הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61438

⸱

30 באוגוסט 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

תקציר

Microglia הם תאים חיסוניים מולדים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS). Microglia לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח, בשמירה על הומוסטאזיס, ובמהלך זיהום או פציעה. מספר קבוצות מחקר עצמאיות הדגישו את התפקיד המרכזי כי microglia לשחק במחלות אוטואימוניות, תסמונות דלקת אוטואיציה וסרטן. ההפעלה של microglia במחלות נוירולוגיות מסוימות עשויה להשתתף ישירות בתהליכים פתוגנים. microglia העיקרי הם כלי רב עוצמה כדי להבין את התגובות החיסוניות במוח, אינטראקציות תא ופנוטיפים microglia dysregulated במחלה. microglia העיקרי לחקות תכונות microglial vivo טוב יותר מאשר קווי תא microglial מונצחים. מיקרוליה למבוגרים אנושיים להפגין תכונות נפרדות לעומת מיקרוליה העובר והכורסמים האנושיים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לבידוד של microglia ראשוני ממוח אנושי בוגר. לימוד microglia אלה יכול לספק תובנות קריטיות על אינטראקציות תא בין microglia ואוכלוסיות תאים תושבים אחרים ב-CNS כולל, oligodendrocytes, נוירונים ואסטרוציטים. בנוסף, microglia ממוחות אנושיים שונים עשוי להיות מתורבת לאפיון של תגובות חיסוניות ייחודיות לרפואה מותאמת אישית ואינספור יישומים טיפוליים.

מבוא

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בנויה של רשת מורכבת של נוירונים ותאי גליה1. בין תאי גליה, microglia לתפקד כמו התאים החיסוניים המולדים של CNS2,,3. Microglia אחראים לשמירה על הונואוסטזיס ב CNSבריא 4. Microglia גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות עצבית, על ידי גיזום סינאפסות2. Microglia הם מרכזיים הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות נוירולוגיות כולל אך לא מוגבל; מחלתאלצהיימר 5, מחלת פרקינסון6,שבץ 7, טרשת נפוצה8, פגיעה מוחיתטראומטית 9, כאבנוירופתי 10,פגיעה בחוט השדרה 11 ותגידולים במוח כגון גליומס12.

מחקרים הקשורים הומוסטאזיס CNS ומחלות לנצל microglia מכרסמים בשל דקט של עלות יעילה ויעילה בזמן אנושי ראשי microglia פרוטוקוליםבידוד 13. מיקרוליה מכרסמים דומים microglia האנושי העיקרי בביטוי של גנים כגון Iba-1, PU.1, DAP12 ו M-CSF קולטן היו יעילים בהבנת נורמלי, כמוגם מוח מחלה 13. מעניין, הביטוי של מספר גנים הקשורים למערכת החיסון כגון TLR4, MHC II, Siglec-11 ו Siglec-3 משתנה בין מיקרוליהאדם מכרסמים 13. הביטוי של מספר גנים משתנה גם בביטוי זמני ובמחלות ניווניות בשני המינים14,15. הבדלים משמעותיים אלה הופכים את המיקרוליה האנושית למודל חיוני לחקר תפקוד מיקרוליה בהומטזיס ובמחלות. microglia האנושי העיקרי יכול להיות גם כלי יעיל עבור הקרנה פרה-סרטנית של מועמדים פוטנציאליים לסמים16. הסיבות שהוזכרו לעיל מדגישות את הצורך הגובר בפרוטוקולים חסכוניים לבידוד של מיקרוליה אנושית ראשית.

פיתחנו פרוטוקול לבידוד של microglia אנושי ראשוני מרקמות מוח אנושיות בוגר שנאספו כתוצאה של חלון כירורגי שנוצר עבור ניתוחים או ניתוחים אחרים. השיטה כאן שונה במידה ניכרת מהשיטות הקיימות. הצלחנו לבודד ולתרבות מיקרוליה לאחר זמן מעבר של כ-75 דקות מאתר איסוף הרקמות כדי להתחיל את פרוטוקול הבידוד במעבדה. השתמשנו supernatant של L929 פיברובלסט תאים כדי לקדם את הצמיחה של microglia מבודד. שיטה זו מתמקדת במיוחד בתרבות ופיתוח של מיקרוליה ראשונית בלבד. התרבות שנוצרה מוכנה היא כ 80% microglia. בעוד פרוטוקולים אחרים מספקים תרבות מועשרת של microglia על ידי צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות, ציתום זרימה חרוזים מגנטיים, הפרוטוקול הוא מהיר, פשוט, חזק וחסכוני דרך לתרבות microgliaאדם העיקרי 17,18,19,20. היכולת לנצל בניתוח הוסר רקמת מוח מבוגר חי במקום רקמות מוח קבועות של גופות מוכיח יתרון נוסף של שיטה זו בניגוד הליכיםקיימים 18,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הרקמות נרכשו לאחר אישור אתי מוועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה ג'ודפור וכל המכון ההודי למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור.

1.רכישת רקמות ועיבוד (יום 0)

  1. לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של נוזל מוחי מוחי שדרתי קר כקרח (aCSF) (2 מ'מ CaCl2∙2H2O, 10 מ', 3 מ"מ KCl, 26 מ', NaHCO3,2.5 מ', 2.5 מ' נה2ת.ד. 4,1 מ"מ MgCl2∙6H2O, 202 מ'מ סוכרוז)20. ודא כי הצינור נשמר על קרח אם הרקמה צריכה להיות מועברת למיקום אחר.
    הערה: הכן aCSF במים מזוקקים autoclaved. לסנן אותו עם מסנן מזרק 0.22 μm בשכונה למינאר. ניתן לאחסן זאת למשך חודש אחד ב- 4 °C.
  2. נגבו את צינור האיסוף בזהירות עם 70% אלכוהול והעבירו לתא זרימת אוויר לאפספטי למינאר.
  3. השליכו את ה-aCSF בזהירות ושקלו רקמה במצב אספטי. משקל רקמה חיוני כדי לחשב את הנפח של trypsin-EDTA הדרוש עבור השלבים הבאים.
  4. יש לשמור את הרקמה ב-aCSF חם וטרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צעד זה הוא קריטי כדי למנוע מוות של תאים.
  5. השליכו aCSF ושטפו רקמת רקמה פעם אחת עם PBS אחד (תמיסת מלח עם פוספט) ב-37°C. ודא שכל הדם נשטף עם שטיפה חוזרת ונשנית של PBS (לפי הצורך).
  6. דגירה הרקמה PBS חם, ב 37 ° C, במשך 5 דקות.
  7. נפטרים מ-PBS בזהירות ומעבירים רקמות לצלחת פטרי עיקור. ניתן להסיר PBS באמצעות פיפטה. זה ימנע כל אובדן של רקמות.
  8. לקובות את הרקמה לתוך קטן (לפחות1 מ"מ 3)חתיכות באמצעות אזמל סטרילי. רקמה קצומה דק מספק שטח פני השטח רקמות גבוה יותר עבור פירוק רקמות על ידי trypsin-EDTA הבטחת תשואה גבוהה יותר.
  9. להעביר את הרקמה הקצוצית לצינור 50 מ"ל המכיל רקמת 10 מ"ל/גרם של 0.25% טריפסין-EDTA ולערבב על ידי pipetting דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של טריפסין/EDTA לצלחת פטרי ושוטפים את הצלחת ביסודיות בעזרת פיפטה. הוסף את הנסין הזה בחזרה לצינור הבז. זה ממזער אובדן של רקמות ותאים תוך היתוך היקוביות.
  10. דגירה הצינור על שייקר במשך 30 דקות ב 37 ° C ב 250 סל"ד. שלב זה מגביר את הדיסוציאציה של תאים מרקמות.
  11. בסוף הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של ניטרול בינוני (50% DMEM/50% F12 עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% FBS) כדי לנטרל טריפסין. מערבבים עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. כמות נטרול המדיה שנווספת צריכה להיות שווה לכמות השלושה-ניסיון בהם נעשה שימוש.
  12. צנטריפוגה הצינור ב 2,000 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות.
  13. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של תרבות בינונית (50% DMEM/50% F12 עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
    הערה: תאי L929 הם תרבות DMEM (DMEM עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% FBS). ATCC מומלץ שיטת תרבות יש לעקוב אחר תרבות התא. יש לאסוף את Supernatant מבוקון התרבות שהוא לפחות 75% confluent. ניתן לאסוף אותו בכמויות גדולות ולאחסן ב -80 °C כדי למנוע השפלה של גורמי גדילה. מומלץ להוסיף את L929 supernatant בנפרד במבחנות במקום להוסיף למדיום תרבות המניות.
  14. לוח התאים במבחנות T-25, מתאים לתאים דבקים, ולהוסיף 4 מ"ל של מדיום תרבות נוסף. דגירה הבקבוקון ב 37 ° C עם 5% CO2. לנער בזהירות את הבקבוקון כדי לפזר הומוגנית את הרקמה. הימנע להביא את התקשורת לצוואר הבקבוקון, תוך כדי טלטול, כמו זה עשוי להגדיל את הסיכויים לזיהום.

2. תרבות תאים (יום 2)

  1. לאסוף את התקשורת מבקבוק תרבות T-25 מוכן ביום 0 בשלושה צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל על ידי איסוף נפח שווה של מדיה בכל צינור. לשטוף את הבקבוקון פעם אחת עם 1 x PBS. לנער את הבקבוקון בעדינות כדי להסיר את כל שברי רקמת השריד שמאל. הימנע מרעידות קשות של הבקבוקון כמו כל שברי שריד לא ישפיע לרעה על התרבות. להוסיף 5 מ"ל מדיה תרבות טריה לבקבוקון.
  2. צנטריפוגה את המדיה שנאסף ב 1,466 x g (4000 סל"ד) ב 4 ° C במשך 4 דקות.
  3. השליכו את הסופרנט מכל שפופרת והוספו 1 מ"ל של תרבות בינונית לאחד הצינורות. מערבבים היטב עם פיפטה. הוסף באופן סדרתי את המדיה המעורבת עם תאים לצינורות אחרים. מערבבים היטב עם פיפטה ומאגרים את התאים בצינור אחד.
  4. לוח התאים במבחנון T-25 נפרד, מתאים לתאים דבקים. הוסף 4 מ"ל של תרבות בינונית ותדגירה את הבקבוקון ב-37°C עם 5% CO2.

3. תרבות תאים (יום 4)

  1. השליכו את אמצעי התקשורת משני הבקבוקונים והוספו 5 מ"ל טריים של מדיה תרבות לבקבוקון.
  2. דגירה הבקבוקון ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 2 ימים.

4. תרבות תאים (יום 6)

  1. התאים יהיו מוכנים לניסויים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל(איור 1),הצלחנו לבודד מיקרוליה אנושית ראשית מרקמות מוח ותוכותות בניתוח. תאים תרבותיים היו מוכתמים עם Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) לקטין עבור microglia (ירוק) ועם חלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP) עבור אסטרוקיטים(אדום)( איור 2 ) כפי שתוארקודם לכן 22,23,24,25,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Microglia להבטיח הומוסטאזיס במוח הרגיל ולשחק תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות שונות4. Microglia הם מרכזיים נוירו-פיתוח היווצרות של סינופסות2. מחקרים Microglial הוכיחו מרכזי בהבנת הפיתוח וההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מגוונות4. מיקרוליה מכרסמים הם המודל הנפוץ של בחירה עבור מחקרים microglial ראשוני, למרות, microglia מכרסמים שונים microglia האנושי העיקרי בהיבטיםמרכזיים 13. פיתוח של עלות יעילה, תשואה גבוהה, פרוט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

המעבדה של SJ הוקמה עם מענקים מוסדיים מ-IITJ ומומנה על ידי מענקים מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ומשרד האלקטרוניקה וטכנולוגיה של הודו (מס' 4(16)/2019-ITEA). סעיפים רקמת המוח האנושי הושגו מכל הודו המכון למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית. אנו מודים למאיאנק ראתור, סטודנט B.Tech של האגודה לעיצוב ואמנויות IIT ג'ודפור, על תמיכת הווידאוגרפיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתיתHimediaA002
סידן כלורידסיגמא223506
צנטריפוגה (4 ° C)Sigma146532
צינורות צנטריפוגהAbdosP10203
CO2 חממהניו ברונסוויקגלקסי 170 S
D-גלוקוזHimediaGRM077
DMEM מדיום עם גלוטמיןHimediaAL007S
סרום בקר עובריHimediaRM9955
שפופרת פלקון (50 מ"ל)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
פלואורסצאין Ricinus communis agglutinin-1וקטורFL-1081
מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaDM2000LED
Fluoroshield עם DAPISigmaF6057
נוגדן GFAPGA53670S
שייקר חממהניו ברונסוויק ScientificInnova 42
L929 קו תאיםATCCNCTC שיבוט 929 [תא L, L-929, נגזרת של זן L] (ATCC  CCL-1)
זרימת אוויר למינריתThermo Fsiher Scientific 1386
מגנזיום כלורידHimediaMB040
מונוסודיום פוספטMerck567545
תערובת חומרים מזינים F-12 בשר חזיר בינוניHimedia Al106S
צלחת פטריDuran Group237554805
פוספט חוצץמלח HimediaML023
אשלגן כלוריHimediaMB043
פיפטה סרולוגיתLabwareLW-SP1010
נתרן ביקרבונטHimediaMB045
סוכרוזHimediaMB025
מסנן מזרק (0.2μ, קוטר 25 מ"מ)AxivaSFPV25R
T-25 צלוחיות תרבית רקמה המתאימות לתרבית תאים דביקה.HimediaTCG4-20X10NO
טריפסין-EDTA (0.25%)Gibco ברקוד 25200-056

מקורות

  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
  3. Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
  4. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  5. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
  6. Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).
  7. Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
  8. Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
  9. Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
  10. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  11. Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518(2019).
  12. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  13. Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
  14. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  24. Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
  25. Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).
  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
  27. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Trypsin EDTA
קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.