Method Article

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

DOI:

10.3791/61461

⸱

June 24th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המוצגות כאן מכמת כמה פרמטרים של תא מדומה מונואולאן מדומה מספר תמונות ויטראז ' מרובים: הדבקה למצע כפונקציה של מספר וגודל של מיקוד מוקד, וצורה תא, מאופיין על ידי מדד צורת התא ומתארי צורה אחרים. הידקויות מיקוד היו מדמיינו על ידי כתמים פקעבלין וגבולות תא התא סומנו על ידי הצומת פלקוטין ו actin. השיטות לתרבית תאים וכתמים היו סטנדרטיים; תמונות מייצגות מטוסי מוקד יחידים; ניתוח תמונה בוצעה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה זמינה לציבור. הפרוטוקולים המוצגים משמשים כדי לכמת את מספר וגודל של הידקויות מיקוד ואת ההבדלים בפיזור הצורה התא ב monolayers, אבל הם יכולים להיות מחדש עבור כימות של גודל וצורה של כל מבנה הסלולר ברורים אחרים, כי יכול להיות מוכתם (למשל, המיטוa או גרעיני). הערכת פרמטרים אלה חשובה באפיון הכוחות הדינמיים בשכבת התא החסיד, כולל הדבקה בתאים וכיוונון actomyosin המשפיע על צורת התא.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אפיתל monolayers לפעול כקולקטיב שבו תא תא ותא הדבקה, כמו גם כוחות ומתחים והמתיחות מייצגים פרמטרים חשובים האיזון הנכון שלהם תורמת השלמות הכוללת של היחידה1,2,3. לפיכך, הערכת פרמטרים אלה מייצגת דרך ליצירת המצב הנוכחי של שכבת התא.

שתי השיטות המתוארות כאן מייצגות ניתוח דו מימדי של המונאולאיירס הקונקולני של חסיד, תאי אפיתל (במקרה זה MCF7 סרטן השד קו התאים). הניתוח מבוצע באמצעות תמונות מיקוד (Z-פרוסות בודדות) מאזורים שונים על ציר Z; אזור בסיס ליד מצע למדידות מיקוד (FA) ולאזור אפיפיורי למדידות בצורת תא. השיטות המוצגות פשוטות יחסית ודורשות טכניקות סטנדר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צעדי הכנה

  1. זריעת תאים להשגת מונאולאיירס שוטפת
    1. לפני הזריעה, העילו את הבארות של שקופית קאמרית של 4 בארות עם קולגן I (או רכיב ECM אחר של בחירה). עבור קולגן אני ציפוי, בצע פרוטוקול מסחרי: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html בריכוז של 8 μg/cm2.
    2. הזרע 400,000 תאים לאחד היטב של מגלשה 4-באר קאמרית.
    3. תרבות התאים עבור 24 שעות (או יותר, תלוי בנקודות הקצה הנסיוניות) לפני הצביעת, בחממה ב 37 ° c, 5% CO2. שלב זה מאפשר התבגרות של אנשי קשר תא התא והיווצרות monolayers.
    4. השתמשו במיקרוסקופ אופטי והפוך כדי לאמת את השטף (כ-90% נדרש) ומצב כללי של monolayers.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח הדבקה מוקד
הנוק-אין HAX1 ג'ין הוצגה בעבר כדי להשפיע על הידקויות מיקוד6. תאים היו מתורבתים על משטח קולגן I-מצופה עבור 48 h. תמונות של תאים בקרה MCF7 ותאים MCF7 עם מיקוד HAX1 (HAX1 KD) מתוך שלושה ניסויים עצמאיים ויטראז ' מוקד הדבקה ממוקד חלבון מושגת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (תמונה ממטוס מוקד יחיד/Z-פרוסה מאזור בסיס). החל מ-2000-2500 תאים מכל קו בתא, כולם בשימוש בפרוטוקול המתואר. הערך הממוצע להדבקה הקטנה ביותר הוגדר כ-50 (פיקסל

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא תא ותא הדבקה של תא מהווים תכונות הטבועה של התאים אפיתל לשחק את התפקיד הקריטי ברקמות מורפולגנזה ו embriogenesis. ברקמות למבוגרים את הרגולציה הנכונה של תכונות מכניות של שכבת התא היא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס ומניעת תגובות פתולוגיים כמו התקדמות הגידול גרורות. הגודל והמספר של הידקויות מיקוד תלויים בחוזק של הדבקה בתאים, בעוד שצורת התא תלויה בכוחות הקונקטילה וקשורה למצב של אנשי קשר תא-תא.

כאן, אנו מתארים שתי שיטות פשוטות של ניתוח כמותי של האזור, מספר וצורה של מבנים סלולריים מוכתם על ידי immunof.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדע הפולני תחת מענק מס ' 2014/14/M/NZ1/00437.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA32740אנטי ארנב עיזים, 1:500
אמוניום כלורידסיגמאA9434
BSABioShopALB001.500
קולגן מעור עגלסיגמאC9791-10MG
DAPISigmaD95421:10000 (מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O), חומצת גרעין מכתים
DMEM + GlutaMAX, 1 גרם/ליטר D-גלוקוז, פירובטThermoFisher Scientific21885-025
FBSThermoFisher Scientific10270-136
צומת פלקוגלוביןאיתות תאים2309Sארנב, 1:400
ארון זרימה למינרית Class 2ציוד סטנדרטיAlpina
MCF7-basedקו תאים HAX1KDקו תאים שהוקם במכון הלאומי לאונקולוגיה, ורשה, מתואר ב- Balcerak et al., 2019MCF7 קו תאים עםHAX1knockdown
קו תאים MCF7 (בקרה)ATCCATCC HTB-22אפיתל, קו תאים דבק בסרטן השד
מיקרוסקופ אור אולימפוס CK2אולימפוס
פקסיליןAbcamab32084ארנב, 1:250, Y113
PBSThermoFisher Scientific10010023
מצומד Phalloidin-TRITCSigmaP19511:400 (מלאי 5 מ"ג/מ"ל ב-DMSO), תווית אקטין
PTXSigmaT7402-1MG
TBST – NaClSigmaS9888
TBST – בסיס TrizmaSigmaT1503
Triton X-100Sigma9002-93-11
Zeiss LSM800 מיקרוסקופ קונפוקליZeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006(2016).
  2. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Substrate AdhesionFocal Adhesion AnalysisCell Shape IndexConfocal MicroscopyImageJ AnalysisPaxillin StainingPlakoglobin StainingActin CytoskeletonMCF7 Cell MonolayersAutomated Cell Analysis

Related Articles