שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

Summary

שיטות נוכחיות לטעינת צלחות 96-באר עבור עקירות DNA יכול להיות נוטה זיהום. אנו מפרטים שיטה חדשה לטעינת צלחות 96-באר המפחיתה את הסיכון לזיהום צולב בין בארות. השיטה שלנו תסייע לחוקרים אחרים לנצל את היעילות של טכניקות חילוץ DNA בתפוקה גבוהה ולמזער את הסיכון לזיהום.

Abstract

טכניקות רצף DNA בתפוקה גבוהה תרמו באופן משמעותי להתקדמות בהבנת מערכות היחסים שלנו בין קהילות מיקרוביאליות, מאפייני מארחים ופונקציות אקוסיסטם רחבות יותר. עם עלייה מהירה זו ברוחב ועומק של יכולות רצף הגיעו שיטות לחלץ, להגביר, לנתח ולפרש DNA סביבתי בהצלחה ביעילות מקסימלית. למרבה הצער, ביצוע עקירות DNA במהירות יכול לבוא במחיר של הגדלת הסיכון לזיהום בין דגימות. בפרט, עקירות בתפוקה גבוהה המבוססות על דגימות הכלולות בצלחת 96-באר מציעות שיטה מהירה יחסית, בהשוואה עקירות צינור יחיד, אבל גם להגדיל את ההזדמנויות עבור טוב לבאר זיהום צולב. כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בין דגימות, תוך שמירה על היתרונות של טכניקות חילוץ בתפוקה גבוהה, פיתחנו שיטה חדשה לטעינת דגימות סביבתיות לתוך צלחות 96 באר. השתמשנו בסרטי איטום PCR הניתנים לפינוק כדי לכסות כל צלחת תוך טעינת דגימות והוספנו דגימות תחילה לצינורות PCR לפני העברתן לבארות; יחד, שיטות אלה להפחית את הסיכון של סחיפה מדגם וטעינה כפולה לא מכוונת של בארות. השיטה המתוארת בנייר זה מספקת לחוקרים גישה למקסם את טכניקות החילוץ הזמינות בתפוקה גבוהה תוך הפחתת הסיכון לזיהום צולב הטבוע בצלחות של 96 בארות. אנו מספקים מתאר מפורט שלב אחר שלב של איך לעבור מאיסוף מדגם לחילוץ DNA תוך מזעור הסיכון של זיהום צולב לא רצוי.

Introduction

ההתפתחויות האחרונות בהקפת תפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות מספקות עומק רצף שאין שני לו, וכתוצאה מכך, הצצה לא מנומקת לתפקוד ולמגוון של המיקרוביום^{1 של כדור הארץ}. ככל שהיכולת לדגום יותר ויותר דגימות על נתיב רצף יחיד גדלה, חילוץ DNA צינור יחיד יש פוטנציאל להפוך צעד הגבלת קצב בדור של נתונים אקולוגיים. עם זאת, שיטות חדשות בתפוקה גבוהה עקירות DNA להחזיק הבטחה לעיבוד כמויות גדולות של דגימות סביבתיות עם יעילות רבה יותר מאשר בעבר היה אפשרי². שיטות אלה כרוכות לעתים קרובות באמצעות 96-באר צלחות במקום חד צינוריות, ובכך להגדיל את המספר האפשרי של עקירות שיכולות להתרחש בו זמנית. בתור שכזה, המעשיות והיעילות של שיטות חילוץ בתפוקה גבוהה ניכרות ומיושמות לעיבוד דגימות סביבתיות החל^{קרקע 3,,4 ורקמות} צמח^3,,5 כדי חומר צואתי אנושי^2.

בעוד שיטות אלה יכול להאיץ באופן דרמטי לאורך עיבוד מדגם וחילוץ DNA, השלב הראשוני של טעינת קרקע ודגימות אקולוגיות אחרות לתוך 96-באר צלחות הוא רגיש זיהום חוצה דגימות. סוג זה של זיהום טוב יכול להתרחש^במהלךעקירות DNA 6^,7,8 , בארות פגיעות^במיוחדבשלב הראשון זה לפני דגימות מושהות בתמיסת חיץ. McPherson ואח^{'9 להפגין שיטה} לטעון קרקעות rhizosphere לתוך 96-גם צלחות באמצעות משפך ו8-well כיסויים רצועת PCR, אבל בעוד השיטה שלהם היא גישה מבוקרת יותר לטעינת צלחות, זה עדיין מספק הזדמנות מספיקה לזיהום של בארות שכנות בעת טעינת כל מדגם. בנוסף, בארות פתוחות לאפשר את ההזדמנות עבור חוקר מוסח למקם דגימה לתוך הבאר הלא נכונה או להוסיף דגימה לתוך באר שכבר נטען. בנוסף, מגוון סוגי דגימות להוכיח להיות לא מתאים לטעינה עם שיטה זו; דגימות רטובות לעתים קרובות להיצמד משפך ודגימות יבש 'לקפוץ' בין בארות בשל חשמל סטטי.

כדי להפחית את ההזדמנויות לזיהום בין בארות בשלב הראשון של עקירות DNA בתפוקה גבוהה, פיתחנו גישה חדשה להעמסת דגימות קרקע לתוך צלחות 96-באר. השיטות שלנו מגנות על בארות מפני חשיפה סביבתית ומונעות מאיתנו לטעון בטעות דגימות מרובות לבאר אחת (טעינה כפולה). אנו מאמינים השיטה שדווחה להלן מבטיח להפחית את הפוטנציאל לזיהום ולכן מספק אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות עבור הפקת DNA עוקבות.

Protocol

1. ספסל מעבדה והכנת כלי להעמסת צלחת 96 באר

1. ספסל נקי על ידי ערפל עם 70% אתנול. מנגבים ותנו לאוויר להתייבש לפני ריסוס הספסל עם 10% אקונומיקה. נגב את הספסל יבש.
2. לחטא מיקרו סקופולה, מרית, ומספריים כירורגיים (מעוקל) על ידי טבילה ב 95% אתנול ולאחר מכן לחשוף להבה. טובלים כל אחד ב-10% אקונומיקה ומאפשרים לייבש אוויר לפני השימוש.
   הערה: יש לחטא כלים בין כל דוגמה.

2. הכנת דגימה משנה ודגימה

1. לחטא כפפות באמצעות אתנול לפני דגימה משנה.
2. המגן דגימות קרקע ביסודיות לפני דגימת משנה.
3. באמצעות כלים מעותים, טען צינור צנטריפוגה 2 מ"ל עם מדגם עד כחצי מלא.
4. חזור על שלב 2.2 עד שכל 95 הדגימות נדגמו תת-דגימה לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל. הבאר^ה-96 צריכה לשמש כריק חילוץ.
   הערה: שלבים 2.3 ו- 2.4 נעשים כדי למזער את שטח האחסון הנדרש ולמנוע דגימה מעל או כפולה.
5. לאחסן 2 מ"ל תת מדגם צינורות על קרח עד טעינת צלחת.
6. תווית 96 סטרילי 200 μL שטוח כתרים PCR שפופרות A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. מניחים את הצינורות האלה לפי סדר במדף של 96 באר.
7. הקצה מזהה לדוגמה עם מיקום טוב (A1\u2012H12) והקלט אותו.

3. הכנת צלחת

1. מוציאים את כיסוי הגומי מצלחת 96 באר(איור 1A-1C)ומניחים אותו בשקית פלסטיק סטרילית (ראה טבלת חומרים). לאטום את שקית הפלסטיק כדי למנוע זיהום.
2. לכסות את צלחת 96-באר עם סרט איטום (איור 1D-1E); לדוגמה, השתמש בסרט איטום ניתן לחיתוך מראש (ראה טבלת החומרים). ודאו את החותם על-ידי גלגול עם רולר גומי.
   הערה: מחצלות סיליקון ניתן לפירסינג עשויות להציע אפשרות שימוש חוזר, בתנאי ניקוי מתאים בין שימושים, אבל מחצלות הסיליקון שבדקנו לפצל בקלות לאורך פירסינג ולא יציע הגנה שווה לכל הצלחות הבאות.
3. מניחים את הצלחת במקרר (4°C) כדי לשמור על קור רוח.

4. העברת תת-דגימות

הערה: ראה שלב 4.13 לשינויים כאשר דגימת הקרקע קטנה מאוד.

1. מניחים 24 מתוך 2 דגימות משנה מ"ל לתוך בלוק קרח לאחסון קר.
2. באמצעות שם המדגם וגליון מיקום היטב לבחור את נכון 200 μL שטוח כתרים PCR שפופרת.
3. קח צינור תת-מדגם 2 מ"ל ומערבולת עבור ~ 5 s כדי להבטיח homogenization.
4. באמצעות להבה ואקונומיקה כלים מעוקרים לטעון ~ 200 μL של הדגימה הראשונה לתוך צינור PCR שטוח כתרים הנכון(איור 1F).
5. חזור על שלבים 4.2\u20124.4 עד שכל 24 הדגימות נטענו. ואז תעבור לשלב 4.6.
6. באמצעות מגבון נייר טבול באקונומיקה, נקה את החלק החיצוני של צינור PCR שטוח 200 μL.
7. הפוך את הצינור והקש על הספסל כדי להעביר דגימה לראש הצינור. עם מספריים מולבן ועיקור להבה, קליפ החלק התחתון של צינור PCR כדי ליצור פתח עבור מדגם ליפול לתוך צלחת 96-באר(איור 1G).
8. אתר את הבאר הנכונה על צלחת 96-באר ולהעביר את הצינור על פני צלחת עם קצה לחתוך פונה כלפי למעלה עד שהגיע לבאר זו. הטה מעט את הצלחת כדי להקל על ניקור של סרט איטום ניתן פירסינג מראש, ורק כאשר הצינור הוא ישירות מעל הנכון היטב בזהירות להפוך אותו כך קצה לחתוך מתאים לתוך הבאר. באמצעות כלים מחטאים, הקש על החלק העליון של צינור PCR עד שכל האדמה נפלה מהצינור לתוך הבאר. להשאיר את הצינור בתוך הבאר עם מכסה סגור(איור 1H-1J).
9. הסר אחד שטוח כתרים 200 μL PCR שפופרת בכל פעם ולהוסיף 750 μL של תמיסת חרוז לבאר זו(איור 1K). לדחוף את 200 μL שטוח כתרים PCR צינור כל הדרך למטה לתוך הבאר ולסמן את החלק העליון עם חדות כדי לציין כי גם זו כבר נטען. חזור על פעולה זו עבור כל דוגמה.
10. לאחר כל 24 הדגימות נטענו פתרון חרוז נוסף, להסיר את 2 mL תת מדגם צינורות ולהחליף עם 24 צינורות לא מדגמים.
11. חזור על שלבים 4.1\u20124.10 עד שכל 95 הבאות נטענו עם פתרון מדגם או ריק וחרוז. הסר צינורות מבלי להעביר אותם מעל בארות פתוחות(איור 1L).
12. בזהירות להסיר סרט פירסינג ולהחליף את כיסוי גומי כדי להגן על הצלחת עד תחילת החילוץ (איור 1M-1O).
13. עבור כמויות קטנות מאוד של אדמה כי הם גם דק מגורען, להוסיף 750 μL של תמיסת חרוז לצינור המדגם ולהשתמש קצה פיפטה רחב נשא להעביר את כל התוכן לבאר המתאימה. מקם שפופרת PCR לתוך הפתח כדי למנוע טעינה כפולה.
    הערה: היזהר בעת יישום שינוי זה כחומר אורגני חלקיקים או שברי סלע קטנים גדולים יותר מהשעמם של קצה פיפטה יכול לסתום את הפיפטה והפוך את העברת slurry מדגם קשה.
14. כצורך להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס ולאחסן צלחות עמוסות בתמיסת מדגם וחרוז עד לחילוץ מתוכנן.

5. השוואה של שיטות טעינת לוחות

הערה: על מנת לאמת את השיטה החדשן שלנו לטעינת לוחות חילוץ DNA 96-באר, חילקנו צלחת אחת 96-באר לשלושה חלקים. השתמשנו בשלוש שיטות שונות של טעינת צלחת כדי להשוות פוטנציאל לטעינה לא מכוונת של אדמה וזיהום צולב. שלוש השיטות שבהן השתמשנו היו השיטות המתוארות במקפירסון ואח'⁹, פרוטוקול הטעינה המוגדר כברירת מחדל של Qiagen¹⁰, והפרוטוקול שאנו מתארים בפרסום זה.

1. העמסת אדמה לתוך הצלחת
   1. חלק צלחת 96-באר לשלושה בלוקים ארבע עמודות. טען כל בלוק באמצעות אחת משלוש השיטות שהוזכרו לעיל.
   2. העמיסו אדמה לתוך כל באר אחרת כדי שהדגימה והבארות הריקות יתנודדו. הסדר זה מאפשר הזדמנות מקסימלית לטעינה דגימה בשוגג וזיהום צולב.
   3. מקפיאים את צלחת 96 באר ב -20 מעלות צלזיוס עד לחילוץ DNA.
2. הפקת דנ"א
   1. לחלץ DNA על פי פרוטוקול החילוץ צלחת 96-באר של^{היצרן 10}.
   2. לאחסן את תמציות ה-DNA ב -20 ° C עד לניתוח נוסף.
3. כימות דנ"א בארות ריקות
   1. להפשיר תמציות DNA בטמפרטורת החדר, מערבולת ולהסתובב למטה באמצעות טווה צלחת.
   2. למדוד ולתקליט ריכוזי DNA של בארות ריקות באמצעות ספקטרופוטומטר.
   3. השתמש בבדיקה שלאחר הניק של ANVOA ו-Tukey כדי לנתח את ההבדלים בריכוז הדנ"א הממוצע בארות ריקות.
      הערה: דווח על הבדלים משמעותיים ב- α = 0.05.

Results

שיטה חדשנית זו שימשה בהצלחה כדי לטעון 96-well חילוץ לוחות. השוואה בין שיטות טעינת לוחות הראתה את השיטה שלנו שיש ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר בארות ריקות. ריכוז ה-DNA בארות הריקות היה נמוך משמעותית מהשיטה המוצעת מקפירסון ואח'^שלי (p < 0.05), אם כי ריכוזי ה-DNA בשיטה שלנו לא היו שונים סטטיסטית משיטת ברירת המחדל של Qiagen(איור 2). כל שלוש השיטות המיוצרות אומר ריכוזי DNA תחת 2 ng/μL, אם כי רק השיטה החדשה שלנו הפיקה בארות ללא ריכוז DNA מדיד.

Discussion

שיטה זו מפחיתה הזדמנויות לזיהום צולב היטב תוך טעינת לוחות חילוץ מדגם בתפוקה גבוהה ומציעה אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות מעבר אסטרטגיות טעינת^{צלחת קיימות 9,10}. זיהום בין בארות יכול להיות מתפשט יותר בחילוץ צלחת 96-גם מאשר בעיות צינור יחיד, במיוחד כאשר^{אוטומטי 6,}7 , ו, אם כי לא^{נבדק במיוחד}בכל מתודולוגיה, הסיכון של זיהום צולב ניתן להניח הגבוה ביותר כאשר הבארות של לוחות החילוץ נותרים פתוחים למשך טעינת צלחת....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 מ"ל צינורות צנטריפוגה	פישרברנד	05-408-129
200 ומיקרו; צינורות מיקרו-PCR L	Thermo Scientific	AB 2000
ערכת מיצוי DNA PowerSoil 96 בארות	Qiagen	12955-4	השתמשנו בערכת מיצוי אדמה אך כל ערכת פורמט של 96 בארות תעבוד.
בלוק קרח לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל	כל		כל גוש קרח המיועד לצינורות של 2 מ"ל יעבוד
בלוק קרח עבור 200 ומיקרו; צינורות מיקרו-PCR	L כל	כל	גוש קרח המיועד ל -200 ומיקרו; צינורות L יעבדו
מיקרו סקופולה	כל
סרט איטום חתוך מראש	Excel Scientific	XPS25
מרית	כל
מספריים כירורגיים	כל