מעקב אחר חולדות בתאי מיזוג אופרנט באמצעות מצלמת וידאו רב-תכליתי ביתית ו-DeepLabCut

Erik  K. H. Clemensson; Morteza Abbaszadeh; Silvia Fanni; Elena Espa; M. Angela Cenci

doi:10.3791/61409

Method Article

מעקב אחר חולדות בתאי מיזוג אופרנט באמצעות מצלמת וידאו רב-תכליתי ביתית ו-DeepLabCut

DOI:

10.3791/61409

⸱

June 15th, 2020

Erik K. H. Clemensson¹ , Morteza Abbaszadeh¹ , Silvia Fanni¹ , Elena Espa¹ , M. Angela Cenci¹

¹Basal Ganglia Pathophysiology Unit, Dept. Experimental Medical Science, Lund University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מצלמת וידאו קטנה ומגוונת, וכיצד להשתמש בסרטוני וידאו שהושגו ממנו כדי להכשיר רשת עצבית כדי לעקוב אחר מיקומו של בעל חיים בתוך תאי מיזוג אופרנט. זהו ערך המשלים לניתוחים סטנדרטיים של יומני נתונים שהתקבלו מבדיקות אופרנט מיזוג.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי מיזוג אופרנט משמשים לביצוע מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות בתחום מדעי המוח. הנתונים המוקלט מבוססים בדרך כלל על הפעלה של מנוף וחיישנים האף הנמצאים בתוך התאים. בעוד זה מספק תצוגה מפורטת של מתי ואיך בעלי חיים לבצע תגובות מסוימות, אין אפשרות להשתמש בו כדי להעריך התנהגויות שאינן מפעיל חיישנים. כך, להעריך כיצד בעלי חיים למקם את עצמם ולנוע בתוך החדר הוא לעתים רחוקות אפשרי. כדי להשיג מידע זה, החוקרים בדרך כלל צריכים להקליט ולנתח קטעי וידאו. יצרני תאי מיזוג אופרנט יכולים בדרך כלל לספק ללקוחותיה הגדרות מצלמה באיכות גבוהה. עם זאת, אלה יכולים להיות יקרים מאוד לא בהכרח להתאים לתאים מיצרנים אחרים או אחרים הגדרות בדיקה התנהגותית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבנות מצלמת וידאו זולה ורב-תכליתית באמצעות רכיבים אלקטרוניים תחביב. זה עוד מתאר כיצד להשתמש בניתוח תמונה חבילת תוכנה deeplabcut כדי לעקוב אחר הסטטוס של אות אור חזק, כמו גם את המיקום של עכברוש, בקטעי וידאו שנאספו מחדר התניה תניה אופרנטית. הראשון הוא עזר רב בעת בחירת קטעים קצרים של עניין בקטעי וידאו המכסה את כל הבדיקות הבדיקה, והאחרון מאפשר ניתוח של פרמטרים שאין אפשרות לקבל מיומני הנתונים המיוצרים על ידי האופרנט תאי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתחום של מדעי ההתנהגות, החוקרים בדרך כלל להשתמש בתאי התניה תניה אופרנטית כדי להעריך מגוון רחב של תכונות קוגניטיביות ופסיכיאטריות שונות במכרסמים. בעוד יש כמה יצרנים שונים של מערכות כאלה, הם בדרך כלל חולקים תכונות מסוימות יש עיצוב כמעט סטנדרטית¹^,²^,³. התאים בדרך כלל מרובעים או בצורת מלבן, עם קיר אחד שניתן לפתוח להצבת בעלי חיים בפנים, ואחד או שניים מהקירות הנותרים המכילים רכיבים כגון ידיות, פתחים מהאף, מגשי תגמול, גלגלי תגובה ואורות מסוגים שונים¹^,²^,³. האורות והחיישנים המצויים בתאי משמשים לשליטה בפרוטוקול הבדיקה ולמעקב אחר התנהגויות בעלי החיים¹^,²^,³^,⁴^,⁵. מערכות המיזוג הטיפוסיות מאפשרות ניתוח מפורט מאוד של האופן שבו בעלי החיים מתקשרים עם האופרנדה והפתחים השונים המצויים בחדרי המגורים. באופן כללי, בכל המקרים שבהם חיישנים מופעלים ניתן להקליט על-ידי המערכת, וממשתמשים נתונים אלה יכולים לקבל קבצי יומן רישום מפורטים המתארים את מה שבעל החיים עשה במהלך צעדים ספציפיים של המבחן⁴^,⁵. בעוד הדבר מספק ייצוג נרחב של ביצועי בעל חיים, ניתן להשתמש בו רק כדי לתאר התנהגויות שמפעילות ישירות חיישן אחד או יותר⁴^,⁵. ככאלה, היבטים הקשורים לאופן שבו החיה משתנה ונעה בתוך החדר בשלבים שונים של המבדק לא מתוארים היטב⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. זה מצער, כאשר מידע כזה יכול להיות בעל ערך להבנה מלאה של התנהגותו של בעל החיים. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי להבהיר מדוע בעלי חיים מסוימים מבצעים גרוע על מבחן מסוים⁶, כדי לתאר את האסטרטגיות כי בעלי חיים עשויים להתפתח כדי להתמודד עם משימות קשות⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰, או להעריך את המורכבות האמיתית של התנהגויות פשוטות כביכול¹¹^,¹². כדי לקבל מידע כזה ברור, החוקרים בדרך כלל לפנות ניתוח ידני של קטעי וידאו⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹.

כאשר הקלטת קטעי וידאו מתאי מיזוג אופרנט, בחירת המצלמה היא קריטית. הלשכה ממוקמים בדרך כלל בתאי בידוד, עם פרוטוקולים לעתים קרובות נעשה שימוש בשלבים שבהם אין אור גלוי זורחת³^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. לכן, השימוש בתאורה אינפרא אדומה (IR) בשילוב עם מצלמה בעלת רגישות לאינפרא-אדום הוא הכרחי, שכן הוא מאפשר ניראות גם בחשיכה מוחלטת. יתר על כן, השטח הזמין עבור הצבת מצלמה בתוך תא הבידוד הוא לעתים קרובות מאוד מוגבל, כלומר אחד הטבות בחוזקה מפני שיש מצלמות קטנות המשתמשות עדשות עם שדה רחב של נוף (למשל, עדשות העין דגים)⁹. בעוד יצרנים של מערכות מיזוג תניה אופרנטית יכול לעתים קרובות לספק הגדרות מצלמה באיכות גבוהה ללקוחות שלהם, מערכות אלה יכול להיות יקר לא בהכרח להתאים לתאים מיצרנים אחרים או הגדרות עבור בדיקות התנהגותיות אחרות. עם זאת, יתרון בולט על באמצעות מצלמות וידאו עצמאי היא כי כיוונונים אלה יכולים לעתים קרובות ממשק ישירות עם מערכות מיזוג תניה אופרנטית¹³^,¹⁴. באמצעות זה, הם יכולים להיות מוגדרים רק להקליט אירועים ספציפיים ולא הפעלות בדיקה מלאה, אשר יכול לסייע מאוד בניתוח שלהלן.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבנות מצלמת וידאו זולה ורב-תכליתית באמצעות רכיבים אלקטרוניים תחביב. המצלמה משתמשת עדשה פישאי, הוא רגיש התאורה ir ויש לו סט של דיודות פולטות אור ir (ir נוריות) מצורף אליו. כמו-כן, היא בנויה על פרופיל שטוח ודק. יחד, היבטים אלה להפוך אותו אידיאלי עבור קלטות וידאו מתוך חדרי המיזוג הזמינים מסחרית ביותר, כמו גם הגדרות אחרות בדיקות התנהגותיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לעבד סרטי וידאו שהתקבלו עם המצלמה וכיצד להשתמש חבילת תוכנה deeplabcut¹⁵^,¹⁶ כדי לסייע בחילוץ רצפי וידאו של עניין, כמו גם מעקב אחר תנועות של בעל חיים בו. פעולה זו משלבת חלקית את החלק האחורי של שימוש במצלמה עצמאית על הפתרונות המשולבים שסופקו על-ידי יצרני מערכות המיזוג, ומציעה משלים לניקוד ידני של התנהגויות.

המאמצים נעשו כדי לכתוב את הפרוטוקול בפורמט כללי כדי להדגיש כי התהליך הכולל ניתן להתאים קטעי וידאו מבדיקות שונות מיזוג. כדי להמחיש מושגים מרכזיים מסוימים, קטעי וידאו של חולדות ביצוע התגובה הטורית 5 בחירה במבחן הזמן (5CSRTT)¹⁷ משמשים כדוגמאות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים טיפול בבעלי חיים אושרו על ידי ועדה אתית מאלמו-Lund לחקר בעלי חיים.

1. בניית מצלמת וידאו

הערה: רשימה של הרכיבים הנחוצים לבניית המצלמה מסופקת בטבלת החומרים. התייחס גם לאיור 1, איור 2, איור 3, איור 4, איור 5.

חברו את טבעת המתכת המגנטית (המלווה את חבילת העדשה של הפישאי) סביב הפתיחה של מעמד המצלמה (איור 2 א). זה יאפשר עדשה פישאי להיות ממוקם מול המצלמה.
חבר את מודול המצלמה למעמד המצלמה (איור 2B). זה ייתן קצת יציבות מודול המצלמה ולהציע קצת הגנה על מעגלים אלקטרוניים.
פתח את יציאות המצלמה במודול המצלמה ובמיקרו-מחשב (איור 1) על-ידי משיכת בעדינות בקצות קליפי הפלסטיק שלהם (איור 2c).
הצב את כבל רצועת הכלים ביציאות המצלמה, כך שמחברי הכסף פונים ללוחות המעגלים (Figure2C). נעל את הכבל במקומו על-ידי דחיפה בקובצי הפלסטיק של יציאות המצלמה.
מניחים את המיקרו-מחשב במארז הפלסטיק ומכניסים את כרטיס ה-micro SD הרשום (איור 2D).
הערה: כרטיס ה-SD המיקרו יתפקד ככונן הקשיח של המיקרו-מחשב ומכיל מערכת הפעלה מלאה. הכרטיס הרשום מיקרו SD מגיע עם מנהל ההתקנה מראש על זה (חדש מחוץ לקופסא תוכנה (NOOBS). כחלופה, ניתן לכתוב תמונה של הגרסה העדכנית ביותר של מערכת ההפעלה של microcomputer (שרבית או Rasberry Pi OS) לכרטיס micro SD כללי. לסיוע עם זה, אנא פנה למשאבי אינטרנט רשמיים¹⁸. עדיף להשתמש בכיתה 10 מיקרו SD כרטיס עם 32 ג'יגה-בתים של שטח אחסון. כרטיסי SD גדולים יותר עשויים שלא להיות תואמים באופן מלא למיקרו-מחשב המפורט.
חבר צג, לוח מקשים ועכבר למיקרו-מחשב ולאחר מכן חבר את ספק הכוח שלו.
בצע את השלבים כפי שתתבקש על-ידי מדריך ההתקנה לבצע התקנה מלאה של מערכת ההפעלה של המיקרו-מחשב (שרביאן או Rasberry Pi OS). כאשר המיקרו-מחשב אותחל, ודא שהוא מחובר לאינטרנט דרך כבל ethernet או Wi-Fi.
בצע את השלבים המפורטים להלן כדי לעדכן את חבילות התוכנה המותקנת מראש של המיקרו-מחשב.
1. פתח חלון מסוף (איור 3A).
2. סוג "sudo apt-קבל עדכון" (ללא מרכאות) ולחץ על מקש Enter (איור 3B). המתן עד שהתהליך יסיים.
3. הקלד "sudo apt שדרוג מלא" (ללא מרכאות) והקש enter. בצע היענויות לחצנים כשתתבקש והמתן לסיום התהליך.
תחת תפריט ההתחלה , בחר העדפות ותצורות של פטל Pi (איור 3c). בחלון הפתוח, עבור אל הכרטיסיה ממשקים ולחץ כדי להפעיל את המצלמה והI2C. הדבר נדרש לצורך הפעלת המיקרו-מחשב עם המצלמה ומודולי IR LED.
שנה את שם הקובץ המשלים 1 ל-"Pi_video_camera_Clemensson_2019. py". העתק אותו על מקל זיכרון USB, ולאחר מכן אל התיקיה המיקרו-מחשב/pi (איור 3D). קובץ זה הוא סקריפט פיתון, אשר מאפשר הקלטות וידאו להתבצע עם מתגי לחצנים המחוברים בשלב 1.13.
בצע את השלבים המפורטים להלן כדי לערוך את ה-rc של מחשב המיקרו. הדבר גורם למחשב להפעיל את ה-script שהועתק בשלב 1.10 ולהפעיל את נוריות IR המחוברות בשלב 1.13 כאשר הוא מאותחל.
התראה: תכונת הפעלה אוטומטית זו אינה פועלת באופן אמין עם לוחות microcomputer שאינם המודל המפורט.
1. פתח חלון מסוף, הקלד "sudo nano/etcc/ru.lesataa" (ללא מרכאות) והקש enter. פעולה זו תפתח קובץ טקסט (איור 4A).
2. השתמש במקשי החצים של המקלדת כדי להזיז את הסמן למטה אל הרווח בין "fi" ו "יציאה 0" (איור 4A).
3. הוסף את הטקסט הבא כמוצג באיור 4B, כתוב כל מחרוזת טקסט בשורה חדשה:
  i2cset-y 1 0x70 0x70 0xa5 &
  מ& הi2cset-y 1 0x70 0x70 0x0f
  מבצע i2cset-y 1 0x70 0x70 0x70 &
  מבצע i2cset-y 1 0x70 0x70 0x70 &
  i2cset-y 1 0x70 0x70 0x70 &
  i2cset-y 1 0x70 0x70 0x70 &
  sudo פיתון/home/pi/Pi_video_camera_Clemensson_2019. py &
4. שמור את השינויים על-ידי הקשה על Ctrl + x ואחריו y והזן.
הלחמה יחד את הרכיבים הנחוצים כפי שצוין באיור 5A, וכמתואר להלן.
1. עבור שני נוריות צבעוניות, לחבר שאיפה וכבל מגשר נקבה לרגל אחת, ואת כבל מגשר נקבה לשני (איור 5A). נסה לשמור על הכבלים קצרים ככל האפשר. שים לב אילו של האלקטרודות של LED הוא אחד שלילי (בדרך כלל הקצר), כמו זה צריך להיות מחובר לקרקע על המטרה הכללית של מיקרומחשב הקלט/פלט (GPIO) פינים.
2. עבור שני מתגי לחצנים, חבר כבל מגשר נקבה לכל רגל (איור 5A). הפוך את הכבלים לארוכים עבור אחד המתגים וקצר לשני.
3. כדי להרכיב את המודול LED IR, בצע את ההוראות הזמינות על משאבי האינטרנט הרשמי שלה¹⁹.
4. לכסות את המפרקים מולחמים עם אבובים לכווץ כדי להגביל את הסיכון של קצר מפרקי הרכיבים.
כבה את המיקרו-מחשב וחבר את המתגים ואת הנוריות לסיכות ה-GPIO שלו כפי שמצוין באיור 5B, והמתואר להלן.
התראה: חיווט הרכיבים לפיני GPIO שגויים עלולים להזיק להם ו/או למיקרו-מחשב כאשר המצלמה מופעלת.
1. חבר נורית LED אחת כך שהקצה השלילי שלו יתחבר לפינים #14 וסופו החיובי יתחבר לפינים #12. LED זה יהיה לזרוח כאשר מיקרו מחשב אותחל והמצלמה היא מוכנה לשימוש.
2. חבר את מתג הלחצן עם כבלים ארוכים כך שכבל אחד מתחבר לפינים #9 והשני להצמיד #11. לחצן זה משמש להפעלה ולעצירה של הקלטות הווידאו.
  הערה: קובץ ה-script השולט במצלמה נכתב כך שלחצן זה אינו מגיב למספר שניות רק לאחר הפעלה או הפסקה של הקלטת וידאו.
3. חבר נורית LED אחת כך שהקצה השלילי שלו יתחבר לפינים #20 וסופו החיובי יתחבר לפינים #13. נורית זו תזרח כאשר המצלמה מקליטה וידאו.
4. חבר את מתג הלחצן עם הכבלים הקצרים כך שכבל אחד מתחבר לפינים #37 והשני להצמיד #39. בורר זה משמש כדי לכבות את המצלמה.
5. חבר את מודול ה-IR LED כפי שמתואר במשאבי האינטרנט הרשמיים שלה¹⁹.

2. עיצוב פרוטוקול מיזוג האופרנט של הריבית

הערה: כדי להשתמש ב-DeepLabCut כדי לעקוב אחר התקדמות הפרוטוקול בקטעי וידאו שנרשמו מהאופרנט תאי, יש לבנות את פרוטוקולי ההתנהגות בדרכים ספציפיות, כפי שהוסבר להלן.

הגדר את הפרוטוקול לשימוש באור הבית של החדר, או באות אור חזק אחר, כמחוון לשלב מסוים בפרוטוקול (כגון התחלת מבחנים בודדים או הפעלת הבדיקה) (איור 6A). אות זה מכונה "מחוון שלב הפרוטוקול" בשאר פרוטוקול זה. הנוכחות של אות זו תאפשר מעקב אחר התקדמות פרוטוקול בקטעי וידאו מוקלטים.
הגדר את הפרוטוקול כך שירשום את כל התגובות המעניינות בחותמות זמן נפרדות ביחס למועד שבו מחוון שלב הפרוטוקול הופך לפעיל.

3. הקלטת קטעי וידאו של בעלי חיים ביצוע מבחן התנהגותי של עניין

הניחו את המצלמה מעל לתאי האופרנט, כך שהיא מתעדת את המבט העליון של האזור בתוך (איור 7).
הערה: הדבר מתאים במיוחד ללכידת תנוחה כללית של בעלי חיים בתוך החדר. הימנע מהצבת נוריות החיווי של המצלמה ומודול נורית ה-IR קרוב לעדשת המצלמה.
הפעל את המצלמה על-ידי חיבורו לשקע חשמל באמצעות כבל אספקת החשמל.
הערה: לפני השימוש הראשון, מועיל להגדיר את מוקד המצלמה, תוך שימוש בכלי קטן המלווה את מודול המצלמה.
השתמש בלחצן המחובר בשלב 1.13.2 כדי להתחיל ולהפסיק הקלטות וידאו.
כבה את המצלמה על-ידי ביצוע שלבים אלה.
1. דחף והחזק את הלחצן המחובר בשלב 1.13.4 עד לחיבור ה-LED המחובר בשלב 1.13.1. פעולה זו מאתחלת את תהליך הכיבוי של המצלמה.
2. המתן עד שנורית ה-LED הירוקה תופיע מעל המיקרו-מחשב (איור 1) הפסיקה להבהב.
3. הסר את ספק הכוח של המצלמה.
  התראה: ניתוק ספק הזרם כאשר המיקרו-מחשב עדיין פועל עלול לגרום לפגם בנתונים בכרטיס ה-micro SD.
חבר את המצלמה לצג, למקלדת, לעכבר ולהתקן אחסון USB ואחזר את קבצי הווידאו משולחן העבודה שלו.
הערה: הקבצים נקראים על פי התאריך והשעה שבהם הופעלה הקלטת וידאו. עם זאת, למיקרו-מחשב אין שעון פנימי ורק מעדכן את הגדרת הזמן שלו כאשר הוא מחובר לאינטרנט.
המר את סרטי הווידאו המוקלטות מ-. h264 to. MP4, כמו האחרון עובד היטב עם DeepLabCut ורוב נגני המדיה.
הערה: קיימות מספר דרכים להשיג זאת. אחת מהן מתוארת בקובץ המשלים 2.

4. ניתוח סרטי וידאו באמצעות DeepLabCut

הערה: deeplabcut הוא חבילת תוכנה המאפשרת למשתמשים להגדיר כל אובייקט של עניין בסדרה של מסגרות וידאו, ולאחר מכן להשתמש באלה כדי להכשיר רשת עצבית במעקב אחר מיקומי האובייקטים בווידאו באורך מלא¹⁵^,¹⁶. סעיף זה מספק מיתאר מחוספס לאופן השימוש ב-DeepLabCut כדי לעקוב אחר המצב של מחוון שלב הפרוטוקול ואת מיקומו של ראש חולדה. התקנה ושימוש של deeplabcut מתואר היטב בפרוטוקולים שפורסמו אחרים¹⁵^,¹⁶. כל צעד יכול להיעשות באמצעות פקודות פיתון ספציפי או ממשק המשתמש הגרפי של deeplabcut, כפי שמתואר במקום אחר¹⁵^,¹⁶.

צור וקבע תצורה של פרוייקט DeepLabCut חדש על-ידי ביצוע השלבים המתוארים ב-¹⁶.
השתמש DeepLabCut של מסגרת תופס פונקציה לחלץ 700 \ u2012900 מסגרות וידאו מאחד או יותר של קטעי וידאו שנרשמו בסעיף 3.
הערה: אם בעלי החיים נבדלים במידה ניכרת בפיגמנטציה או בתכונות חזותיות אחרות, רצוי כי מסגרות הווידאו המחולצות של 700 \ u2012900 מפוצלות בין קטעי וידאו של בעלי חיים שונים. באמצעות זה, רשת מאומנת אחת יכולה לשמש למעקב אחר אנשים שונים.
1. הקפד לכלול מסגרות וידאו שמציגות הן את מצב הפעילות הפעיל (איור 8A) והן את הפעולה הלא פעילה (איור 8a) של מחוון שלב הפרוטוקול.
2. הקפידו לכלול מסגרות וידאו המכסות את טווח התנוחות, התנוחות ותנועות הראש שהעכברוש עשוי להראות במהלך הבחינה. זה צריך לכלול מסגרות וידאו שבו החולדה עומדת עדיין באזורים שונים של החדר, עם הראש שלה מצביע על כיוונים שונים, כמו גם מסגרות וידאו שבו החולדה היא באופן פעיל התנועה, הכניסה לחטט האף וכניסה שוקת הגלולה.
השתמש בארגז הכלים של התיוג DeepLabCut כדי לסמן ידנית את המיקום של ראש החולדה בכל מסגרת וידאו שחולצו בשלב 4.2. השתמשו בסמן העכבר כדי למקם תווית "ראש" במיקום מרכזי בין אוזני העכברוש (איור 8א, ב). בנוסף, סמנו את מיקומו של אור הבית של החדר (או מחוון שלב אחר של הפרוטוקול) בכל מסגרת וידאו שבה היא זורחת באופן פעיל (איור 8A). השאר את אור הבית ללא תווית במסגרות שבהן הוא אינו פעיל (איור 8B).
השתמש ב-DeepLabCut של "ליצור הדרכה ערכת נתונים" ו "רשת הרכבת" פונקציות כדי ליצור הדרכה ערכת נתונים מתוך מסגרות וידאו המסומנים בשלב 4.3 ולהתחיל את ההכשרה של רשת עצבית. הקפד לבחור "resnet_101" עבור סוג הרשת הנבחר.
להפסיק את ההכשרה של הרשת כאשר אובדן האימון יש plateaued מתחת 0.01. הדבר עשוי להימשך עד 500,000 חזרות אימונים.
הערה: בעת שימוש במכונת GPU עם כ-8 GB של זיכרון וערכת אימונים של כ-900 מסגרות וידאו (רזולוציה: 1640 x 1232 פיקסלים), תהליך ההכשרה נמצא לוקח כ-72 h.
השתמש בניתוח וידאו של DeepLabCut כדי לנתח קטעי וידאו שנאספו בשלב 3, באמצעות רשת עצבית מאומן בשלב 4.4. פעולה זו תספק קובץ. csv המפרט את המיקומים המסומנים של ראש העכברוש ואת מחוון שלב הפרוטוקול בכל מסגרת וידאו של סרטי הווידאו שנותחו. בנוסף, הוא ייצור קבצי וידאו מסומנים שבהם המיקומים המסומנים מוצגים באופן חזותי (סרטוני וידאו 1-8).
הערך את הדיוק של המעקב על-ידי ביצוע השלבים המפורטים להלן.
1. השתמש בפונקציה המובנית של DeepLabCut כדי לקבל הערכה אוטומטית של דיוק המעקב של הרשת. הדבר מבוסס על מסגרות הווידאו שסומנו בשלב 4.3 ומתארת עד כמה רחוק בממוצע המיקום הנמצא במעקב על-ידי הרשת הוא מהתווית הממוקמת באופן ידני.
2. בחר רצף וידאו אחד או יותר קצר (של כ-100 \ u2012200 מסגרות וידאו כל אחד) בקטעי וידאו מסומנים שהתקבלו בשלב 4.6. עבור את רצפי וידאו, מסגרת לפי מסגרת, ולשים לב כמה מסגרות התוויות מציינות כראוי את המיקומים של ראש החולדה, זנב, וכו ', ובכמה מסגרות התוויות ממוקמות במיקומים שגויים או לא מוצגים.
  1. אם התווית של חלק גוף או אובייקט אבדה לעתים קרובות או ממוקמת במיקום שגוי, זהה את המצבים שבהם המעקב נכשל. חלץ והוסף מסגרות עם תוויות של אירועים אלה על-ידי חזרה על שלבים 4.2. ו-4.3. לאחר מכן הרכבת מחדש את הרשת וניתוח מחדש של סרטי הווידאו על-ידי שלבים חוזרים 4.4-4.7. בסופו של דבר, יש להשיג את דיוק המעקב של > 90%.

5. קבלת קואורדינטות לנקודות עניין בלשכת המבצע

השתמש ב-DeepLabCut כפי שמתואר בשלב 4.3 כדי לסמן באופן ידני נקודות עניין בתאי האופרנט (כגון פתחים מהאף, מנופים, וכו ') במסגרת וידאו אחת (איור 8C). אלה נבחרו באופן ידני בהתאם לאינטרסים ספציפיים ללמידה, למרות שהמיקום של מחוון שלב הפרוטוקול צריך תמיד להיכלל.
אחזר את הקואורדינטות של נקודות העניין המסומנות בקובץ ה-. csv ש-DeepLabCut מאחסן באופן אוטומטי תחת "נתונים מסומנים" בתיקיית הפרוייקט.

6. זיהוי פלחי וידאו שבהם מחוון שלב הפרוטוקול פעיל

טען את קבצי ה-. csv שהתקבלו מניתוח וידאו DeepLabCut בשלב 4.6 לתוך תוכנת ניהול נתונים של בחירה.
הערה: בשל הכמות והמורכבות של הנתונים המתקבלים ממערכות מיזוג והפעלה של DeepLabCut, ניהול הנתונים מתבצע בדרך הטובה ביותר באמצעות סקריפטים לניתוח אוטומטי. כדי להתחיל עם זה, עיין במדריכים ברמה ההתחלתית הזמינים במקומות אחרים²⁰^,²¹^,²².
שים לב באילו מקטעי וידאו מתבצע מעקב אחר מחוון שלב הפרוטוקול בתוך 60 פיקסלים של המיקום המתקבל בסעיף 5. אלה יהיו תקופות שבהן מחוון שלב הפרוטוקול פעיל (איור 6B).
הערה: במהלך מקטעי וידאו שבהם מחוון שלב הפרוטוקול אינו מאיר, ייתכן שהווידאו המסומן כשהוא מציין ש-DeepLabCut אינו מאתר אותו במיקום כלשהו. עם זאת, זהו המקרה לעתים רחוקות, והוא מאותר בדרך כלל במיקומים מפוזרים רבים.
חלץ את נקודת ההתחלה המדויקת עבור כל תקופה שבה מחוון שלב הפרוטוקול פעיל (איור 6ג: 1).

7. זיהוי קטעי וידאו של עניין

שקול את הנקודות שבהן מחוון שלב הפרוטוקול הופך להיות פעיל (איור 6c: 1) וחותמות הזמן של תגובות שנרשמו על-ידי תאי האופרנט (סעיף 2, איור 6c: 2).
השתמש במידע זה כדי לקבוע אילו מקטעי וידאו מכסים אירועים מעניינים ספציפיים, כגון מרווחי זמן בין משפט, תגובות, גמול אחזורים וכו ' (איור 6C: 3, איור 6c).
הערה: בשביל זה, זכור כי המצלמה מתארת בזאת רשומות קטעי וידאו ב 30 fps.
שים לב למסגרות הווידאו הספציפיות המכסות את אירועי הריבית הללו.
אופציונלי ערוך קבצי וידאו של הפעלות בדיקה מלאה כדי לכלול רק את פלחי הריבית הספציפיים.
הערה: קיימות מספר דרכים להשיג זאת. אחת מהן מתוארת בקובץ המשלים 2 ו-3. זה עוזר מאוד בעת אחסון מספר גדול של קטעי וידאו והוא יכול גם לעשות סקירה והצגת תוצאות נוח יותר.

8. ניתוח מיקום ותנועות של בעל חיים בקטעי וידאו מסוימים

החלף את נתוני המעקב המלאים של מיקום הראש שהושג מ-DeepLabCut בשלב 4.6, כדי לכלול רק מקטעי וידאו שצוינו לפי סעיף 7.
חשב את מיקום ראש בעל החיים ביחס לאחת או יותר מנקודות ההתייחסות שנבחרו לפי סעיף 5 (איור 8C). הדבר מאפשר השוואות של מעקב ומיקום בין קטעי וידאו שונים.
לבצע ניתוח מעמיק רלוונטי של מיקום החיה ותנועותיו.
הערה: הניתוח המסוים שבוצע יהיה מאוד ספציפי ללמידה. מספר דוגמאות לפרמטרים הניתנים לניתוח ניתנות להלן.
1. המחש את עקבות הנתיב על-ידי התוויית כל הקואורדינטות שזוהו במהלך תקופה שנבחרה בתוך גרף אחד.
2. ניתוח קירבה לנקודת עניין נתונה באמצעות הנוסחה הבאה:
3. ניתוח שינויים במהירות במהלך תנועה על-ידי חישוב המרחק בין קואורדינטות מסומנים במסגרות רצופות וחילוק על-ידי 1/fps של המצלמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצועי מצלמת וידאו

התוצאות הייצוגיות נאספו בתאי מיזוג אופרנט עבור חולדות עם אזורים הרצפה של 28.5 ס"מ x 25.5 ס"מ, וגבהים של 28.5 ס"מ. כאשר העדשה הפישאי מחוברת, המצלמה לוכדת את שטח הרצפה המלא ואת החלקים הגדולים של הקירות המקיפים, כאשר ממוקמים מעל לחדר (איור 7A). ככזה, ניתן להשיג תצוגה טובה, גם אם המצלמה ממוקמת מחוץ למרכז על החלק העליון של החדר. זה אמור לשמור על האמת. לתאי האופרנט הדומים נוריות IR מסוגלות להאיר את החדר כולו (איור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מצלמת וידאו זולה וגמישה שניתן להשתמש בה כדי להקליט קטעי וידאו מתאי מיזוג אופרנט והגדרות אחרות של בדיקות התנהגותיות. זה עוד מדגים כיצד להשתמש DeepLabCut כדי לעקוב אחר אות אור חזק בתוך קטעי וידאו אלה, ואיך זה יכול לשמש כדי לסייע בזיהוי קטעי וידאו קצרים של עניין קבצי וידאו המכסה הפעלות בדיקה מלאה. לבסוף, הוא מתאר כיצד להשתמש במעקב אחר ראש חולדה כדי להשלים את ניתוח התנהגויות במהלך בדיקות אופרנט מיזוג.

הפרוטוקול מציג חלופה לפתרונות הקלטת וידאו הזמינים מסחרית עבור תאי התנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שנעשה שימוש בחומרים ובמשאבים מקרן פטל פאי בכתב היד הזה, הקרן לא הייתה מעורבת באופן פעיל בהכנה או בשימוש בציוד ובנתונים בכתב יד זה. הדבר נכון גם לגבי היצע הפאי. . למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המוח השבדי, קרן פרקינסון השוודית, וקרנות הממשלה השבדית למחקר קליני (מאק), כמו גם היסודות של ווננר-גרן (M. A. C, E. K. H. C), הקרן של ווירן (M. A. C) והקרן לבילופלור בונקומפס, בילדט (ש. פ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
כרטיס מיקרו SD בנפח 32 ג'יגה-בייט עם תוכנת הקופסה החדשה שלנו (NOOBS) מותקנת מראש	נגד ה-Pi hut (https://thpihut.com)	32GB
330-Ohm ה-Pi	hut (https://thpihut.com)100287		מאמר זה מיועד לחבילה עם נגדים מעורבים, שבה כלולים נגדים של 330 אוהם.
מודול מצלמה (מצלמת Raspberry Pi NoIR v.2)	בקתת Pi (https://thpihut.com)	100004
כבל סרט מצלמה (בדל כבל מצלמה Raspberry Pi Zero)	בקתת Pi (https://thpihut.com)	MMP-1294	זה נחוץ רק אם נעשה שימוש באפס Raspberry Pi. אם נעשה שימוש בלוח Raspberry Pi אחר, כבל סרט מצלמה מתאים מלווה את רכיב המצלמה
נוריות LED צבעוניות	בקתת ה-Pi (https://thpihut.com)	ADA4203	מאמר זה מיועד לחבילה עם צבעים מעורבים של נוריות LED. ניתן להשתמש בכל צבע.
כבלי מגשר נקבה-נקבה	בקתת ה-Pi (https://thpihut.com)	מודול LED IR ADA266
(Bright Pi	אספקת Pi (https://uk.pi-supply.com)	PIS-0027
(לוח Raspberry Pi Zero עם כותרות מולחמות מראש)בקתת	ה-Pi (https://thpihut.com)102373		ניתן להשתמש גם בלוחות Raspberry Pi אחרים, אם כי השיטה להפעלה אוטומטית של סקריפט Python עובדת רק עם Raspberry Pi zero. אם משתמשים במודלים אחרים, יש להפעיל את סקריפט ה-python באופן ידני.
מתג כפתור לחיצה	בקתת ה-Pi (https://thpihut.com)	ADA367
כבל אספקת החשמל של Raspberry Pi	Hutt (https://thpihut.com	)102032
מארז Raspberry Pi Zero	בקתת ה-Pi (https://thpihut.com)	102118
Raspberry Pi, Mod my pi, מעמד למצלמה עם עדשת עין דג מגנטית וחיבור טבעת מתכת מגנטית	בקתת ה-Pi (https://thpihut.com)	MMP-0310-קיט

)לוח אם למיקרו-מחשב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pritchett, K., Mulder, G. B. Operant conditioning. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (4), (2004).
Clemensson, E. K. H., Novati, A., Clemensson, L. E., Riess, O., Nguyen, H. P. The BACHD rat model of Huntington disease shows slowed learning in a Go/No-Go-like test of visual discrimination. Behavioural Brain Research. 359, 116-126 (2019).
Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-choice serial reaction time task: a task of attention and impulse control for rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574(2014).
Coulbourn instruments. Graphic State: Graphic State 4 user's manual. Coulbourn instruments. , Holliston, Massachusetts. 12-17 (2013).
Med Associates Inc. Med-PC IV: Med-PC IV programmer's manual. Med Associates Inc. , St. Albans, Vermont. 21-44 (2006).
Clemensson, E. K. H., Clemensson, L. E., Riess, O., Nguyen, H. P. The BACHD rat model of Huntingon disease shows signs of fronto-striatal dysfunction in two operant conditioning tests of short-term memory. PloS One. 12 (1), (2017).
Herremans, A. H. J., Hijzen, T. H., Welborn, P. F. E., Olivier, B., Slangen, J. L. Effect of infusion of cholinergic drugs into the prefrontal cortex area on delayed matching to position performance in the rat. Brain Research. 711 (1-2), 102-111 (1996).
Chudasama, Y., Muir, J. L. A behavioral analysis of the delayed non-matching to position task: the effects of scopolamine, lesions of the fornix and of the prelimbic region on mediating behaviours by rats. Psychopharmacology. 134 (1), 73-82 (1997).
Talpos, J. C., McTighe, S. M., Dias, R., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Trial-unique, delayed nonmatching-to-location (TUNL): A novel, highly hippocampus-dependent automated touchscreen test of location memory and pattern separation. Neurobiology of Learning and Memory. 94 (3), 341(2010).
Rayburn-Reeves, R. M., Moore, M. K., Smith, T. E., Crafton, D. A., Marden, K. L. Spatial midsession reversal learning in rats: Effects of egocentric cue use and memory. Behavioural Processes. 152, 10-17 (2018).
Gallo, A., Duchatelle, E., Elkhessaimi, A., Le Pape, G., Desportes, J. Topographic analysis of the rat's behavior in the Skinner box. Behavioural Processes. 33 (3), 318-328 (1995).
Iversen, I. H. Response-initiated imaging of operant behavior using a digital camera. Journal of the Experimental Analysis of Behavior. 77 (3), 283-300 (2002).
Med Associates Inc. Video monitor: Video monitor SOF-842 user's manual. Med Associates Inc. , St. Albans, Vermont. 26-30 (2004).
Coulbourn Instruments. Coulbourn Instruments. , Available from: https://www.coulbourn.com/product_p/h39-16.htm (2020).
Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
Nath, T., Mathis, A., Chen, A. C., Patel, A., Bethge, M., Mathis, M. W. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
Bari, A., Dalley, J. W., Robbins, T. W. The application of the 5-chopice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats. Nature Protocols. 3 (5), 759-767 (2008).
Raspberry Pi foundation. Raspberry Pi foundation. , Available from: https://thepi.io/how-to-install-raspbian-on-the-raspberry-pi/ (2020).
Pi-supply. Pi-supply. , Available from: https://learn.pi-supply.com/make/bright-pi-quickstart-faq/ (2018).
Python. Python. , Available from: https://wiki.python.org/moin/BeginnersGuide/NonProgrammers (2020).
MathWorks. MathWorks. , Available from: https://mathworks.com/academia/highschool/ (2020).
Cran.R-Project.org. Cran.R-Project.org. , Available from: https://cran.r-project.org/manuals.html (2020).
Liu, Y., Tian, C., Huang, Y. Critical assessment of correction methods for fisheye lens distortion. The international archives of the photogrammetry, remote sensing and spatial information sciences. , (2016).
Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
Graving, J. M., et al. DeepPoseKit, a software toolkit for fast and robust animal pose estimation using deep learning. Elife. 8 (47994), (2019).
Geuther, B. Q., et al. Robust mouse tracking in complex environments using neural networks. Communications Biology. 2 (124), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

מעקב אחר חולדות בתאי מיזוג אופרנט באמצעות מצלמת וידאו רב-תכליתי ביתית ו-DeepLabCut

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles