פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Microglia הם תאים חיסוניים מולדים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS). Microglia לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח, בשמירה על הומוסטאזיס, ובמהלך זיהום או פציעה. מספר קבוצות מחקר עצמאיות הדגישו את התפקיד המרכזי כי microglia לשחק במחלות אוטואימוניות, תסמונות דלקת אוטואיציה וסרטן. ההפעלה של microglia במחלות נוירולוגיות מסוימות עשויה להשתתף ישירות בתהליכים פתוגנים. microglia העיקרי הם כלי רב עוצמה כדי להבין את התגובות החיסוניות במוח, אינטראקציות תא ופנוטיפים microglia dysregulated במחלה. microglia העיקרי לחקות תכונות microglial vivo טוב יותר מאשר קווי תא microglial מונצחים. מיקרוליה למבוגרים אנושיים להפגין תכונות נפרדות לעומת מיקרוליה העובר והכורסמים האנושיים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לבידוד של microglia ראשוני ממוח אנושי בוגר. לימוד microglia אלה יכול לספק תובנות קריטיות על אינטראקציות תא בין microglia ואוכלוסיות תאים תושבים אחרים ב-CNS כולל, oligodendrocytes, נוירונים ואסטרוציטים. בנוסף, microglia ממוחות אנושיים שונים עשוי להיות מתורבת לאפיון של תגובות חיסוניות ייחודיות לרפואה מותאמת אישית ואינספור יישומים טיפוליים.
מבוא
מערכת העצבים המרכזית (CNS) בנויה של רשת מורכבת של נוירונים ותאי גליה1. בין תאי גליה, microglia לתפקד כמו התאים החיסוניים המולדים של CNS2,,3. Microglia אחראים לשמירה על הונואוסטזיס ב CNSבריא 4. Microglia גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות עצבית, על ידי גיזום סינאפסות2. Microglia הם מרכזיים הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות נוירולוגיות כולל אך לא מוגבל; מחלתאלצהיימר 5, מחלת פרקינסון6,שבץ 7, טרשת נפוצה8, פגיעה מוחיתטראומטית 9, כאב
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הרקמות נרכשו לאחר אישור אתי מוועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה ג'ודפור וכל המכון ההודי למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור.
1.רכישת רקמות ועיבוד (יום 0)
- לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של נוזל מוחי מוחי שדרתי קר כקרח (aCSF) (2 מ'מ CaCl2∙2H2O, 10 מ', 3 מ"מ KCl, 26 מ', NaHCO3,2.5 מ', 2.5 מ' נה2ת.ד. 4,1 מ"מ MgCl2∙6H2O, 202 מ'מ סוכרוז)20. ודא כי הצינור נשמר על קרח אם הרקמה צריכה להיות מועברת למיקום אחר.
הערה: הכן aCSF במים מזוקקים autoclaved. לסנן אותו עם מסנן מזרק 0.22 μm בשכונה למינאר. ניתן לאחסן זאת למשך חודש אחד ב- 4 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול הנ"ל(איור 1),הצלחנו לבודד מיקרוליה אנושית ראשית מרקמות מוח ותוכותות בניתוח. תאים תרבותיים היו מוכתמים עם Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) לקטין עבור microglia (ירוק) ועם חלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP) עבור אסטרוקיטים(אדום)( איור 2 ) כפי שתוארקודם לכן 22,23,24,25,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Microglia להבטיח הומוסטאזיס במוח הרגיל ולשחק תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות שונות4. Microglia הם מרכזיים נוירו-פיתוח היווצרות של סינופסות2. מחקרים Microglial הוכיחו מרכזי בהבנת הפיתוח וההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מגוונות4. מיקרוליה מכרסמים הם המודל הנפוץ של בחירה עבור מחקרים microglial ראשוני, למרות, microglia מכרסמים שונים microglia האנושי העיקרי בהיבטיםמרכזיים 13. פיתוח של עלות יעילה, תשואה גבוהה, פרוט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
המעבדה של SJ הוקמה עם מענקים מוסדיים מ-IITJ ומומנה על ידי מענקים מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ומשרד האלקטרוניקה וטכנולוגיה של הודו (מס' 4(16)/2019-ITEA). סעיפים רקמת המוח האנושי הושגו מכל הודו המכון למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית. אנו מודים למאיאנק ראתור, סטודנט B.Tech של האגודה לעיצוב ואמנויות IIT ג'ודפור, על תמיכת הווידאוגרפיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית | Himedia | A002 | |
| סידן כלוריד | סיגמא | 223506 | |
| צנטריפוגה (4 ° C) | Sigma | 146532 | |
| צינורות צנטריפוגה | Abdos | P10203 | |
| CO2 חממה | ניו ברונסוויק | גלקסי 170 S | |
| D-גלוקוז | Himedia | GRM077 | |
| DMEM מדיום עם גלוטמין | Himedia | AL007S | |
| סרום בקר עוברי | Himedia | RM9955 | |
| שפופרת פלקון (50 מ"ל) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| פלואורסצאין Ricinus communis agglutinin-1 | וקטור | FL-1081 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield עם DAPI | Sigma | F6057 | |
| נוגדן GFAP | GA5 | 3670S | |
| שייקר חממה | ניו ברונסוויק Scientific | Innova 42 | |
| L929 קו תאים | ATCC | NCTC שיבוט 929 [תא L, L-929, נגזרת של זן L] (ATCC CCL-1) | |
| זרימת אוויר למינרית | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| מגנזיום כלוריד | Himedia | MB040 | |
| מונוסודיום פוספט | Merck | 567545 | |
| תערובת חומרים מזינים F-12 בשר חזיר בינוני | Himedia Al106S | ||
| צלחת פטרי | Duran Group | 237554805 | |
| פוספט חוצץ | מלח Himedia | ML023 | |
| אשלגן כלורי | Himedia | MB043 | |
| פיפטה סרולוגית | Labware | LW-SP1010 | |
| נתרן ביקרבונט | Himedia | MB045 | |
| סוכרוז | Himedia | MB025 | |
| מסנן מזרק (0.2μ, קוטר 25 מ"מ) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 צלוחיות תרבית רקמה המתאימות לתרבית תאים דביקה. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| טריפסין-EDTA (0.25%) | Gibco | ברקוד 25200-056 |
מקורות
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
