הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61482

⸱

16 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

במאמר זה

סיכום

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

תקציר

אחד המודלים הנפוצים עבור רטינופתיות איסכמיות הוא מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR). כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים עבור אינדוקציה מודל OIR ואת הקריאות שלה הן עכברים וחולדות. neovascularization הרשתית הוא המושרה OIR על ידי חשיפת גורי מכרסמים או hyperoxia (עכברים) או לסירוגין רמות של hyperoxia והיפוקסיה (חולדות). הקריאות העיקריות של מודלים אלה הן בגודל של אזורים ניאו-וסקולריים (NV) ו- AVA (AVA) ברשתית. מודל זה preclinical in vivo יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות או כדי לטפל בתפקיד של גנים ספציפיים אנגיוגנזה ברשתית באמצעות בעלי חיים מניפולציה גנטית. המודל יש כמה זן וריאציה ספציפית ספק אינדוקציה OIR אשר יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסויים.

מבוא

מודלים ניסיוניים אמינים ומשוחזרים נדרשים כדי לחקור את הפתולוגיה שמאחורי מחלות עיניים אנגיוגניות ולפתח טיפולים חדשניים למחלות הרסניות אלה. אנגיוגנזה פתולוגית היא סימן ההיכר לניוון מקולרי רטוב הקשור לגיל (AMD) ועבור מחלות רשתית איסכמיות רבות ביניהן רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR) וחסימה של ורידים ברשתית (RVO)1,2,3,4. רשתית אנושית ומכרסמים בצע דפוס דומה של התפתחות, כמו רשתית הן אנושי מכרסמים הם בין הרקמות האחרונות כי הם vascularized. לפני כלי הדם ברשתית התפתחה לחלוטין, הרשתית מקבלת את אספקת התזונה שלה מן כלי הדם לשון, אשר, בתורו, רגרסיה כאשר כלי הדם ברשתית מתחיל לפתח1,2. אצל בני אדם, התפתחות כלי הדם ברשתית הושלמה לפני הלידה, ואילו מכרסמים הצמיחה של כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה. מאז התפתחות כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה מכרסמים, הוא מספק מערכת מודל אידיאלי ללמוד את אנגיוגנזה2,3. מכרסמים שזה עתה נולד יש רשתית כלי הדם המתפתחת בהדרגה עד פיתוח רשתית כלי הדם המלא מושגת עד סוף השבוע השלישי לאחר הלידה4. כלי הדם הגדלים של עכבר יילודים הם פלסטיק, והם עוברים רגרסיה במהלך גירוי hyperoxia5.

ROP היא הגורם המוביל לעיוורון בילדות במדינות המערב, שכן היא משפיעה על כמעט 70% מהפגים עם משקל לידה מתחת לגיל 1,250גרם 6,7. ROP מתרחשת אצל פגים שנולדים לפני כלי הרשתית להשלים את הצמיחה הרגילה שלהם. ROP מתקדמת בשני שלבים: בשלב I, לידה מוקדמת מעכבת את צמיחת כלי הדם ברשתית שבו לאחר שלב II, כלי הדם הלא גמורים של הרשתית המתפתחת גורמים להיפוקסיה, אשר גורמת לביטוי של גורמי גדילה אנגיוגניים הממריצים צמיחה חדשה ולא תקינה של כליהדם 8. מודל OIR היה מודל נפוץ לחקור את הפתופיזיולוגיה של ROP רטינופתיות איסכמיות אחרות, כמו גם כדי לבדוק מועמדים לתרופה הרומן2,3,9. זה נחשב באופן נרחב כמודל לשחזור לביצוע מחקרים הוכחת הרעיון עבור תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות למחלות עיניים, כמו גם שאינם עינית. שני דגמי מכרסמים כלומר, עכבר וחולדה OIR שונים במודל שלהם אינדוקציה ומחלות פנוטיפ. מודל החולדה מחקה פנוטיפ ROP בצורה מדויקת יותר, אך מודל העכבר מספק מודל חזק יותר, מהיר יותר וניתן לשחזור עבור neovascularization הרשתית (NV). במודל העכבר, NV מפתחת לרשתית המרכזית. קריאה פתולוגית זו חשובה במחקרי יעילות פרמקולוגית עבור רטינופתיות איסכמיות רבות, כגון PDR, קרוואנים ו- AMD אקסוידטיבי, כמו גם למחלות אנגיוגניות שאינן עיניות כגון סרטן. יתר על כן, הזמינות של עכברים שעברו מניפולציה גנטית (מהונדסת ונוקאאוט) הופכת את דגם OIR של העכבר לאפשרות פופולרית יותר. עם זאת, לא עכבר ולא עכברוש מודל OIR יוצר פיברוזיס ברשתית, אשר אופייני במחלות אנושיות.

ההבנה כי רמות חמצן גבוהות תורמות להתפתחות ROP בשנות החמישים10,11 הוביל לפיתוח מודלים של בעלי חיים. המחקרים הראשונים על השפעת החמצן על כלי הדם ברשתית נעשו בשנת 195012,13,14 ועד שנות התשעים היו עידונים רבים למודל OIR. המחקר של סמית ואח 'בשנת 1994 קבע תקן עבור מודל OIR העכבר הנוכחי המפריד בין עצם הלשון לרטינופתיה15. אימוץ רחב של השיטה לכמת vaso-השמדת NV פתולוגי על ידי קונור ואח '(2009) עוד יותר הגדיל את הפופולריות שלה16. במודל זה, עכברים ממוקמים ב 75% חמצן (O2) במשך 5 ימים ב P7, ואחריו 5 ימים בתנאים נורמוקסיים. Hyperoxia מ P7 כדי P12 גורם כלי הדם ברשתית לסגת ברשתית המרכזית. עם החזרה לתנאים הנורמוקסיים, הרשתית הופכת להיפוקסית (איור 1A). בשל הגירויים ההיפוקסיים של הרשתית המרכזית, חלק מכלי הדם ברשתית צומחים לכיוון הזגוגית, ויוצרים NV preretinal, הנקרא tufts preretinal2,3. ציצים אלה אינם בוגרים, ו hyperpermeable. כמות פסגות NV ב P17, לאחר מכן הוא נסוג. הרשתית היא revascularized מלא NV הוא נסוג לחלוטין על ידי P23 - P25 (איור 2A)2,3.

מודל OIR עכברוש (באמצעות רמות משתנות של O2) תואר לראשונה בשנות התשעים מראה כי משתנה O2 רמות ב 80% ו 40% לגרום NV בולט יותר מאשר תחת 80% O2 חשיפה מתמדת17. מאוחר יותר התגלה כי מודל היפוקסיה לסירוגין, שבו O 2 הוא רכב עלאופניים מ hyperoxia (50%) כדי היפוקסיה (10-12%), גורם אפילו יותר NV מאשר 80/40% O2 מודל18. במודל 50/10%, גורי חולדות חשופים ל -50% במשך 24 שעות, ואחריו 24 שעות ב -10% O2. מחזורים אלה נמשכים עד P14, כאשר גורי החולדות מוחזרים לתנאים נורמוקסיים (איור 1B). כמו בחולי ROP אנושיים, במודל החולדה מתפתחים אזורי החוליות לפריפריה של הרשתית בגלל מקלעת כלי דם רשתית לא בוגרת (איור 3).

בשני הדגמים, הפרמטרים העיקריים שבדרך כלל מכמתים הם בגודל של AVA ו- NV. פרמטרים אלה מנותחים בדרך כלל מן תושבות שטוחות ברשתית שבו תאי האנדותל מסומנים4,16. בעבר כמות NV preretinal הוערך חתכים ברשתית על ידי ספירת כלי דם או גרעיני תא כלי הדם המשתרעים זגוגית מעל הממברנה המגבילה הפנימית. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שלא ניתן לכמת את ה- AVAs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי הוועדה הלאומית לאתיקה של בעלי חיים בפינלנד (מספר פרוטוקול ESAVI/9520/2020 ו- ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. אינדוקציה של מודל OIR של בעלי חיים ועכבר ניסיוניים

הערה: השתמש בבעלי חיים שהזדווגו בזמן, למשל, עכברי C57BL/6J נפוצים, כדי לקבל גורים שנולדו באותו יום. השתמש סכרים מטפחים, למשל, 129 זן (129S1 / SvImJ או 129S3 / SvIM) סכרים מניקים, כדי לטפל בגורים במהלך ואחרי אינדוקציה של hyperoxia. לחלופין, ודאו שיש סכרים מניקים נוספים למקרה שיהיה צורך להחליף את הסכרים הסיעודיים בשל תשישות. להגביל את גודל המלטה ל 6-7 גורים עבור כל סכר בעת שימוש C57BL / 6J עכברים / סכרים (אם המלטה גדולה יותר מזה הגורים נוטים להיות עלייה במשקל מוגבלת)16.

  1. רשום את משקל בעלי החיים לפני ואחרי אינדוקציה hyperoxia, ובזמן ההקרבה.
  2. ודא כי יש מספיק מזון בתחתית הכלוב, כך הסכרים יש גישה קלה למזון.
  3. הוסף סודה סיד עם מחוון צבע לתחתית התא כדי לספוג CO2 עודף כאשר מערכת סינון אינו בשימוש.
  4. לפקח על הלחות והטמפרטורה בתוך התא ולשמור על הלחות בין 40 ל 65%. הגדל את הלחות של התא, במידת הצורך, על ידי הנחת כלים עם מים על החלק התחתון של התא (למשל, מנות פטרי).
  5. כייל את חיישן O2 עם 100% O2 ואוויר חדר רגיל.
  6. מקם את העכברים P7 לתוך תא ולהגדיר את רמת O2 ל 75%. שמור את העכברים בתא במשך 5 ימים, עד P12. הימנע מפתיחת התא במהלך אינדוקציה hyperoxia. בדוק את לחץ הגז של צילינדר O2 ולהחליף את הצילינדר בעת הצורך. לפקח על בעלי החיים במהלך האינדוקציה.
  7. תוציאו את כלובי העכברים מהתא ותשקול את כל הגורים. קיבוץ הגורים על סמך המשקל כך שלכל קבוצת ניסוי יש חלוקת משקל דומה בגורים.

2. אינדוקציה של מודל OIR של בעלי חיים ניסיוניים וחולדות (באמצעות מערכת סגורה למחצה)

הערה: השתמש בבעלי חיים שהזדווגו בזמן כדי לגרום לגורים להיוולד באותו יום. עבור עכברוש OIR, להשתמש בגודל המלטה מוגברת, כ 18 גורים / סכר, כדי לקבל אינדוקציה NV מספיק במודל החולדה. גורי בריכה מכמה פסולת כדי להשיג מספיק גורים לכל המלטה.

  1. רשום את משקלם של בעלי החיים לפני ואחרי האינדוקציה, ובזמן ההקרבה.
  2. ודא כי יש מספיק מזון בתחתית הכלוב, כך הסכרים יש גישה קלה למזון.
  3. מוסיפים סודה סיד עם מחוון צבע לתחתית התא כדי לספוג CO2 עודף כאשר מערכת הסינון אינה בשימוש.
  4. לפקח על הלחות והטמפרטורה בתוך התא. לספוג לחות נוספת (שנוצר ממספר רב של חולדות) על ידי הוספת ג'ל סיליקה בתחתית התא.
  5. כייל את חיישן O2 עם 100% N2 ואוויר חדר רגיל.
  6. מניחים את החולדות לתוך התא ב P0 (כמה שעות לאחר הלידה). הגדר את רמת O2 ל 50% ולחבר O2 צילינדרים לתא במשך 24 שעות. לאחר מכן, לעבור את ההגדרות 10% O2 ולחבר חנקן (N2)צילינדר לתא במשך 24 שעות. המשך רכיבה על אופניים 24 שעות בין 50% ו 10% O2 רמות במשך 14 ימים.
  7. לפקח על צריכת הגז ואת רווחתם של בעלי החיים במהלך המחקר. פתח את התא במהלך השינוי בין 50/10% O2 ולהוסיף עוד מזון ומים במידת הצורך. לשנות את הכלובים של בעלי החיים כדי לנקות אלה במהלך האינדוקציה.
  8. תוציא את כלובי החולדות מהתא ותשקול את כל הגורים. קיבוץ הגורים על סמך המשקל כך שלכל קבוצת ניסוי יש תפוצת משקל דומה אצל הגורים.

3. מתן תרופות (אופציונלי)

הערה: מסלול מינהל הסמים הנפוץ ב- OIR הוא על ידי טיפול תוך-ורידי (ivt), ב- P12-P14 לעכברים וב- P14 לחולדות. לקבוע את יום הטיפול בהתבסס על ההתקנה הניסיונית. כאשר פסולת מרובה של גורים משמשים בניסויים, לחלק את קבוצות הטיפול יש בעלי חיים מכל המלטה. רצוי, להזריק את התרופה רק לעין אחת, ולשמור על העין הנגדית כפקד.

  1. לשקול את בעלי החיים ולעשות סימני זיהוי לזנב ו / או האוזן.
  2. הרדמה של החיה עם הרדמה להזרקה (למשל תערובת של קטמין ו medetomidine, 30 מ"ג / קילוגרם ו 0.4 מ"ג / קילוגרם לעכברים) או עם הרדמה בשאיפה (isoflurane ב 2-3.5% isoflurane ו 200-350 mL / min זרימת אוויר). בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבהונות. שמור את החיה על כרית חימום במהלך הטיפול.
  3. להרדמה מקומית, יש למרוח טיפת משכך כאבים על העפעף. פתח את העפעף בזהירות עם מלקחיים לפני ביצוע ivt, כמו עכברים וחולדות לפתוח את עיניהם סביב P14. החל טיפה של משכך כאבים (למשל, הידרוכלוריד oxybuprocaine) על הקרנית.
  4. החל טיפה של יוד לפני ביצוע הזרקת ivt.
  5. להזרקת ivt להשתמש במזרק זכוכית עם מחט 33-34 G מחובר. לחץ על העפעפיים כלפי מטה וגרירת גלגל העין עם מלקחיים. הפוך את ההזרקה האחורית לימבוס, בערך 45° מחט זווית הצבעה לכיוון עצב הראייה.
  6. הימנע הזרקת יותר מ 1.0 μL לתוך החלל התוך ורידי. שמור את המחט במקום במשך 30 s לאחר הזרקת התרופה כדי למנוע ריפלוקס של הפתרון מוזרק.
  7. בדוק את העין (למשל, עם רפואת עיניים) עבור כל סיבוכים, כגון דימום או נזק ברשתית, לאחר הסרת המחט. החל משחה אנטיביוטית על גבי הקרנית לאחר ההזרקה.
    הערה: נפח הזרקת ivt לעכברים צריך להיות 0.5 – 1.0 μL.
  8. הפוך את ההרדמה (למשל עם α2-אנטגוניסט עבור medetomidine (2.5 מ"ג / קילוגרם) ולהחזיר את הגור לכלוב. בית המלטה בדרך כלל עד סוף המחקר.

4. דימות ויוו ואלקטרורטינוגרפיה (אופציונלי)

  1. אם תרצה, לנהל הדמיה vivo על בעלי חיים חיים במהלך תקופת המעקב כדי לתעד שינויים המתפתחים ברשתית במהלך התגובות אנגיוגנית. לדוגמה, בצע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) או סריקת מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית19 כדי לדמיין את כלי הדם (איור 4). השתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמיין שכבות רשתית ב- vivo (איור 4).
  2. אם תרצה, בדוק שינויים תפקודיים באוכלוסיות שונות של תאי רשתית לאחר אינדוקציה של OIR באמצעות אלקטרורטינוגרפיה (ERG) (איור 5).

5. איסוף רקמות והכנת תושבות שטוחות ברשתית

הערה: לאסוף את הרקמות על פי השערת המחקר הרצויה. עבור עכברים, לאסוף את הדגימות למשל ב P12 (כדי ללמוד vaso-השמדת לאחר השלב hyperoxic) או בתקופה היפוקסית (P13-P17). לאסוף את העכבר דגימות OIR ב P17, המהווה את נקודת הזמן הנפוצה ביותר עבור דגימה, כדי לזהות את השיא בכמות NV. ב- OIR עכברוש, לאסוף את הדגימות ב P18-P21 כדי לבחון את הכמות הגבוהה ביותר של NV (איור 3).

  1. לשקול את החיות לפני הדגימה.
  2. כדי לתייג את כלי הדם ברשתית, בעלי חיים מורדמים עמוקים יכולים להיות מותזים באופן טרנסקרדיאלי עם FITC-dextran. (לחלופין, כתם את הרשתית שטוח mounts עם Isolectin מאוחר יותר).
  3. להקריב את בעלי החיים באמצעות מנת יתר של תרופות הרדמה (למשל תערובת של קטמין ו medetomidine, 300 מ"ג / קילוגרם ו 4 מ"ג / קילוגרם לעכברים) או CO2 שאיפה.
  4. לאסוף את העיניים של בעלי החיים על ידי תופס מאחורי גלגל העין עם מלקחיים מעוגלים, לחתוך את הרקמה סביב העיניים ולהרים את העין מן המסלול.
  5. דגירה גלגלי העין עשוי טרי, מסונן 4% paraformaldehyde (מלוחים אגירה פוספט, PBS) עבור 1-4 שעות. הסר את התיקון ולשטוף את גלגלי העין 3 x 10 דקות עם PBS. לנתח את הרשתיות מיד או לאחסן אותם PBS ב +4 מעלות צלזיוס.
    התראה: Paraformaldehyde רעיל על ידי שאיפה, במגע עם העור ואם בלע. נא קרא את גליון נתוני הבטיחות לפני שתעבוד איתו.
    הערה: אין להפעיל לחץ על גלגל העין במהלך הדגימה או בכל שלב של עיבוד הרקמה על מנת למנוע ניתוק רשתית, אם חתכים מגלגלי עיניים שלמים נעשים.
  6. הכן תושבות שטוחות ברשתית כדי לכמת את כמות ה- NV ואת גודל ה- AVAs. לחלופין, לעבד את העיניים / רשתית עבור היסטולוגיה, או RNA או ניתוח חלבון. לנתח את הרשתית תחת מיקרוסקופ סטריאו באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים.
    1. מניחים את גלגל העין ב- PBS כדי לשמור אותו לח ולנקב את גלגל העין בלימבוס עם מחט (23G) ולחתוך סביב לימבוס עם מספריים מיקרו מעוגלים כדי להסיר את הקשתית ואת הקרנית.
    2. בזהירות למקם את קצה המספריים בין סקלרה רשתית לחתוך סקלרה לכיוון עצב הראייה. לעשות את אותו הדבר לצד השני של גלגל העין, בזהירות לחתוך / לקרוע את הסקלרה עד הרשתית נחשפת. מוציאים את העדשה מכוס הרשתית ומוסיפים PBS לגביע.
    3. הסר את כל כלי לשון, זגוגית ופסולת מבלי לפגוע ברשתית. לשטוף את הרשתית על ידי הוספת PBS לגביע הרשתית. בצע ארבעה חתכים (בשעה 12, 3, 6 ו -9) לרשתית עם מספריים מיקרו ישר לעשות מבנה דמוי פרח. באופן אופציונלי, בצע את החתכים עם להב כירורגי לפני הרכבה הדגימות. הרם את הרשתית באמצעות מברשת צבע רכה לצלחת היטב עבור כתמים.
  7. תווית vasculature הרשתית באמצעות Isolectin B4 אשר מכתים את פני השטח של תאי אנדותל (אם בעלי החיים לא היו חדורים עם FITC-dextran). דגירה הרשתיות במאגר חסימה (10% NGS + 0.5% טריטון ב TBS) עבור 1 שעה לשטוף עם 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS במשך 10 דקות. דגירה הרשתית עם צבע פלואורסצנטי מצומד Isolectin B4 (5-10μg /ml) ב 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS לילה ב +4 מעלות צלזיוס תוך הגנה מפני האור.
    הערה: אם תרצה, לתייג תאים אחרים כגון תאים דלקתיים ו pericytes באמצעות נוגדנים ספציפיים.
  8. לשטוף את הרשתיות 3x במשך 10 דקות עם 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS ולהרים רשתית על שקופית מיקרוסקופית, הרשתית הפנימית פונה כלפי מעלה. בזהירות להפיץ את הרשתית באמצעות מברשת צבע רכה ולהסיר את כל כלי לשון הנותרים או פסולת. מוסיפים מדיום הרכבה לתלוש כיסוי ומניחים אותו על גבי הרשתית. אחסן רשתית ב+4 °C (60 °F) ולהגן מפני אור.

6. ניתוח הרכבות השטוחות

  1. צלם תמונות של תושבות הרשתית השטוחות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 10. התמקדו בפלקסוס כלי הדם השטחיים ובניבסולריזציה הפרה-רה-רטינלית. יצירת תמונת סריקת אריחים ללכידת הרשתית כולה ומיזוג סריקות האריחים
  2. לכמת את התמונות על ידי מדידת AVAs, אזור NV ואת אזור הרשתית הכולל באמצעות תוכנית עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים).
    1. ציירו את ה- AVAs ואת אזור הרשתית הכולל באמצעות כלי ציור יד חינם ובחרו באזורים הניאו-וסקולריים בעזרת כלי בחירה. התוכנה מודדת את אזורי העניין בפיקסלים, ואת האזורים AVA ו- NV (לידי ביטוי פיקסלים) ניתן להשתמש כדי לחשב את האחוזים שלהם ביחס לאזור הרשתית הכולל. כמו כן, כלי תוכנה מסוימים זמינים לכימות NV.
      הערה: לאחרונה, קוד פתוח, תוכניות אוטומטיות לחלוטין לכימות ערכי מפתח של תמונות OIR באמצעות רשתות עצביות למידה עמוקה הוצגו ולספק כלי אמין לכימות לשחזור של AVA ברשתית ו- NV (למשל, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. אם אתם משתמשים בנוגדנים לגילוי אימונוהיסטוכימי של אוכלוסיות תאים בודדים, כימתו את מספר התאים המוכתמים (כגון microglia, איור 2B)מהטענות השטוחות ברשתית ביד או על ידי מערכות ניתוח תמונה אוטומטיות במידת הצורך.

7. סטטיסטיקה

  1. לנתח נתונים מופצים בדרך כלל על ידי מבחן t של סטודנט או ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Dunnett או Tukey, לפי הצורך. השתמש בבדיקות לא פרמטריות כמו מבחן מאן-וויטני U או מבחן קרוסקל וואליס לנתונים שאינם מופצים בדרך כלל. שקול הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמת P < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאה העיקרית של המודל היא פנוטיפ כלי הדם: גודל AVAs וכמות NV. במודל OIR של העכבר, הוואסו-השמדה מתרחש ברשתית המרכזית(איור 2A),ואילו במודל החולדה שהיא מפתחת בפריפריה, כלומר בדומה ל-ROP22 האנושי(איור 3A). הסיבה לכך היא כי מקלעת כלי הדם השטחית כבר התפתחה כאשר עכברים נחשפים hyperoxia, ואילו במודל החולדה הרשתית היא avascular בזמן אינדוקציה OIR (P0). ניאו-סקולריזציה פרה-רתית מתפתחת בסמוך לאזורים השופעים, כלומר הרשתית המרכזית בעכבר, והפריפריה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חומרת פנוטיפ המחלה תלויה הן בזן ואפילו בספק בדגמי OIR של עכברים וחולדות23. הדבר מצביע על כך שקיימת שונות גנוטיפית רחבה בהתפתחות הפתולוגית. באופן כללי, מכרסמים פיגמנטיים מפתחים פנוטיפ חמור יותר מאשר אלה לבקן. לדוגמה, כלי הדם ברשתית של לבקן BALB / c revascularizes במהירות לאחר hyperoxia ואינו מפתח NV בכלל24. באופן דומה, בחולדות, חולדות נורבגיה בראון פיגמנט להראות פתולוגיה חמורה יותר מאשר לבקן ספראג דולי (SD) חולדות25. חולדות SD משמשים בדרך כלל זן, הבדל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מריה Vähätupa, PhD, ניינה Jääskeläinen, מארק סראדה-Gimenez, PhD, ורובינה Thapa הם עובדים של ניסויים בע"מ.

המחבר Giedrius Kalesnykas, PhD, הוא עובד (נשיא ומנכ"ל) ובעל מניות של Experimentica בע"מ המציעה שירותי מחקר חוזה העסקת מודלים OIR פרה-קליני בשימוש במאמר זה.

Tero Järvinen, MD, PhD, ו Hannele Uusitalo-Järvinen, MD, PhD, אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים למריאן קרלסברג, אן מארי הפנימי, פיבי פרטנן ואן קנקונן על תמיכה טכנית מצוינת. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, Päivikki ו Sakari סולברג קרן, טמפרה שחפת קרן, קרן רפואית פינית, קרן המחקר המחוזית בית החולים Pirkanmaa וקרן המחקר של בית החולים אוניברסיטת טמפרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מד 33, מחט RN רכזת קטנהHamilton Company7803-05, 10 מ"מ, 25°, PS4להזרקה תוך זגוגית
Adobe PhotoshopAdobe Inc.לניתוח תמונה
משאבת אוויר air100Eheim GmbH & Co. KG.143207להרדמה באינהלציה
יחידת הרדמה 410 APUniventor Ltd2360309להרדמה באינהלציה
AnalaR NORMAPUR סודה לייםVWR International Ltd22666.362לבקרת CO2 במהלך אינדוקציה מודל
Attane Vet 1000 מ"ג/גרםVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79לאינהלציית הרדמה
מברשתלהכנת תושבות שטוחות
פחמן דו חמצנילהקרבה
Celeris D430 ERG systemDiagnosys LLC121עבור in vivo ERG
כלי תרבית תאיםGreiner Bio-One International GmbH664 160להכנת תושבות שטוחות
Cepetor Vet 1 מ"ג/מ"לוטרינר רפואי בריאות בעלי חיים OYvnr 08 78 96להרדמה
החלקות כיסויThermo Fisher Scientific15165452להכנת תושבות שטוחות
ארון InVivo מבוקר O2, מערכת פילטריון אנינאלי ומסיר לחותמוצרי מעבדהמערכת סגורה לאינדוקציה של מודל מחלה, אופציונלי למערכת סגורה למחצה
חיישן E702 O2BioSphenix, Ltd.E207, 1801901למדידת רמת חמצן
Envisu R2200 תחום ספקטרלי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (SD-OCT)Bioptigen, Inc.BPN000668עבור in vivo הדמיה
Eye spearsBeaver-Visitec International, Inc.0008685להזרקה תוך זגוגית והדמיה in vivo
Flexilux 600LL מקור אור קרMikron11140להזרקה תוך זגוגית או איסוף רקמות
מלח נתרן פלואורסצאיןMerck KGaAF6377-100Gלהדמיה in vivo
יחידת פליטת גז (+ שסתום תלת כיווני כפול, מסכות פנים לעכבר וחולדה, מסנן UNOsorb)UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249להרדמה באינהלציה
מזרק זכוכית, דגם 65 RNHamilton Company7633-01להזרקה תוך זגוגית
HRA2 אנגיוגרף רשתית (FA)היידלברג הנדסה GmbHSpec-KT-05488להדמיה in vivo הדמיה
איזולקטין GS-IB4, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo Fisher ScientificI21411לתיוג כלי דם ברשתית על תושבות שטוחות
Ketaminol Vet 50 מ"ג/מ"לIntervet International BVvnr 51 14 85להרדמה
חמצן רפואילעכברי אינדוקציה מודל מחלה
C57BL/6JRjJanvier Labsגם זנים אחרים אפשריים
שקופיות מיקרוסקופתרמו פישר מדעיJ1800AMNZלהכנת תושבות שטוחות
מינימום פובידון יוד 5% (יחידה)Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304להזרקה תוך זגוגית
חנקןלאינדוקציה מודל מחלה (חולדה)
Oftan Chlora 10 מ"ג / גרםSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11להזרקה תוך זגוגית
Oftan Metaoksedrin 100 מ"ג/מ"לSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43עבור in vivo ERG
Oftan Obucain 4 מ"ג/מ"לSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50להזרקה תוך זגוגית
Oftan Tropicamid 5 מ"ג/מ"לSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36עבור in vivo בקר הדמיה
ProOx דגם 110 O2 ותא בעלי חייםBioSphenix, Ltd.803לאינדוקציה של מודל מחלה, מערכת סגורה למחצה, אופציונלי למערכת סגורה
בקר ProOx דגם P360 O2 ותא בעלי חייםBioSphenix, Ltd.538לאינדוקציה של מודל מחלה, מערכת סגורה למחצה, אופציונלי למערכת
סגורה חולדות CD (SD)מעבדותגם זנים אחרים אפשריים
Revertor 5 מ"ג / מ"לוטרינר רפואי בריאות בעלי חייםOY vnr 13 04 97להיפוך הרדמה
סיליקה ג'ללבקרת לחות במהלך אינדוקציה מודל
Systane Ultra 10 מ"לאלקון2050250 תמרולהענקת לחות לעין
יחידת סיסטן אולטרה 0.7 מ"לאלקון2064871טמרו להענקת לחות לעין
פיפטה טרנספרתרמו פישר סיינטיפיק1343-9108להכנת תושבות שטוחות
תנור ייבוש VENTI-Line VL 180 PRIME VWRVL180S 170301לייבוש סיליקה ג'ל
VisiScope SZT350 סטריאומיקרוסקופVWR481067להזרקה תוך זגוגית או לאיסוף רקמות
גז Coy גז גז נהר צ'ארלס

מקורות

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873(2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585(2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649(2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876(2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167(2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559(2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Isolectin B4OCTAflibercept
מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.