הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61512

⸱

8 ביולי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מתודולוגיה זו שואפת להעריך ציטוטוקסיות של חומרים ביולוגיים באמצעות הכנת תמציות מסיסות, תוך שימוש במבחני כדאיות וניתוח פנוטיפי, כולל ציטומטריית זרימה, RT-PCR, אימונוציטוכימיה וטכניקות ביולוגיה תאית ומולקולרית אחרות.

תקציר

ביו-חומרים באים במגע ישיר או עקיף עם רקמות האדם, ולכן חשוב להעריך את ציטוטוקסיותו. הערכה זו יכולה להתבצע במספר שיטות, אך קיים פער גבוה בין הגישות בהן נעשה שימוש, מה שפוגע ביכולת השחזור וההשוואה בין התוצאות המתקבלות. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול להערכת ציטוטוקסיות של ביו-חומרים באמצעות תמציות מסיסות, שבהן אנו משתמשים עבור ביו-חומרים דנטליים. הכנת התמציות מפורטת, החל מייצור הכדוריות ועד מיצוין במדיום תרבית. הערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרים מבוססת על פעילות מטבולית באמצעות בדיקת MTT, כדאיות התא באמצעות בדיקת Sulphorhodamine B (SBR), פרופיל מוות תאי באמצעות ציטומטריית זרימה, ומורפולוגיה של התא באמצעות May-Grünwald Giemsa. בנוסף להערכת ציטוטוקסיות, פרוטוקול להערכת תפקוד התא מתואר בהתבסס על ביטוי של סמנים ספציפיים המוערכים על ידי אימונוציטוכימיה ו- PCR. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לציטוטוקסיות של ביו-חומרים ולהערכת השפעות תאיות, תוך שימוש במתודולוגיית התמציות, באופן ניתן לשחזור וחזק.

מבוא

תאימות ביולוגית יכולה להיות מוגדרת כיכולת של חומר לשלב רקמות ולגרום לתגובה טיפולית חיובית, ללא נזקים מקומיים וסיסטמיים 1,2,3. הערכת תאימות ביולוגית חיונית לפיתוח כל חומר המיועד לשימוש רפואי. לכן, פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית ומקיפה לכל חוקר השואף לפתח ביו-חומרים חדשים או לחקור יישומים חדשים לביו-חומרים קיימים.

בדיקות ציטוטוקסיות במבחנה נמצאות בשימוש נרחב כשלב הראשון להערכת תאימות ביולוגית, באמצעות תרביות תאים ראשוניות או קווי תאים. התוצאות מהוות אינדיקטור ראשון ליישום קליני פוטנציאלי. מלבד היותה חיונית לפיתוח ביו-חומרים, בדיקה זו היא חובה כדי לעמוד בתקנות הנוכחיות להחדרת שוק, מהרגולטורים של EUA והאיחוד האירופי (אישור FDA ו- CE) 4,5,6,7,8. יתר על כן, בדיקות סטנדרטיות במחקר ביו-רפואי מספקות יתרון משמעותי במונחים של שחזור והשוואת תוצאות ממחקרים שונים על ביו-חומרים או מכשירים דומים9.

הנחיות ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) נמצאות בשימוש נרחב על ידי מעבדות מסחריות, רגולטוריות ואקדמיות עצמאיות רבות לבדיקת חומרים באופן מדויק וניתן לשחזור. ISO 10993-5 מתייחס להערכת ציטוטוקסיות חוץ גופית ודוחות ISO 10993-12 להכנת דגימה10,11. לבדיקות ביו-חומרים ניתנות שלוש קטגוריות, שייבחרו בהתאם לסוג החומר, רקמות המגע ומטרת הטיפול: תמציות, מגע ישיר ומגע עקיף 8,11,12,13. תמציות מתקבלות על ידי העשרת מדיום תרבית תאים עם החומר הביולוגי. עבור בדיקות מגע ישיר, החומר הביולוגי ממוקם ישירות על תרביות התא, ובמגע עקיף, הדגירה עם התאים מתבצעת מופרדת על ידי מחסום, כגון ג'ל אגרוז11. בקרות מתאימות הן חובה, ויש לבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים 5,8,10,11,14.

זה קריטי לדמות או להגזים בתנאים קליניים כדי לקבוע את הפוטנציאל ציטוטוקסי. במקרה של בדיקת תמציות, שטח הפנים של החומר;  הנפח הבינוני; המדיום וה- pH החומרי; מסיסות החומר, האוסמולריות ויחס הדיפוזיה; ותנאי המיצוי כגון תסיסה, טמפרטורה וזמן משפיעים על מעשרת המדיה5.

המתודולוגיה מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של ציטוטוקסיות של מספר פורמולציות פרמצבטיות, הן מוצקות והן נוזליות. ניתן לבצע מספר בדיקות, כגון בדיקת ספיגה אדומה ניטרלית, בדיקת היווצרות מושבה, בדיקת MTT ובדיקת XTT 5,10,14.

רוב מחקרי הערכת ציטוטוקסיות שפורסמו משתמשים בבדיקות פשוטות יותר, כלומר MTT ו- XTT, המספקות מידע מוגבל. הערכת תאימות ביולוגית צריכה לכלול לא רק הערכה של ציטוטוקסיות אלא גם פעילות ביולוגית של חומר בדיקה נתון2, כפי שפרוטוקול זה מאשר. יש להשתמש בקריטריונים נוספים להערכה כאשר הם מוצדקים ומתועדים. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לספק מדריך מקיף, המפרט סדרה של שיטות להערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרית. חוץ מזה, הערכה של תהליכים תאיים שונים, כלומר סוג של מוות התא, מורפולוגיה של התא, תפקוד התא בסינתזה של חלבונים ספציפיים, וייצור רקמות ספציפיות, מתוארים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת כדורים

  1. הכינו את תבניות הפוליוויניל כלוריד (PVC) על ידי ביצוע חורים בצורת עיגול בממדים ידועים בלוחות PVC.
    הערה: ניתן לייצר יציקות PVC בגדלים שונים. חשב את משטח המגע של תבניות PVC, באמצעות הנוסחה A = h (2πr) + 2πr2 (r: רדיוס הצילינדר; h: גובה הצילינדר).
  2. הכינו את החומר הביולוגי לבדיקה על פי הוראות היצרן וקרוב ככל האפשר לתחילת הניסוי.
    הערה: להכנת ביו-חומרים של נוסחת הדבק/הדבקה, כמות מספקת של משחת בסיס וזרז מעורבבים ידנית עם מרית ערבוב. עבור חומרים אחרים המבוססים על פורמולציות נוזל ואבקה, יש לבצע מרייה ידנית או ערבוב מכני עם רטט, בהתאם להוראות היצרן או בהתאם לחומרים חדשים. עבור חומרים נוזליים, שלב זה אינו הכרחי. הפעל את הפרוטוקול בשלב 2.
  3. מניחים את החומר הביולוגי על התבניות עם מרית ונותנים להם להגדיר את הזמן המתאים.
    הערה: זמן ההגדרה ותנאי ההגדרה של החומרים הביולוגיים חייבים להתאים להוראות היצרן או המתאימים לחומרים חדשים.
  4. לאחר ההגדרה, מוציאים את כדורי החומר הביולוגי מתבניות ה-PVC ומניחים אותם במיכל (ניתן להשתמש בצלחת 6 בארות או צלחת פטרי).
  5. יש לעקר את הכדוריות על ידי הנחתן תחת מנורת אור אולטרה סגול (UV) למשך 20 דקות לכל צד.

2. השגת תמציות הביו-חומרים

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים קפדניים.

  1. קבע את המספר הדרוש של כדורים על ידי חישוב שטח הפנים של הגלולה בהתבסס על הנוסחה המתוארת ב -1.1.
    הערה: כערך ייחוס, שטח הפנים של המגע של 250 מ"מ2/מ"ל11,15 מושג על ידי הוספת 9 כדורים (ח 3 מ"מ x גובה 1.5 מ"מ) לכל מ"ל של המדיום.
  2. הכינו את התמציות המסיסות (תמצית מועשרת בחומר הביולוגי).
    1. מניחים את הכדוריות בצינור 50 מ"ל ומוסיפים את המקביל של מדיום תרבית התא. מניחים את הצינורות למשך 24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37°, בסיבוב קבוע.
      הערה: השתמש במדיום תרבית התאים המתאים לתרביות תאים.
    2. לאחר 24 שעות, להסיר את הצינורות מן האינקובטור. בשלב זה, התמציות מתאימות לריכוז של 1/1 או 100%.
    3. בצע דילול של התמצית על ידי הוספה רציפה של נפחים שווים של מדיום מותנה למדיום תרבית התא.
      הערה: אין לבצע התאמת pH למדיה.
      1. הוסף 1 מ"ל של מדיה תרבית 1 מ"ל של 100% תמצית כדי לקבל 50% תמצית. הוסף 1 מ"ל של אמצעי תרבית ל-1 מ"ל של 50% תמצית כדי לקבל תמצית של 25%, וכן הלאה (איור 1).
        הערה: השתמש בריכוזים שנמצאו רלוונטיים לכל תרכובת.

figure-protocol-1
איור 1: סכימת ההכנה והדילול של תמציות מסיסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. דגירה של תאים עם תמציות הביו-חומרים

  1. הכינו תרחיף תאי וצלחו אותו במיכל תאים מתאים, כגון צלחת מרובת בארות, בהתאם למספר התאים הדרושים לניסויים.
    1. התחל עם בקבוק של התאים הרצויים עם 80% עד 90% מפגש.
    2. יש להשליך את מצעי תרבית התא, לשטוף בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ולנתק את התאים עם טריפסין-EDTA (1 עד 2 מ"ל עבור בקבוק תרבית תאיםבגודל 75 ס"מ).
    3. מוסיפים את מצע תרבית התאים (2 עד 4 מ"ל לצלוחית תרביתתאים בגודל 75 ס"מ), מעבירים את תרחיף התא לצינור וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. להשעות את הגלולה בנפח ידוע של מדיה תרבית תאים.
      הערה: פרוטוקול זה מיועד לשימוש בתרביות תאים דבקים; עם זאת, ניתן לבצע התאמות פשוטות לעבודה עם תרביות תאי תרחיף.
    5. לספור את התאים בהמוציטומטר ולחשב את ריכוז התא של השעיית התא.
    6. להשעות את הסכום שנקבע של השעיית התא במדיום תרבית ולהעביר מנות multiwell. כערך ייחוס לצפיפות הזריעה, שקול 5 – 20 x 105 תאים/ס"מ2.
      הערה: יש לחשב את מספר התאים המתאים בהתאם לסוג התא ולמאפייני התא, כלומר זמן הכפלת התא.
  2. לדגור על התאים במשך 24 שעות כדי לאפשר הידבקות תאים.
  3. לאחר תקופה זו, יש להעביר את התמציות המסיסות לצלחות התרבית.
    1. שאפו למדיום תרבית התא.
    2. מוסיפים את תמציות הביו-חומרים לכל באר, בהתאם לרצף הריכוזים, כפי שתואר קודם לכן. הוסף מדיום תרבית תאים טרי לבארות הבקרה.
    3. לדגור על הצלחות במשך 24 שעות או יותר.
      הערה: יש לבצע בקרות שליליות בכל בדיקה, המתאימות לתאים לא מטופלים, הנשמרות במדיום התרבית. ניתן לבחור את זמני הדגירה בהתאם למטרות המחקר.

4. הערכת הפעילות המטבולית

  1. לאחר הדגירה התאית עם תמציות הביו-חומרים, שואפים את התווך מהצלחות ושוטפים כל באר PBS.
  2. מקם, בכל באר, את נפח נאות של 0.5 מ"ג / מ"ל 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazole bromide (MTT) מוכן PBS, pH 7.4.
  3. לדגור את הצלחות במשך 4 שעות או לילה בחושך ב 37 ° C.
  4. כדי להמיס את גבישי הפורמזן המתקבלים, מוסיפים את הנפח המתאים של תמיסת 0.04 מ 'של חומצה הידרוכלורית באיזופרופנול לכל באר ומערבבים צלחות במשך 30 דקות.
    הערה: התאם את כמות MTT ואיזופרופנול בהתאם לגודל הבארות.
  5. מערבבים ויוצרים הומוגניות של תכולת כל באר, במידת הצורך, על ידי צנרת מעלה ומטה עד שלא רואים גבישים.
  6. כמת את הבליעה באורך גל של 570 ננומטר באמצעות מסנן ייחוס של 620 ננומטר, בספקטרופוטומטר.
  7. כדי לחשב את הפעילות המטבולית, לחלק את ספיגת התאים המטופלים על ידי ספיגת תרביות הביקורת. כדי לקבל ערכי אחוזים, הכפל ב- 100.

5. הערכת מוות תאי

הערה: כדי לבצע הערכה זו, יש להשתמש במינימום של 106 תאים לכל תנאי.

  1. השתמש בצינורות צנטריפוגות שזוהו כראוי, בהתאם לתנאים המוערכים.
  2. לאחר הדגירה התאית עם תמציות הביו-חומרים, אספו את מצע התרבית לצינור המתאים.
  3. נתק את התאים והוסף את תרחיף התא לצינורות המתאימים.
  4. רכז את מתלי התא על ידי צנטריפוגה ב 120 x גרם במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את הכדורים עם PBS. הסר את PBS על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות.
  6. הוסף 1 מ"ל של PBS והעבר את כדורי התא לצינורות ציטומטריה מזוהים.
  7. הסר את PBS על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות.
  8. יש לדגור עם 100 מיקרוליטר של חיץ קושר (0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl ו-0.25 mM CaCl2)16, ולאפשר לתאים לנוח כ-15 דקות להתאוששות קרום התא.
  9. הוסף 2.5 μL של פלורסנט שכותרתו Annexin-V ו 1 μL של יודיד פרופידיום במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  10. לאחר הדגירה, להוסיף 400 μL של PBS ולנתח על ציטומטר. לצורך ניתוח וכימות המידע יש להשתמש בתוכנה מתאימה.
  11. הצג תוצאות כאחוז של תאים חיים, אפופטוזיס, אפופטוזיס מאוחר/נמק ונמק.

6. הערכת מורפולוגיה

  1. בחר את הגודל המתאים של כיסויי זכוכית מעוקרים המתאימים לצלחת multiwell.
  2. הניחו כל שקופית בבאר בעזרת פינצטה סטרילית.
  3. הפיצו תרחיף תאי בריכוז מתאים לתוך הבארות והניחו לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 95% אוויר ו-5% CO2.
  4. לחשוף את תרביות התאים לתמציות, כפי שתואר קודם לכן.
  5. לשאוף את התקשורת ולשטוף עם PBS.
  6. הניחו לכיסויים להתייבש בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו נפח מספיק של תמיסת מאי-גרינוולד כדי לכסות את הכיסויים; דוגרים במשך 3 דקות.
  7. מוציאים את הצבע ושוטפים במים מזוקקים למשך דקה.
  8. מוציאים את המים ומוסיפים נפח מספיק של תמיסת Giemsa כדי לכסות את הכיסויים; דוגרים במשך 15 דקות.
  9. יש לשטוף את הכיסויים במים זורמים.
  10. העבר את הכיסויים לשקופית.
  11. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.

7. הערכת תפקוד התא באמצעות תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR)

הערה: כדי לבצע הערכה זו, יש להשתמש במינימום של 2x106 תאים לכל תנאי. לדוגמה, phosphatase אלקליין מוצג כגן של עניין עבור הערכת פעילות odontoblasts. גנים מעניינים אחרים ניתן לראות בטבלה 1.

  1. לוחית את התאים כמתואר לעיל.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז התאים המצופים, בהתאם לסוג התא ולציטוטוקסיות של הביו-חומרים הנחקרים.
  2. לדגור עם תמציות מסיסות, כמתואר לעיל.
  3. נתק את התאים כדי לקבל תרחיף כפי שתואר קודם.
  4. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS; עבור צנטריפוגה זו ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. למרוח את התאים על ידי השעיית הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת טיהור RNA (למשל, NZYol), ערבוב אינטנסיבי ופיפטינג עוקב.
  6. לדגור על הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף 200 μL של כלורופורם ונער את הצינורות ביד במשך 15 שניות.
  8. דוגרים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. צנטריפוגה lysates ב 4 ° C במשך 15 דקות ב 12,000 x גרם. במהלך צנטריפוגה זו, שני שלבים מקורם בדגימה, ומשאירים את הרנ"א בשלב המימי (העליון).
  10. הסר את הפאזה המימית לצינור חדש והוסף 500 μL של איזופרופנול קר כדי לזרז RNA.
  11. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  12. הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של אתנול 75% על ידי צנטריפוגה ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  13. יבשו את הגלולה בטמפרטורת החדר עד להתאדות האתנול.
  14. מרחפים במים נטולי RNase.
  15. לכמת ולקבוע את דרגת הטוהר של הדגימות באמצעות ספקטרופוטומטריית בליעה, באורכי גל 260 ננומטר ו 280 ננומטר. קבע את טוהר הרנ"א והשתמש בדגימות עם יחס טוהר (A260/280) סביב 2.0.
  16. חנות דוגמאות ב -80 ° C.
  17. המשך לבצע RT-PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן17.
    הערה: בהתאם למטרת המחקר, בחר את הסמנים הספציפיים להערכה.

8. הערכת תפקוד התא באמצעות זיהוי חלבונים

הערה: בהתאם למטרת המחקר, בחר את החלבונים הספציפיים שיש להעריך. לדוגמה, דנטין סיאלופרוטאין (DSP) מוצג כחלבון בעל עניין להערכת פעילות אודונטובלסטים. חלבונים מעניינים אחרים ניתן לראות בטבלה 1.

  1. תרבית תאים בכיסויים וחשופה לתמציות, כפי שתואר קודם.
  2. שטפו את תרביות התאים עם PBS.
  3. יש לתקן עם 3.7% פרפורמאלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  5. חדיר עם 0.5% טריטון ב- PBS למשך 15 דקות.
  6. חסום את הפרוקסידז עם 0.3% מי חמצן ב- PBS למשך 5 דקות.
  7. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  8. יש לשטוף פעמיים עם אלבומין 0.5% בסרום בקר (BSA).
  9. חסום תרביות תאים עם 2% BSA למשך 45 דקות.
  10. יש לשטוף עם 0.5% BSA ב-PBS.
  11. לדגור על תרביות עם הנוגדן הראשוני על פי החלבון שנבחר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בנוגדן הראשי DSP (M20) (1:100) ובנוגדן המשני Polyclonal Rabbit Anti-Goat immunoglobulins/HRP (1:100).
  12. יש לשטוף חמש פעמים עם 0.5% BSA ב-PBS.
  13. לדגור עם נוגדן משני במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בצע את דילול הנוגדנים באמצעות 0.5% BSA ב- PBS.
  14. יש לכבס חמש פעמים עם 0.5% BSA ב-PBS למשך דקה אחת בכל כביסה.
  15. לדגור על תרביות עם מצע ותערובת כרומוגנים בריכוז של 20 μL כרומוגן/מ"ל מצע במשך 25 דקות.
  16. יש לשטוף פעמיים עם 0.5% BSA ב-PBS.
  17. כתם נגדי עם Hematoxylin במשך 15 דקות.
  18. יש לשטוף ברצף של 0.037 מול/ליטר אמוניה ומים מזוקקים למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי צבע.
  19. הרכיבו את הכיסויים על המגלשות. השתמש בגליצרול כאמצעי הרכבה.
  20. יש לאפשר ייבוש למשך הלילה.
  21. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.

9. הערכת מינרליזציה באמצעות בדיקת Alizarin Red S

  1. הכינו תמיסת Alizarin Red S בריכוז של 40 mM18. מערבבים את הפתרון להומוגניזציה במשך 12 שעות בחושך.
    הערה: להכנת 100 מ"ל של תמיסת Alizarin Red S, יש להמיס 1.44 גרם אבקת אליזרין (משקל מולקולרי: 360 גרם/מול) במים טהורים במיוחד, מוגנים מפני אור. עבור פתרון זה, ערך ה- pH הוא קריטי וצריך להיות בין 4.1 ל -4.3.
  2. לדגור על תרבית תאים עם תמציות מסיסות, כמתואר לעיל.
  3. לשטוף תרביות תאים שלוש פעמים עם PBS.
  4. יש לתקן עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  6. יש להכתים בתמיסת צביעה אדומה אליזרין למשך 20 דקות ב-37°C בחושך.
  7. לאחר הצביעה, שטפו את הצלחות עם PBS כדי להסיר את עודפי הצבע.
  8. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.
  9. הוסיפו תמיסת מיצוי, המורכבת מ-10% חומצה אצטית ו-20% מתנול, לכל באר, ותנו לערבוב במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. מדוד את הבליעה באורך גל של 490 ננומטר בספקטרופוטומטר19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות המייצגות כאן מתייחסות לחקר ביו-חומרים דנטליים. מתודולוגיית התמצית מאפשרת לקבל פרופיל ציטוטוקסיות ותפקוד תאים לאחר חשיפה לחומרים דנטליים, לגבי השפעות על פעילות מטבולית (איור 2), כדאיות התא, פרופיל מוות תאי ומורפולוגיה של התא (איור 3), וביטוי חלבונים ספציפיים (איור 4).

בדיקת MTT משמשת לקבלת סקירה מהירה של ציטוטוקסיות של החומרים בצורה פשוטה. ניתן לערוך השוואה בין שני חומרים או יותר (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה תוכנן תוך התחשבות ב- ISO 10993-5, המתייחס להערכת ציטוטוקסיות במבחנה של ביו-חומרים הבאים במגע עם הרקמות, כדי להעריך את התאימות הביולוגית ולתרום לשכפול מחקרים21. זהו חשש גובר במדע, ומחברים רבים כבר עוקבים אחר המלצות אלה בתכנון הניסוי של מחקריהם במבחנה 15,22,23,24,25,26,27,28.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

תודות

אנו מודים לגורמים הבאים על התמיכה: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB ממומן על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT (הקרן למדע וטכנולוגיה) באמצעות הפרויקט האסטרטגי UIDB/04539/2020 ו- UIDP/04539/2020 (CIBB). אנו מודים לז'אק נור, בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת מישיגן, על אספקת קו התאים MDPC-23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול אבסולוטיMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas מגיב דיסוציאציה של תאים
נוגדן ALDHSanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתיתSigmaA5955
בדיקת BCAThermo Scientific23225Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון
אלבומין בקר סרוםסיגמאA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
CD133 נוגדןMiteny Biotec293C3-APCאלופיקוציאנין (APC)
CD24 נוגדןBD Biosciences658331אלופיקוציאנין-H7 (APC-H7)
CD44 נוגדןBiolegend103020פסיפיק כחול (PB)
מסננת תאיםBD Falcon35234040 ומיקרו; M
קולגנאז, סוג IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + ChromogenDakoK3468
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) נוגדן, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923קו תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית
גורם גדילה אפידרמיסSigmaE9644
Hepes 0.01 MסיגמאMFCD00006158
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסיSigmaF0291
Giemsa Stain, שונה GS-500SigmaMFCD00081642
GlycerolDakoC0563
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335קו תאי קרצינומה של תאי קשקש חלב אנושי
אינסולין, טרנספרין, תמיסת סלניוםGibco41400045
May-Grü nwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22קו תאי אדנוקרצינומה של חלב אנושי
מתיל צלולוזAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
אימונוגלובולינים נגד עיזים / HRP, 1: 100DakoG-21234
פולי (2-הידרוקסיאתיל-מתאקרילטSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671קו תאי קרצינומה של רירית הרחם
האנושית חומצה נתרן דאוקסיקוליתJMSEINECS 206-132-7
נתרן דודציל סולפטSigma436143
מאגר מצעDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
טריפן כחולסיגמאT8154
טריפסין-EDTAסיגמאT4049
<חזק>&בטא; נוגדן -אקטיןסיגמאA5316

מקורות

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234(2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255(2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425(2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854(2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884(2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113(2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184(2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17(2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153(2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382(2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MTTSulphorhodamine BMay Grunwald GiemsaPCRAlizarin Red
גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.