Method Article

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

DOI:

10.3791/61517

⸱

August 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, 2Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, 3Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של אורגניזם רב-תאי מורכב נשלט על ידי סוגי תאים שונים בעלי פרופילים תמלול שונים. כדי לזהות רשתות רגולטוריות שעתוק השולטות בתהליכים התפתחותיים, יש צורך למדוד את פרופילי ביטוי הגנים המרחביים והזמניים של סוגי תאים בודדים אלה. לכן, תובנה על השליטה spatio-זמני של ביטוי גנים היא חיונית כדי לקבל הבנה של איך תהליכים ביולוגיים והתפתחותיים מוסדרים. כאן, אנו מתארים שיטת microdissection לכידת לייזר (LCM) כדי לבודד מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר שאורה על פני קורס זמן במהלך נביטה ואחריו פרופיל תעתיק. השיטה מורכבת קיבעון רקמות, עיבוד רקמות, הטבעת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA ואחריו PCR בזמן אמת או RNA-seq. שיטה זו אפשרה לנו להשיג פרופילים מרחביים וזמניים של תמלול איברים זרעים ממספרים שונים של תאים (עשרות עד מאות), מתן ספציפיות רקמות הרבה יותר גדול מאשר ניתוחים טיפוסיים של רקמות בתפזורת. מנתונים אלה הצלחנו להגדיר ולהשוות רשתות רגולטוריות שעתוק, כמו גם לחזות גורמי שעתוק רגולטורי מועמד עבור רקמות בודדות. השיטה צריכה להיות ישימה לרקמות צמח אחרות עם אופטימיזציה מינימלית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח צמחים וצמיחה כרוכים בפעולה מתואמת של רשתות רגולטוריות שעתוק בתוך תאים שונים הקיימים בסביבה סלולרית מורכבת. כדי להבין את הפעילות של רשתות רגולטוריות אלה, אנו דורשים את הידע של ביטוי גנים מרחבי וזמן בתוך סוגי תאים שונים על פני שלבים התפתחותיים. עם זאת, ניתוחים של ביטוי גנים מתבצעים בדרך כלל באיברים שלמים או דגימות רקמות בתפזורת בשל האתגר הטכני של בידוד וניתוח של מספר קטן של תאים. השיטה שאנו מתארים כאן אפשרה להשיג ניתוח תמלול ספציפי לרקמות מרחביות וזקופיות על ידי צימוד LCM עם RNA-seq.

LCM פותחה לפני שני עשורים על ידי אמרט-באק ועמיתיו1. הטכניקה אפשרה לחוקרים לבודד במדויק תאים בודדים או אשכולות של תאים מהסביבה שלהם ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו המוצר הסופי הוא RNA, לדאוג להימנע מזהם את העבודה עם RNases. לבישת כפפות היא חובה. השתמש diethyl pyrocarbonate (DEPC) -מטופלים מים, מאגרים, וכו '. אוטוקלב מאגרים ואופים כלי זכוכית לפני השימוש.

1. קיבעון רקמות

  1. להכין קיבעון של בחירה בהתאם לסוגי מינים ורקמות; עבור זרעי שורה, להשתמש קיבעון של חקלאי (75% אתנול, 25% חומצה אצטי קרחונית (v /v)).
  2. מצננים את התיקון על קרח לפני קצירת רקמות.
  3. לאסוף את החומר הצמח של עניין ובמידת הצורך, לנתח אותו לתוך חתיכות בגודל המתאים כדי להתאים לתבנית הטבעה שנבחרה. עבור זרעי שורה, לחתוך את הזרע לחצי אורכי כדי לעזור חדירה של הפתרון המקבע ולהתאים לתוך תבנית ההטמיה.
  4. לשקוע הרקמה ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצרנו תעתיקים מרחביים וזמניים ספציפיים לרקמות מזרעי שורה במהלך נביטה באמצעות פרוטוקול RNA-seq LCMשלנו 10. המחקר בוצע על ידי החלת LCM RNA-seq על מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר (plumule, קצה רדיק, scutellum) כל 8 שעות על 48 שעות כמובן זמן במהלך נביטה (0-48 שעות, 7 נקודות זמן) (איור 2A, B).

figure-results-1
איור 2: ת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים רבים ביטוי גנים ספציפיים לרקמות הוגבלו על ידי ניתוח יד של דגימות, אשר גוזל זמן, עבודה אינטנסיבית, יש סיכון גבוה של זיהום והוא יכול רק לנצל דגימות כי פעיל אנושי הוא מספיק מיומן לקצור. LCM היא טכניקה מדויקת ונלויה במגע לאיסוף תאים מקטעי רקמות קבועות באמצעות קרן לייזר המופעלת מכנית תחת הדמיה מיקרוסקופית.

הכנת מדגם טובה היא קריטית עבור LCM. התהליך מסתמך על תיקון והטלה נאותים של דגימות כדי לשמור על איזון טוב בין מורפולוגיה רקמות ושלמות של RNA. הפרוטוקול המוצג כאן מספק צעדים ממוטבים לתיקון וה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מועצת המחקר האוסטרלית למצוינות בביולוגיה של אנרגיה צמחית (CE140100008) עד JW. M.G.L נתמך על ידי מענק מתחיל של אוניברסיטת לה טרוב. אנו מודים לפלטפורמת הגנומיקה La Trobe על תמיכתם בהנחיתות גבוהות וניתוח נתונים. אנו מודים לפרופסור מת'יו טאקר על ייעוץ מומחה להקמת LCM במעבדה שלנו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה אצטית 100% ACS/R.AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 אטוםZeiss415190-9181-000
תבניות בסיס שקופות 8 X 10Leica3803015
דיאתיל פירוקרבונטSigma-Aldrich40718-25ML
רגישות גבוהה RNA ScreenTape Agilent5067-5579
Low­ פרופיל disp.blades DB80LSLeica14035843489
MembraneSlide 1.0 PENZeiss415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbion (ThermoFisher)AMB17515
סט עיכול DNase I על העמודהSigma-AldrichDNASE70
Ovation RNA-Seq System V2NuGen (מדע משולב)7102-08
פרפין (Surgipath Paraplast)Leica39601006
PicoPureABI (ThermoFisher)KIT0214
RNaseZap RNase DeconservationSolution Ambion (ThermoFisher)AM9780
XyleneAnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC28975.360
Leica מעבד רקמות שולחניLeica BiosystemsTP1020
Leica מודול הטמעת פרפין מחומםLeica BiosystemsEG1150H
Leica Cold PlateLeica BiosystemsEG1150C
Safemate Class 2 ארונות בטיחות ביולוגייםLAF Technologies Pty LtdSafemate 1.5
Leica אוטומטי לחלוטין מיקרוטום סיבוביLeica BiosystemsRM2265עם תוכנת PALMRobo v 4.6
Zeiss PALM MicroBeam LCM מערכתמיסקרוסקופיה
TapeStationAgilentTapeStation 2200
ערכת בידוד RNA של Zeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionRNA SequencingSpatial Gene ExpressionTemporal Gene ExpressionTissue FixationParaffin EmbeddingTissue SectioningRNA ExtractionProfilingBarley Embryo

Related Articles