיקת Verapamil, הקדים את התהליך הקודם (שלבים 4.3. עד 4.4.) על-ידי דגירה עם Verapamil, בהתאם לתנאים הבאים:
  5. הכן פתרון מניות של 10 m Verapamil בדימתיל גופרית (DMSO). כדי להכין 10 μM פתרון עבודה, לערבב 2.5 μL של פתרון מניות Verapamil עם 2.5 מ"ל תרבות בינונית ללא FCS.
  6. כדי להעריך כי הפלואורסצנטיות בתוצאות לומן מפרשת MDR, לקחת שקופית נוספת ולהוסיף 250 μL של פתרון עבודה Verapamil בכל באר דגירה 20 דקות ב 37° C, 5% CO2
  7. להסיר את הפתרון ולהוסיף 250 μL של פתרון ה-FDA (8 μg / מ"ל ריכוז סופי) לתוך כל באר. דגירה 4-5 דקות בחושך ב 37 °C, 5% CO2. לאחר מכן, לשטוף עם 250 μL של 1x PBS, לפני הדמיה (איור 6B, C).

5. הערכת קוטביות אפיתל על ידי אימונולוסץ

  1. כדי להכין את פתרון התיקון, ערבב 4% פורמלדהיד עם 5% סוכרוז, ב-PBS אחד, pH 7.4 ותדגור באמבט מים מחומם מראש ב-37°C.
  2. כדי לתקן את התאים, בעדינות פיפטה את מדיום התרבות מהבאר מבלי לפגוע במטריקס. לאט להוסיף 400 μL של פתרון תיקון לצד של בארות. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: השאר תמיד 25 μL של הנוזל מעל המטריצה כדי למנוע את נזקיו.
  3. הסר בעדינות את פתרון התיקון ושטוף פי 3 עם 400 μL של 1x PBS ב(RT).
  4. פיפטה את PBS, להוסיף 400 μL של פתרון permeabilization (0.5% Triton X-100 ב 1x PBS) ותדגם 10 דקות ב RT.
  5. הסר בעדינות את פתרון היציבות, ואחריו 3 שטיפה מהירה עם 400 μL של 1x PBS וצעד כביסה ארוך של 30 דקות ב RT.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את השקופית ב- 4 °C למשך יומיים. במקרה זה, לאטום את השקופית עם סרט פרפין כדי למנוע אידוי וייבוש מטריקס.
  6. הסר את PBS, להוסיף 400 μL של פתרון חסימה המכיל 0.1% אלבומין סרום בשר (BSA) ו 10% סרום עזים ב 1x PBS ותדגר במשך 60 דקות ב RT.
    התראה: ריכוזי BSA גבוהים מ-0.1% יביאו לנסיגה של לומן ולקריסה נוספת של ציסטה (ראה סעיף תוצאות מייצגות)(איור 7א).
  7. פיפטה את פתרון החסימה ולשטוף פעם אחת עם 400 μL של PBS/0.05% Tween 20 ולהיפטר.
  8. להוסיף 150 μL של פתרון הנוגדן, למשל, נוגדן E-cadherin מדולל 1:400 ו Phalloidin 568 (16.2 nM ריכוז סופי) ב 1x PBS ומדגר במשך 90 דקות ב RT.
    הערה: דילול זה של E-cadherin זהה לשימוש כמו בפרוטוקול חיסון דו-מיוקד סטנדרטי.
  9. לשטוף את הדגימה עם 400 μL של PBS /0.05% Tween 20, 3x; בכל פעם מדגרה את הדגימה במשך 10 דקות ב RT.
  10. להוסיף 150 μL של הנוגדן המשני (עז נגד ארנב IgG אלקסה פלור פלוס 647), מדולל 1:500 ב 1x PBS דגירה 60 דקות ב RT.
  11. לשטוף 3x עם 400 μL של PBS /0.05% Tween 20, בכל פעם דגירה המדגם במשך 10 דקות ב RT.
  12. לשטוף 3x עם 400 μL של 1x PBS, בכל פעם דגירה המדגם במשך 10 דקות ב RT.
  13. בטל את ה-PBS של השטיפה האחרונה והכן את שקופית התא להדמיה באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית בעקבות אחת משתי האפשרויות שלהלן.
    1. להוסיף 400 μL של 1x PBS ו 50 μL של DAPI לכל באר. את הדגימות ניתן לבחון דרך החלק התחתון של הבאר ללא צורך הרכבה עם כיסוי(איור 7B).
    2. הוסף 100 μL לכל באר של reagent antifade המכיל DAPI ולתת את השקופית ייבוש O / N ב RT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היווצרות ואפיון ציסטות
מערכות תרבות תאים תלת-מימד הן כלי חשוב לחקר אורגנוגנזה ומידול מחלות25. למרבה הצער, רוב שיטות אלה הן איכותיות או להשתמש כימות פנימית המבוצעת על מישור יחיד על ידי השוואת מספר ציסטות לעומת ציסטות, בנפחים משתנים ולעתים קרובות לא מוגדרים, מניעת כל השוואה במונחים של יעילות היווצרות ציסטהבין המחקרים השונים 7,8 ,9,10,15,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת ללמוד organogenesis ותחזוקה של מבנים תאיים 3D, רקמות שונות כבר מודל, באמצעות מקורות תאיים שונים, אבל גם סוגים שונים של מטריצות חוץ תאי כוללהידרוג'לים סינתטיים 8,9,10,21. עם זאת, בשל היעדר ניתוח כמותי תלת-מידי המאפשר השוואות בין שיטות במונחים של היווצרות אורגנואידיםאו פונקציונליות 7,8 ,9,10,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ניקולס לרוסו (מאיו קליניק, רוצ'סטר, מינסוטה, ארצות הברית), אשר סיפק בחביבות את קו התא NRC.

עבודה זו זכתה לתמיכה כספית הן בתוכנית iLite RHU (להעניק ANR-16-RHUS-0005) והן של DHU Hepatinov.

אנו מודים לאיזבל גארסין ורוסו ד'אימליירי צלולייר פריז סקלי על תמיכתם בהדמיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ומיקרו; l- Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000020
100 ומיקרו; l - Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000046
1000 ומיקרו; l - פיפטה אפנדורף מחקר פלוסתרמו פישר מדעי3120000062
1X PBSתרמו פישר סיינטיפיק14190-094
200 ומיקרו; l - Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine מלח נתרןSigma-AldrichT5516NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 3.4 µ g/mL
חומצה אצטיתVWR20104-2980.02N
סופי פיפטות מחסום אירוסול טיפים 10 ומיקרו; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707439
קצות פיפטות מחסום אירוסול 1000 ומיקרו; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707404
קצות פיפטות מחסום אירוסול 200 ומיקרו; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707430
תמיסה אנטיביוטית אנטימיקוטית (100X)Sigma-AldrichA5955NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 1:100 דילול
תמצית יותרת המוח בקרThermo Fisher Scientific13028-014NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 30 ומיקרו; g/mL
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA21531:1000 דילול
תרכיז שומנים מוגדר כימית (100X)Thermo Fisher Scientific11905-031NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 1:100 דילול
קולגן בריכוז גבוה, זנב עכברושThermo Fisher Scientific35424950 µ גרם/מ"ל ריכוז סופי
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'D4902NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 0.393 ומיקרו; g/mL
DMEM F12Thermo Fisher Scientific21331-020NRC ריכוז סופי בינוני שלם = 1X
E-cadherin ארנב אנטי-אנושי, חולדה, פוליקלונליתרמו פישר מדעיPA5-321781:400 דילול
ליקוי חמה TE300 מיקרוסקופ הפוךניקוןהדמיה
אתנולמיןסיגמא-אולדריץ'E9508NRC בינוני שלם סופי ריכוז = 0.32 מ"מ
סרום עגל עובריThermo Fisher Scientific10270-106NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 5:100 דילול
Fluoroshield עם DAPI (מדיום הרכבה)Sigma-AldrichF6057
פורמלדהיד 16% (W/V)Thermo Fisher Scientific289064% (W/V)
סרום עיזיםThermo Fisher Scientific16210-0641:10 דילול
מצלמת Hamamatsu (מצלמה דיגיטלית C11440 ORCA - פלאש 4.OLT)הדמייתHamamatsu
Hoechst 33258Sigma-AldrichB11555 ומיקרו; גרם/מ"ל ריכוז סופי
IgG (H+L) עז נספגת מאוד נגד ארנב, Alexa Fluor Plus 647Thermo Fisher ScientificA327331:500 דילול
ImageJ גרסה 2.0.0-rc-69/1.52nתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח
אינסולין-טרנספרין-סלניום (100X)Thermo Fisher Scientific51300-044NRC ריכוז סופי בינוני מלא = דילול
1:100L-גלוטמין (100X)תרמו פישר סיינטיפיק25030-024NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 1:100 דילול
Matrigel GFR (ריכוז מלאי 9.7 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher Scientific356231דילול 4:10
NIS Elements תוכנה גרסה 4.50.00רכישת תמונות ניקוןותצוגה
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)תרמו פישר סיינטיפיק11140-035NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 1:100 דילול
תוכנית אובייקטיבית פלואור 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)Nikon
Prolong Gold Antifade ReagentThermo Fisher ScientificP36931
Propidium Iodide (PI)Sigma-AldrichP417020 µ גרם/מ"ל ריכוז סופי
רודמין פלואידיןתרמו פישר מדעיR41516.2 ננומטר ריכוז סופי
ערכת סיר-אקטין / ורפמילספירוכרוםSC00110 ומיקרו; M ריכוז סופי
מעכב טריפסין פולי סויהThermo Fisher Scientific17075-029NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 50 ומיקרו; גרם/מ"ל
מסננת תאים סטריליים 40 ומיקרו; m (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22363547
פיפטות סטריליות 10 מ"ל (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811E
פיפטות סטריליות 5 מ"ל (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811D
צינורות סטריליים 1.5 מ"ל (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific11926955
צינורות סטריליים 15 מ"ל (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific7200886
צינורות סטריליים 50 מ"ל (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific553913
סוכרוזSigma-AldrichS03895:100 דילול
בקבוק מטופל בתרבית רקמות 25 ס"מ2 (Falcon)Thermo Fisher Scientific353108
Triton X-100Sigma-AldrichT87875:1000 דילול
Trypsin-EDTA (0.05%) פנול אדוםThermo Fisher Scientific25300-0541X
Tween-20Sigma-AldrichP13795:10000 דילול
ויטמין (100X)Thermo Fisher Scientific11120-037NRC ריכוז סופי בינוני מלא = 1:100 דילול
μ-שקופית 8 Well ibiTreat, IbidiClinisciences80826
של

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biliary Epithelial CystsCholangiocyte CultureHydrogel EmbeddingZ stack AnalysisCyst Formation EfficiencyCyst Polarity AssessmentSecretory Function EvaluationImmunostaining OptimizationLive Dead StainingFluorescein Secretion

Related Articles